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Debido al cambio climático, a la agricultura intensiva y al aumento de la población, se está produciendo un incremento en la presión sobre los recursos hídricos, derivando en una escasez cada vez mayor de agua y deteriorando la calidad de esta. Es por ello, que la utilización de aguas residuales tratadas o regeneradas para el riego agrícola está incrementándose a nivel mundial, a la vez que se está convirtiendo en una alternativa con gran potencial para combatir la escasez de agua. Recientemente, la Unión Europea ha publicado una nueva regulación (Regulación 2020/741) en relación con los requisitos mínimos de control y calidad para la reutilización de agua con fines agrícolas. Su principal finalidad, se basa en que las aguas regeneradas sean seguras para el riego agrícola, además de promover la economía circular y asegurar la protección del medio ambiente y de la salud humana. En dicho documento, encontramos los parámetros mínimos de calidad del agua según la categoría de agua regenerada, así como el tipo de cultivo sobre el que se va a emplear. Además, en este reglamento se detallan los requisitos mínimos de control rutinario que deben ser realizados por los operadores de las estaciones regeneradoras de agua y controles de validación de las mismas, con requisitos rigurosos para el control de microorganismos. Sin embargo, las normas estipuladas solo se centran en aspectos microbiológicos sin tener en cuenta contaminantes de preocupación emergente (CECs), como plaguicidas o productos farmacéuticos. En las últimas décadas, los estudios sobre agua medioambiental han llamado la atención debido a la presencia de una variedad de CECs de origen antropogénico, dando clara evidencia de que los procesos convencionales de las plantas de tratamiento de agua residuales no son completamente efectivos para eliminar muchos de estos contaminantes. La mayoría son contaminantes orgánicos que se encuentran en concentraciones trazas de µg/L o ng/L, que pueden causar efectos adversos en los ecosistemas y en la salud humana. Por tanto, el uso de aguas regeneradas para riego agrícola puede introducir estos contaminantes en la cadena alimentaria, originando peligros para la salud humana y para el medio ambiente. Así, esta Tesis Doctoral se centra en el desarrollo y optimización de metodologías analíticas basadas en la cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS/MS) con analizador triple cuadrupolo para la caracterización de plaguicidas y productos farmacéuticos y de cuidado personal tanto en productos de origen vegetal como origen ambiental (suelo y agua de riego). Además, se ha evaluado el potencial de absorción de varios CECs, obteniéndose modelos estadísticos de acumulación para predecir que contaminantes tienen mayor capacidad para ser absorbidos y translocados por la planta y cuales acumularse en el suelo. Por otro lado, se ha desarrollado y validado un método de extracción, basado en el método QuEChERS, con el fin de obtener un método analítico rápido y sensible que permita la determinación de una amplia gama de CECs en muestras de suelo agrícola. Por último, se ha estudiado el impacto a largo plazo del uso de aguas regeneradas para riego agrícola bajo condiciones agronómicas reales. Además, de evaluar el potencial de riesgo sobre la salud humana derivada del consumo de las partes comestibles de plantas regadas con agua regenerada. Las principales aportaciones de esta Tesis Doctoral, que condujeron a la publicación de artículos científicos son: - Desarrollo y validación de un método analítico para la determinación en suelo agrícola de 30 de los contaminantes más detectados en agua regeneradas mediante el uso de un método QuEChERS modificado. - Determinación de aquellos CECs que presentaron una mayor capacidad de absorción por las plantas. - Elaboración de modelos estadísticos de acumulación que permitieron estimar niveles de contaminantes en suelo, así como en las diferentes partes de la planta. - Evaluación del impacto del uso de agua regenerada en cultivos bajo condiciones agrícolas reales a largo plazo., Doctorado en Química Avanzada (RD99/11) (8911)

Despite its robust proteopathic nature, the spatiotemporal signature of disrupted protein modules in sporadic Alzheimer's disease (AD) brains remains poorly understood. This considered oxidative stress contributes to AD progression and early intervention with coenzyme Q10 or its reduced form, ubiquinol, delays the progression of the disease. Using MALDI-MSI and functional bioinformatic analysis, we have developed a protocol to express how deregulated protein modules arise from hippocampus and cortex in the AD mice model 3xTG-AD in an age-dependent manner. This strategy allowed us to identify which modules can be efficiently restored to a non-pathological condition by early intervention with ubiquinol. Indeed, an early deregulation of proteostasis-related protein modules, oxidative stress and metabolism has been observed in the hippocampus of 6-month mice (early AD) and the mirrored in cortical regions of 12-month mice (middle/late AD). This observation has been validated by IHC using mouse and human brain sections, suggesting that these protein modules are also affected in humans. The emergence of disrupted protein modules with AD signature can be prevented by early dietary intervention with ubiquinol in the 3xTG-AD mice model., A pesar de su robusta naturaleza proteopática, la firma espaciotemporal de los módulos de proteínas interrumpidos en los cerebros de la enfermedad de Alzheimer (EA) esporádica sigue siendo poco conocida. Este considerado estrés oxidativo contribuye a la progresión de la EA y la intervención precoz con coenzima Q10 o su forma reducida, el ubiquinol, retrasa la progresión de la enfermedad. Usando MALDI-MSI y análisis bioinformático funcional, hemos desarrollado un protocolo para expresar cómo surgen módulos de proteína desregulados del hipocampo y la corteza en el modelo de ratones AD 3xTG-AD de una manera dependiente de la edad. Esta estrategia nos permitió identificar qué módulos se pueden restaurar de manera eficiente a una condición no patológica mediante una intervención temprana con ubiquinol. De hecho, una desregulación temprana de los módulos proteicos relacionados con la proteostasis, Se ha observado estrés oxidativo y metabolismo en el hipocampo de ratones de 6 meses (EA temprana) y se refleja en regiones corticales de ratones de 12 meses (EA media/tardía). Esta observación ha sido validada por IHC utilizando secciones de cerebro humano y de ratón, lo que sugiere que estos módulos de proteína también se ven afectados en humanos. La aparición de módulos de proteínas interrumpidos con la firma AD puede prevenirse mediante una intervención dietética temprana con ubiquinol en el modelo de ratones 3xTG-AD.

