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1. We have previously demonstrated that nitric oxide (NO) triggers CD34⁺-derived megakaryocyte apoptosis. We here show that prostacyclin (PGI₂) inhibits PAPA/NO-induced megakaryocyte death detected by fluorescent microscopy and flow cytometry. 2. The cAMP-specific phosphodiesterase inhibitor, Ro 20-1724, and the permeable analog dibutyryl-cAMP also delayed apoptosis. PGI₂ effect was fully prevented when adenylyl cyclase activity was suppressed by SQ 22536, and partially reversed by the permeable protein kinase A inhibitor PKI 14-22 amide. ELISA showed that while both PGI₂ and NO alone or synergistically raised cAMP, only NO was able to increase intracellular cGMP levels. 3. Treatment of megakaryocytes with PGI₂ abolished both basal and NO-raised cGMP levels. Addition of 8-pCPT-cGMP or activation of soluble guanylyl cyclase by BAY 41-2272 induced cell death in a concentration-dependent manner, and ODQ, an inhibitor of guanylyl cyclase, prevented both PAPA/NO- or BAY 41-2272-induced apoptosis. Specific cGMP phosphodiesterase inhibition by Zaprinast or suppression of adenylyl cyclase by SQ 22536 enhanced the PAPA/NO proapoptotic effect. 4. PGI₂ completely inhibited NO-mediated generation and the increased activity of the cleaved form of caspase-3. 5. In conclusion, our results demonstrate that contrary to their well-known direct and synergistic inhibitory effects on platelets, PGI₂ and NO regulate opposite megakaryocyte survival responses through a delicate balance between intracellular cyclic nucleotide levels and caspase-3 activity control., Facultad de Ciencias Exactas, Instituto de Biotecnologia y Biologia Molecular

Objetivo general El propósito general de este trabajo es: 1. Generar herramientas moleculares que sean útiles contra la leptospirosis, ya sea para su diagnóstico, prevención o un mejor conocimiento de su patogénesis. 2. Estudiar mecanismos patogénicos involucrados en la leptospirosis. Objetivos específicos 1. Clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes. 2. Producción de antisuero contra las proteínas recombinantes. 3. Análisis de reactividad entre suero de pacientes y las proteínas recombinantes. 4. Caracterización de actividades biológicas de las proteínas recombinantes incluyendo la capacidad de inducir activación endotelial y de inhibir la apoptosis de polimorfonucleares. 5. Estudiar el papel de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en la leptospirosis., Facultad de Ciencias Exactas

En este trabajo se estudiaron los astrocitos proliferativos en dos modelos distintos de lesión del sistema nervioso central: la lesión traumática de la corteza cerebral y la isquemia como resultado de la oclusión de la arteria cerebral media. Los astrocitos proliferativos se encuentran ubicados principalmente en posiciones adyacentes a los vasos sanguíneos cerebrales. Con el objetivo de elucidar el rol de esta subpoblación astrocitaria mediante la manipulación genética de ratones, se crearon modelos para alterar la respuesta astrocitaria proliferativa y se estudió el comportamiento de células gliales e infiltrados inflamatorios en la corteza cerebral lesionada. Los resultados muestran que una disminución en la proliferación de los astrocitos resulta en un aumento del número de monocitos infiltrados mientras que un aumento de la proliferación astrocitaria reduce su número. Se estudió también la evolución de la lesión en ratones deficientes en CCR2, un receptor de quimioquinas involucrado en la extravasación de los monocitos. En este modelo se investigó la respuesta glial en ausencia de las señales generadas por monocitos infiltrados y se encontró un aumento de la proliferación de la macroglia en estas condiciones. Estos resultados muestran una regulación inversa cruzada entre astrocitos y monocitos. Se encontró, además, que la disminución del número de monocitos infiltrados tiene consecuencias positivas durante la cicatrización glial resultando en menor deposición de matriz extracelular, un incremento en el área ocupada por neuronas y una disminución del área ocupada por GFAP. Estos resultados sientan bases para un nuevo enfoque terapéutico en medicina regenerativa en el que se module la proliferación glial y la infiltración de monocitos para lograr una mejor cicatrización del tejido nervioso lesionado., Facultad de Ciencias Exactas

Los objetivos iniciales de este trabajo de tesis consistieron en la extracción de los polisacáridos de la feofita Dictyota dichotoma, el fraccionamiento y la elucidación estructural de los polisacáridos purificados, y la evaluación de sus actividades antivirales contra los virus CVB3 y HHV1. El primer polisacárido extraído fue el fucoidano. El alga seca y molida se extrajo con etanol a temperatura ambiente y a 70 °C; seguidamente se extrajo con HCl diluido a temperatura ambiente y a 70 °C, por nueve veces consecutivamente. Sobre el residuo se extrajo el alginato con Na2CO3 al 3% a 50 °C. Los polisacáridos provenientes de la extracción con HCl se fraccionaron a través de la precipitación con Cetrimide y posterior redisolución con concentraciones crecientes de 0,5, 1, 1,5, 2, 4 y en algunos casos de 5 M de NaCl. El estudio estructural se basó en la metilación de los polisacáridos fraccionados y en la espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional, particularmente HSQC. Además, se realizaron análisis de las fracciones purificadas sobre los virus de CVB3 y HHV1. El fucoidano extraído a temperatura ambiente (EAR) mostró características de un polisacárido heterodisperso con respecto a la composición de monosacáridos, siendo la fucosa el principal monosacárido (36%), seguido de galactosa (23%), y proporciones más chicas de xilosa y manosa (≤ 18%). Además, dicho extracto mostró altas proporciones de hidratos de carbono (48%), ácidos urónicos (21%), medianas proporciones de grupos sulfato (15%) y un bajo peso molecular (6,5 KDa). Los extractos obtenidos a mayor temperatura también mostraron heterodispersión con respecto a la composición de monosacáridos, observando que conforme incrementaba la secuencia extractiva la cantidad de fucosa y galactosa disminuían, mientras que la cantidad de xilosa y manosa se incrementaban. Los análisis generales nos mostraron en todos los extractos altas proporciones de hidratos de carbono excepto en EAH9. Además, la cantidad de proteínas solubles y peso molecular y grupos sulfato disminuyeron, mientras que los ácidos urónicos incrementaban conforme se incrementaba la secuencia extractiva. El alginato extraído exhibió una preponderancia del ácido manurónico por sobre el ácido gulurónico