Doctorado en Educación (RD99/11)

[EN] Meat, which is widely consumed in the world, is affected in its quality by many factors dependent and independent of the animal, the breed or the processing conditions, such as preslaughter stress, temperatures, the breed of the animal or the water it drinks). This leads to a high variability in the final quality of the product and it is not possible to predict the final tenderness of the pieces. The aim of this study is to look for biochemical markers that indicate that a meat is defective from the point of view of tenderness, and to achieve this we focused on the protein profile of the samples. To achieve this, different beef samples were analysed at different times after the death of the animal in order to see how its protein profile evolves between slaughter and the second week. Both myofibrillar and sarcoplasmic protein extracts were analysed, with inconclusive results for the latter. SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis techniques were used to separate the different protein fractions and mass spectrometry coupled to LC-MS/MS liquid chromatography together with a bioinformatics analysis with the MASCOT search engine to identify the proteins and/or fragments that could be present in the different samples. All the finalised results are from the myofibrillar protein samples. As results, different fragments of degraded protein due to meat maturation were isolated. The most repeated were from the proteins "Creatine kinase M-type", "Troponin T, fast skeletal muscle" and "MYBPC1 protein". The intact form of "Troponin T, fast skeletal muscle" was also identified, notably before and after undergoing the degradation process. These proteins are good candidates as biochemical markers capable of detecting defective beef at early postmortem times., [ES] En una primera etapa, el estudiante trabajará en la preparación de extractos musculares a partir de muestras de carne pertenecientes a distintas razas de vacuno españolas. Posteriormente, el estudiante aprenderá las técnicas relacionadas con el fraccionamiento/separación del proteoma de vacuno muscular y del plasma/suero sanguíneo, tales como la electroforesis en gel (SDS-PAGE) o el isoelectroenfoque en medio líquido (OFFGEL). El objetivo final será caracterizar y cuantificar aquellas proteínas clave que puedan ser indicadores de la condición de estrés pre-sacrificio de los animales. Para la identificación de las proteínas, el estudiante aprenderá los protocolos básicos de trabajo en Proteómica basados en el análisis de cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS), así como las herramientas bioinformáticas adecuadas para una correcta interpretación de los datos MS/MS generados.

[eng] Chemical exposure to emerging contaminants (ECs) is a major concern nowadays. These ECs have recently become a global environmental threat, and an in-depth characterization of their occurrence and toxic impact is needed. In this context, omic sciences have arisen as powerful tools to shed some light on the biological mechanisms affected by exposure to these chemicals. Particularly, metabolomics and lipidomics can provide a snapshot of what is actually happening at the molecular level, pointing to metabolic pathways affected by the contaminants. New analytical methodologies are required to extract the sought information in more complex biological matrices (from single cells to whole organisms). Hence, a major emphasis has been put on developing multidimensional separations and multiplatform approaches to increase the metabolome coverage. However, these novel approaches bring about massive datasets, and the complexity of the data analysis augments considerably. Therefore, chemometric strategies are a perfect match to get through this bottleneck and provide useful tools to obtain the most from the data collected. In this PhD Thesis, the focus was set on developing analytical protocols, especially using two-dimensional liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC×LC-MS), as well as chemometric data analysis strategies applicable to environmental metabolomic studies. On the one hand, LC×LC-MS methods have been developed for both untargeted and targeted analyses. Active modulation strategies have been also successfully implemented in the multidimensional chromatographic separation of lipids. On the other hand, the Regions Of Interest (ROI) approach for compression and filtering has been validated for LC×LC-MS analyses. Regarding chemometric resolution methods (i.e., which allow obtaining quantitative and qualitative information from the sample constituents), and due to deviations from an ideal trilinear behavior presented by LC×LC datasets, the use of the Multivariate Curve Resolution Alternating Least Squares (MCR-ALS) method has been preferred. Different quantification strategies have been tested based on the Regions Of Interest Multivariate Curve Resolution (ROIMCR) approach. In addition, several multivariate statistical methods based on the analysis of variance (ANOVA) have been compared for metabolomic studies. As a result, a combination of ANOVA-simultaneous component analysis (ASCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) has been selected for statistical analysis and variable (metabolite) selection, respectively. All in all, different metabolomic workflows have been validated for the assessment of emerging contaminants in model biosystems., [spa] Actualmente, las ciencias ómicas han aparecido como herramientas muy útiles para arrojar luz sobre los mecanismos biológicos y rutas metabólicas que se ven afectados debido a las exposiciones a contaminantes emergentes. En concreto, la metabolómica y la lipidómica proporcionan información de lo que está ocurriendo a nivel molecular. Por tanto, se requieren nuevas metodologías que sean capaces de extraer dicha información en matrices cada vez más complejas (desde una única célula a un organismo entero). Esta Tesis doctoral se centra principalmente en el desarrollo de protocolos analíticos basados en el uso de la cromatografía líquida bidimensional acoplada a espectrometría de masas (LC ×LC-MS), así como en el desarrollo de estrategias quimiométricas que permitan su uso en aplicaciones medioambientales. Por un lado, se han optimizado métodos LC×LC-MS para análisis dirigidos y no dirigidos, implementando con éxito estrategias de modulación activa (en el caso de análisis de lípidos). Por otro lado, se ha validado la estrategia de regiones de interés (ROI) para comprimir y filtrar los datos obtenidos con LC×LC-MS. Asimismo, se ha preferido el uso de métodos de resolución multivariante de curvas mediante mínimos cuadrados alternados (MCR-ALS) para la resolución cualitativa y cuantitativa de muestras complejas en el caso de datos de LC×LC, debido a las deviaciones de la trilinealidad encontradas en dichos datos. Por otra parte, se han comparado diferentes estrategias cuantitativas aplicables a datos en LC×LC-MS, todas ellas basadas en el uso del método combinado de regiones de interés y resolución multivariante de curvas (ROIMCR). También se han comparado diversos métodos estadísticos multivariante basados en el análisis de varianza (ANOVA) y su aplicabilidad en estudios metabolómicos. Finalmente, se ha elegido una combinación de análisis estadístico efectuado con ANOVA-análisis de componentes simultáneos (ASCA) y un método de clasificación, análisis discriminante mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para seleccionar las variables (metabolitos) más relevantes. En resumen, se han validado diferentes flujos de trabajo para el estudio metabolómico del efecto de contaminantes emergentes en organismos modelo ambientales.

Tesis doctoral con mención internacional, El estudio de proteínas implicadas en procesos biológicos es un campo de gran interés en bioquímica ya que cambios en los niveles de expresión o localización de ciertas biomoléculas puede ayudar a entender el origen y desarrollo de enfermedades. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) caracterizada por la pérdida de visión progresiva debido al deterioro del tejido de la retina, es la causa principal de ceguera en los mayores de 65 años. En este contexto, hay varias proteínas que juegan un papel importante de cara a la protección de la retina y que con el desarrollo de la enfermedad se ven alteradas. Sin embargo, en la actualidad, el estudio de estas biomoléculas está limitado por su baja concentración en las muestras biológicas (suero, tejidos y células) y su elevada variabilidad biológica (célula a célula). En esta línea, las técnicas de análisis tradicionalmente empleadas (i.e. inmunohistoquímica o ensayos ELISA), presentan limitaciones y se crea la necesidad de nuevas estrategias analíticas más sensibles y que permitan la cuantificación absoluta. Por ello, la presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de estrategias analíticas de cuantificación de proteínas relacionadas con la DMAE en diferentes tipos de muestras, empleando nanoclústeres metálicos como etiquetas de los anticuerpos específicos de las biomoléculas y detección mediante espectrometría de masas elemental, ICP-MS.

Tesis Doctoral inédita cotutelada por la Universidade do Porto (Portugal) y la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química. Fecha de Lectura: 26-07-2022, Drug metabolism is a pivotal determining factor for the changes in physiological drug concentration and can determine or modify its toxicological or pharmacological pathway (Iyanagi, T., Int. Rev. Cytol., 2007, 260). Understanding of processes, involving a drug in a living organism, is therefore crucial to study and analyse the action of the drug or its metabolites, as reported by Caldwell, J. et al, Toxicol. Pathol., 1995, vol. 23, no. 2. Drug metabolites are typically identified using various techniques, but lately, Ion-Mobility Mass Spectrometry (IM-MS) has become a widely popular tool for small molecule (which are drug metabolites) structural identification due to its high efficiency and a low amount requirement for samples. A combination of this technique along with a computational approach has proved to deliver reliable identification predictions of investigated compounds by comparing experimental and calculated collisional cross sections (CCS) of structures. However, even though a corresponding experimental field has made some valuable developments over the last couple of years, its theoretical counterpart has seen a rather slow improvement. Recently, Reading, E. et al, Anal. Chem., 2016, 88 (4), have developed a computational protocol for collisional cross section calculations. The first part of this work addresses the issue of efficiency of the proposed protocol along with its large-scale applicability. Additionally, special attention has been paid to the reproducibility of the published results and also to the possible ways of improving the agreement within different sets of theoretical results as well as between newly calculated and experimental values. The second part of this manuscript focuses on studying fragmentation mechanisms that occur during Mass Spectrometry (MS) measurements. Electro Spray Ionisation (ESI) along with Tandem MS and Collision Induced Dissociation (CID) build up a powerful experimental approach, able to deliver a deeper understanding of a collision process and its products (Molina, E. R. et al, J. Mass Spectrom., 2015, 50). It is feasible due to extensive fragmentation that takes place in activated ions (metabolites). A corresponding computational approach developed by Hase, W. L. et al, Quantum Chem. Progr. Exch. Bull., 1996, 16, and Hase, W. L. et al, J. Phys. Chem., 1996, 100.20, is used to run Collision Dynamics Simulations (CDS) to obtain reactive trajectories. These trajectories are further utilised for fragmentation analysis that gives insights about structural information of the fragments and possible reaction pathways and also allows to build a theoretical MS spectrum

Tesis doctoral con mención internacional, La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y el glaucoma constituyen las enfermedades oculares neurodegenerativas más frecuentes relacionadas con el sistema visual, pudiendo acarrear la posibilidad de desarrollar ceguera irreversible con el tiempo. Se requiere, por tanto, la aplicación de enfoques analíticos avanzados tanto para la identificación de biomarcadores (proteínas, metabolitos, elementos esenciales) que permitan una detección temprana de estas patologías. Es importante resaltar que, en el caso del sistema visual, el análisis de muestras con bajos niveles de concentración de metales y metaloproteínas, así como el volumen limitado de las mismas (lágrima, humor acuso, cultivos celulares) o su elevada complejidad (suero), hace necesario el desarrollo de metodologías analíticas innovadoras que sean rápidas, sensibles, con bajos límites de detección y con capacidad de análisis multiplexado. En este contexto, las técnicas basadas en espectrometría de masas tienen una elevada aplicabilidad durante el desarrollo de metodologías analíticas cuantitativas. Así, el objetivo de la Tesis Doctoral ha sido el desarrollo y la aplicación de nuevas metodologías basadas en espectrometría de masas elemental para el estudio de elementos esenciales y (metalo)-proteínas implicados en enfermedades oculares neurodegenerativas asociadas a la edad en distintos tipos de muestras biológicas. En el primer capítulo, y con el fin de estudiar posibles alteraciones

5 páginas.- 2 figuras.- 5 referencias.- Enlace al artículo https://revistas.rcaap.pt/rca/article/view/28639/21412, La repelencia al agua del suelo (RAS) se atribuye a la acumulación de compuestos hidrofóbicos (lípidos), pero su extracción no siempre elimina la RAS, lo que sugiere que componentes macromoleculares no extraíbles también pueden estar relacionados con una RAS. Se han estudiado suelos quemados (B) y control (UB) del Parque Nacional de Doñana (Huelva, España) bajo dos tipos de vegetación (alcornoque y brezo) y fracciones de suelo: gruesa (1–2 mm) y fina (, Trabajo parcialmente financiado por los proyectos EROFIRE (PCIF/RPG/0079/2018 y MICROCENO (PTDC/CTA-AMB/ 0608/2020) de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) y MarkFire (PAI-DI2020, PY20_01073) de la Junta de Andalucía con fondos EU FEDER e INTERCARBON (2017/19) del Espacio Natural de Doñana y la EBD-CSIC. Ade-más, NTJM y AZM agradecen los contratos CEECs (2021/00711/CEECIND y CEECIND/01147/2017, res-pectivamente, de la FCT) y el contrato Ramón y Cajal (ref. RYC2019-026885-I) del Ministerio de Ciencia e Innovación.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] Esta Tesis Doctoral está enfocada al desarrollo de métodos analíticos rápidos basados en espectrometría de masas (MS, Mass Spectrometry) con ionización por electrospray (ESI, ElectroSpray Ionization) para la determinación de compuestos de interés clínico en matrices biológicas. En los últimos años ha habido un gran interés en el desarrollo de este tipo de metodologías que permiten la determinación simultánea de un gran número de compuestos en tiempos de análisis cortos. Estas estrategias rápidas pueden utilizarse en el ámbito clínico como etapa de cribado para obtener información clínica relevante mediante el análisis de diversos biomarcadores presentes en muestras biológicas en un corto periodo de tiempo. Posteriormente, solo para aquellos casos en que se presenten compuestos con valores anómalos, se requeriría una etapa de confirmación con otras metodologías de mayor complejidad, que impliquen mayores tiempos de análisis. Debido a la necesidad de obtener resultados fiables, la espectrometría de masas es la técnica más adecuada, por su elevada sensibilidad, selectividad y capacidad de identificación. En esta Tesis Doctoral se utilizan dos analizadores de masas diferentes: un analizador de triple cuadrupolo (QqQ, triple quadrupole) y un analizador de masas Orbitrap. Esta memoria se ha estructurado en dos partes diferencias en función de la metodología rápida desarrollada. En la primera parte de la Tesis se propone una estrategia basada en la introducción directa de la muestra en el espectrómetro de masas, como etapa de cribado, con la posibilidad de llevar a cabo, en la misma configuración instrumental, el análisis confirmatorio utilizando una técnica de separación. Para ello, se utiliza un cromatógrafo de líquidos acoplado a un espectrómetro de masas donde se mantiene la columna cromatográfica en el sistema. La utilización de una fase móvil con un alto poder de elución elimina la capacidad separativa de la columna, permitiendo la introducción directa de la muestra en el equipo de MS. Con un cambio en la composición de la fase móvil es posible la separación cromatográfica de los compuestos. En la segunda parte de la Tesis se proponen diversas metodologías basadas en el acoplamiento de precolumnas de protección (gC, guard column) a un espectrómetro de masas. La inclusión de estas precolumnas permite solucionar problemas de sensibilidad y morfología de pico deficiente que se observan para algunos compuestos con las metodologías no separativas. Estas mejoras se consiguen sin un incremento significativo del tiempo de análisis, que se mantienen entre 1 y 3 min. Para confirmar los resultados obtenidos con los métodos rápidos desarrollados, en esta Tesis también se han propuesto métodos basados en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) adecuados para cada grupo de compuestos. Las metodologías desarrolladas han sido aplicadas a la determinación y cuantificación de compuestos de interés clínico, como son las poliaminas y los aminoácidos, en muestras de saliva y orina. Estos compuestos están implicados en una gran diversidad de procesos biológicos y se ha asociado la alteración de su concentración en distintas muestras biológicas con diferentes patologías. Considerando su importancia clínica, es de gran interés el desarrollo de métodos que permitan su determinación fiable en un periodo corto de tiempo. Estos métodos podrían utilizarse para el diagnóstico temprano de diferentes enfermedades. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es la puesta a punto de metodologías analíticas rápidas basadas en espectrometría de masas con una fuente de ionización por electrospray orientadas a la determinación y cuantificación de compuestos de interés clínico en muestras biológicas no invasivas. La espectrometría de masas permite simplificar de forma significativa los procedimientos analíticos debido a la enorme cantidad de datos que proporciona, consiguiendo en muchos casos la obtención de información cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa para resolver el problema analítico planteado. La hipótesis de partida es la viabilidad de utilizar la introducción directa de la muestra a un espectrómetro de masas con una fuente de ionización por electrospray en la modalidad análisis por inyección en flujo (FIA-MS, Flow Injection Analysis-Mass Spectrometry), o bien utilizando precolumnas de protección como etapa de limpieza y fraccionamiento previo a la detección por espectrometría de masas para la determinación de forma rápida de poliaminas y aminoácidos en muestras de orina y saliva.

El presente trabajo permitió el análisis de chile picante (Capsicum annuum) y de pimienta negra (Piper nigrum) cultivadas en Costa Rica, a través de diferentes rutas enfocadas en dos tipos de metabolitos secundarios, la primera dirigida a amidas características en estos frutos, los cuales son sustancias de menor polaridad. En la segunda aproximación, el análisis se enfocó en compuestos polifenólicos altamente polares. En C. annuum, el análisis por UHPLC-HRMS permitió la identificación de 12 compuestos, de los cuales se lograron cuantificar las 3 mayoritarias mediante UHPLC-DAD, destacando la capsaicina y la dihidrocapsaicina como mayoritarias. Adicionalmente, con HPLC semipreparativo se logró el aislamiento de dihidrocapsaicina con alta pureza, la cual es de interés como neuroprotector. Un análisis similar en P. nigrum reveló la presencia de 31 amidas, de las cuales se cuantificaron 15 por medio de UHPLC-DAD. Entre estas, la amida mayoritaria, piperina, se aisló mediante cromatografía de columna para su posterior utilización en la producción de materiales orgánicos multicomponentes. Por otro lado, se utilizó HPLC semipreparativo para aislar guineensina, con estudios en el sistema endocanabinoide, con un rendimiento superior al reportado en la literatura. Complementariamente, se utilizó HPTLC en P. nigrum, con el fin de verificar la factibilidad de utilizar esta técnica en la cuantificación de piperina como evaluador de la conformidad en productos comerciales, demostrándose un perfil de composición similar al de las muestras obtenidas en otros países. Para los extractos polares de las muestras, el análisis por UHPLC-HRMS permitió identificar 14 compuestos polifenólicos en C. annuum y también 14 diferentes compuestos en P. nigrum. Estos extractos fueron además cuantificados por el método Folin-Ciocalteu, con resultados dentro de lo reportado en la literatura para ambas muestras. La evaluación de su respuesta antioxidante se realizó con las técnicas DPPH y ORAC, obteniendo resultados para C. annuum en el rango de la literatura, pero con valores inferiores a los reportados en el caso de P. nigrum. Los análisis realizados permitieron una caracterización cualitativa y cuantitativa detallada de las muestras de C. annuum y P. nigrum de Costa Rica, lo que constituye el primer estudio en Centroamérica con este nivel de profundidad para dichas plantas. UCR::Vicerrectoría de Investigación::Sistema de Estudios de Posgrado::Ciencias Básicas::Maestría Académica en Química

El síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) es un trastorno fatal raro caracterizado por envejecimiento prematuro y muerte a una mediana de edad de 14,5 años. La causa más común de HGPS (que afecta alrededor del 90% de los pacientes) es una sustitución heterocigótica sinónima de base única de novo (c.1824C>T; p.G608G) en el gen LMNA que resulta en la acumulación de progerina, una forma aberrante de lamina A que, a diferencia de la lámina A madura, permanece permanentemente farnesilada. La proporción de progerina a lámina madura A se correlaciona con la gravedad de la enfermedad en pacientes con HGPS y se puede utilizar para evaluar la eficacia de terapias dirigidas a disminuir el empalme aberrante o la farnesilación de progerina. Recientemente mostramos que el contenido endógeno de lámina A y progerina se puede medir mediante espectrometría de masas (MS), siempre que una alternativa a los métodos inmunológicos, que carecen de la necesaria especificidad y cuantificación precisión. Aquí presentamos el primer método no inmunológico que cuantifica de forma fiable los niveles de lamina A de tipo salvaje y progerina farnesilada en células de pacientes con HGPS Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) is a rare fatal disorder characterized by premature aging and death at a median age of 14.5 years. The most common cause of HGPS (affecting circa 90% of patients) is a de novo heterozygous synonymous single-base substitution (c.1824C>T; p.G608G) in the LMNA gene that results in the accumulation of progerin, an aberrant form of lamin A that, unlike mature lamin A, remains permanently farnesylated. The ratio of progerin to mature laminA correlates with disease severity in HGPS patients, and can be used to assess the effectiveness of therapies aimed at lessening aberrant splicing or progerin farnesylation. We recently showed that the endogenous content of lamin A and progerin can be measured by mass spectrometry (MS), providing an alternative to immunological methods, which lack the necessary specificity and quantitative accuracy. Here, we present the first non-immunological method that reliably quantifies the levels of wild-type lamin A and farnesylated progerin in cells from HGPS patients. This method, which is based on a targeted MS approach and the use of isotope-labeled internal standards, could be applied in ongoing clinical trials evaluating the efficacy of drugs that inhibit progerin farnesylation Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (PGC2018-097019-B-I00 and PID2021-122348NB-I00) Instituto de Salud Carlos III (PT17/0019/0003- ISCIII-SGEFI/ERDF, ProteoRed) Progeria Research Foundation, Asociación Progeria Alexandra Peraut, and “la Caixa” Banking Foundation (HR17-00247, HR22-00253) CNIC is supported by the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN), and the Pro CNIC Foundation and is a Severo Ochoa Center of Excellence (grant CEX2020-001041-S funded by MICIN/AEI/10.13039/501100011033) 6.208 JCR (2021) Q1, 69/297 Biochemistry & Molecular Biology 1.176 SJR (2021) Q1, 128/729 Computer Science Applications No data IDR 2021 UEM

The studies conducted in this thesis focus on the development and optimization of analytical methodologies for the determination of organic compounds of agronomic, environmental, and cosmetic interest. These analytes include fungicides, volatile, semi-volatile and phenolic compounds present in honey, as well as pharmaceuticals and personal care products, including fragrances, UV filters, plasticizers, preservatives and antibiotics. Miniaturized extraction techniques followed by chromatography coupled with mass spectrometry, tandem mass spectrometry and high-resolution mass spectrometry, were used and extensively applied to a wide variety of real samples. In addition, innovative strategies based on photodegradation and advanced oxidation processes, have been evaluated for the removal of antibiotics from water. 2023-07-22

ilustraciones, fotografías a color El uso de organismos biocontroladores como estrategia que permita disminuir el uso de agroquímicos en los cultivos, es una práctica que está en aumento. Particularmente se hace relevante el desarrollo de productos de origen biológico que permitan el control de patógenos de arroz de manera específica y eficaz disminuyendo las tasas de contaminación y la reincidencia de enfermedades por la aparición de patógenos resistentes. Sin embargo, para llegar al desarrollo de un producto de origen biológico que tenga las características necesarias para ser efectivo en el control de enfermados fitosanitarias, es necesario tener un conocimiento amplio del organismo productor de los principios activos que harán parte de dicho producto. Bajo este contexto, el estudio de la cepa Bacillus velezensis IBUN 2755 se hace relevante ya que ha demostrado tener una fuerte actividad antibacteriana y antifúngica in vitro, contra tres patógenos que han sido reportados como los causantes de grandes pérdidas en cultivos de arroz y por tanto esta cepa se perfila como un potencial microorganismo biocontrolador. El estudio extensivo de la cepa incluye la caracterización de los posibles metabolitos secundarios bioactivos que produzca la cepa, que estén involucrados de manera directa en la actividad antibacterial y antifúngica conocida, asi como el efecto que tienen diferentes factores bióticos y abióticos sobre su producción. Este es precisamente el objetivo principal de este trabajo de investigación. El primer paso para llegar a este objetivo fue describir el efecto que tiene el crecimiento de la cepa IBUN 2755 en diferentes medios de cultivo, sobre la actividad antagónica de la cepa contra los patógenos Burkholderia. glumae, Rhizoctonia solani y Gaeumannomyces graminis. Para esto, se incubó la cepa IBUN 2755 en los medios de cultivo Landy, MES, MES modificado y MOLP P.E y MOLP P.U, que se caracterizan por tener condiciones nutricionales diferenciales. Se recuperaron los sobrenadantes libres de células de cada medio posterior al crecimiento de la cepa y se evaluó la actividad antagónica de los mismos sobre los tres patógenos antes mencionados. Se pudo concluir, que la composición nutricional de los medios tiene un efecto directo sobre la actividad antagónica de la cepa IBUN 2755, siendo el medio MES el que presentó sobrenadantes menos activos contra los tres patógenos y el medio MOLP P.U el que rindió los sobrenadantes más activos. Posteriormente con el fin de evaluar los metabolitos bioactivos que se estaban expresando en estos dos medios de cultivo que mostraron tener una actividad antagónica diferencial (MOLP.U y MES), se decidió hacer la extracción de estos usando dos metodologías de extracción: la partición liquido - liquido usando acetato de etilo y butanol y la precipitación ácida. Asi mismo estos procesos de extracción se realizaron sobre dos volúmenes diferentes de cada medio: 25 y 200 ml. De esta forma, al finalizar esta sección se tendrían tres parámetros a evaluar: primero, el efecto de la composición nutricional del medio de cultivo sobre la producción de metabolitos secundarios, segundo el efecto de la metodología de extracción sobre los metabolitos bioactivos recuperados de cada medio y tercero el efecto del volumen del medio de cultivo sobre la producción de metabolitos secundarios bioactivos por parte de la cepa IBUN 2755. La evaluación de la actividad biológica de los extractos de acetato de etilo, butanol y precipitación ácida obtenidos a partir de los sobrenadantes recuperados de los medios MOLP P.U y MES de 200 y 25 ml, sobre los tres patógenos, mostró que el extracto por precipitación acida del medio MOLP P.U de 25 ml, era el que demostraba una actividad antagónica consistente contra los tres patógenos. Asi mismo, se caracterizó el perfil metabolómico de cada uno estos extractos usando LC-MS/MS la construcción de redes moleculares y la derreplicación de compuestos, con esto se pudo establecer que la expresión de metabolitos secundarios por parte de la cepa IBUN 2755, era mayor en los medios de 25ml para el caso del medio MOLP P.U, además se evidencio que los extractos por precipitación acida y de acetato de etilo eran los más enriquecidos en compuestos con respecto a los extractos butanólicos y finalmente, se logró establecer que si bien la cepa IBUN 2755, es capaz de producir las mismas familias de compuestos, en los dos medios de cultivo (MOLP P.U y MES) esto no implica que se produzcan los mismos compuestos y en la misma proporción. Así mismo se evidencio la expresión de moléculas de interés como surfactinas, fengicinas e Iturinas. Una vez establecido el efecto de diferentes factores sobre la producción de metabolitos secundarios por parte de la cepa IBUN 2755, el siguiente paso fue identificar los compuestos responsables de la actividad antagónica de la cepa contra los patógenos B. glumae, R. solani y G. graminis, para esto se fracciono el extracto por precipitación con ácido del medio MOLP P.U y se evaluó la actividad de cada una de las fracciones, las fracciones activas fueron evaluadas por RMN y LC-MS/MS. Las fracciones F4 y F5 mostraron ser las más activas contra los tres patógenos y se logró determinar que los compuestos activos mayoritarios de estas fracciones eran la Surfactina C14 ß-OH ácido graso-MeO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu y la surfactina C14 ß-OH ácido graso-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu. Finalmente, se decidió caracterizar de manera descriptiva haciendo uso de redes moleculares, el perfil metabolómico de la cepa IBUN 2755 bajo condiciones de cocoltivo con cada uno de los patógenos evaluados en este proyecto, con el fin de evaluar el efecto del crecimiento de la cepa en conjunto con otro microorganismo, sobre la producción de metabolitos secundarios potencialmente bioactivos. Este análisis metabolómico incluyo datos de LC-MS/MS tanto de los monocultivos de cada microorganismo, como de los cocultivos entre la cepa biocontroladora y cada una de los patógenos. Los resultados mostraron que en efecto cuando la cepa se encuentra bajo condiciones de estrés, como lo es enfrentarse a otro microorganismo, la expresión de metabolitos secundarios bioactivos se eleva drásticamente y se difunden hacia el área de crecimiento del patógeno, esto es especialmente cierto para los cocultivos de la cepa IBUN 2755 - B. glumae y IBUN 2755 - G. graminis. (Texto tomado de la fuente) The use of biocontrol organisms as a strategy to reduce the use of agrochemicals in crops is a practice that is on the rise. Particularly relevant is the development of products of biological origin that allow the control of rice pathogens in a specific and effective way, reducing contamination rates and the recurrence of diseases due to the appearance of resistant pathogens. However, to develop a product of biological origin that has the necessary characteristics to be effective in controlling phytosanitary diseases, it is necessary to have extensive knowledge of the organism that produces the active ingredients that will be part of said product. In this context, the study of the Bacillus velezensis IBUN 2755 strain becomes relevant since it has been shown to have a strong antibacterial and antifungal activity in vitro, against three pathogens that have been reported as the cause of great losses in rice crops and therefore this strain is outlined as a potential biocontrol microorganism The extensive study of the strain includes the characterization of the possible bioactive secondary metabolites produced by the strain, which are directly involved in the known antibacterial and antifungal activity, as well as the effect that different biotic and abiotic factors have on its production. This is precisely the main objective of this research work. The first step to reaching this goal was to describe the effect of the growth of the IBUN 2755 strain in different culture media on the antagonistic activity of the strain against the pathogens B. glumae, R. solani and G. graminis. For this, the IBUN 2755 strain was incubated in Landy, MES, modified MES and MOLP P.E, and MOLP P.U culture media, which are characterized by having differential nutritional conditions. Cell-free supernatants were recovered from each medium after the growth of the strain and their antagonistic activity on the three aforementioned pathogens was evaluated. It was concluded that the nutritional composition of the media has a direct effect on the antagonistic activity of the IBUN 2755 strain, with the MES medium being the one that presented less active supernatants against the three pathogens and the MOLP P.U medium the one that yielded the most active supernatants. assets. Subsequently, to evaluate the bioactive metabolites that were being expressed in these two culture media that showed a differential antagonistic activity (MOLP.U and MES), it was decided to extract them using two extraction methodologies: liquid partition - liquid using ethyl acetate and butanol and acid precipitation. Likewise, these extraction processes were carried out on two different volumes of each medium: 25 and 200 ml. In this way, at the end of this section there would be three parameters to evaluate: first, the effect of the nutritional composition of the culture medium on the expression of secondary metabolites, second, the effect of the extraction methodology on the bioactive metabolites recovered from each medium and third, the effect of the volume of the culture medium on the production of bioactive secondary metabolites by the IBUN 2755 strain The evaluation of the biological activity of the extracts of ethyl acetate, butanol, and acid precipitation obtained from the supernatants recovered from the MOLP P.U and MES media of 200 and 25 ml, on the three pathogens, showed that the extract by acid precipitation of the 25ml MOLP P.U medium was the one that demonstrated consistent antagonistic activity against the three pathogens. Likewise, the metabolic profile of each of these extracts was characterized using LC-MS/MS, the construction of molecular networks, and the dereplication of compounds, with this it was possible to establish that the expression of secondary metabolites by the IBUN 2755 strain was higher in the 25ml media for the case of the MOLP P.U medium, it was also evidenced that the extracts by acid precipitation and ethyl acetate were the most enriched in compounds concerning the butanol extracts and finally, it was possible to establish that although the IBUN 2755 strain, is capable of expressing the same families of compounds, in the two culture media (MOLP P.U and MES) this does not imply that the same compounds are expressed and in the same proportion. Likewise, the expression of molecules of interest such as surfactins, fengycins and Iturins was evidenced. Once the effect of different factors on the production of secondary etabolites by the IBUN 2755 strain had been established, the next step was to identify the compounds responsible for the antagonistic activity of the strain against the pathogens B. glumae, R. solani and G. graminis, for this, the extract was fractionated by acid precipitation of the MOLP P.U medium and the activity of each of the fractions was evaluated, the active fractions were evaluated by NMR and LC-MS/MS. Fractions F4 and F5 showed to be the most active against the three pathogens and it was possible to determine that the main active compounds of these fractions were Surfactin C14 ß-OH fatty acid-MeO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu- Leu and surfactin C14 ß-OH fatty acid-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu. Finally, it was decided to characterize descriptively, using molecular networks, the metabolic profile of the IBUN 2755 strain under co-culture conditions with each of the pathogens evaluated in this project, to evaluate the effect of the growth of the strain on together with another microorganism, on the expression of potentially bioactive secondary metabolites. This metabolomic analysis included LC-MS/MS data from both the monocultures of each microorganism and the co-cultures between the biocontrol strain and each of the pathogens. The results showed that, in effect, when the strain is under stress conditions, such as facing another microorganism, the expression of bioactive secondary metabolites rises drastically and diffuses towards the area of growth of the pathogen, this is especially true for microorganisms. cocultures of strain IBUN 2755 - B. glumae and IBUN 2755 - G. graminis. Maestría Magíster en Ciencias - Microbiología Metabolomica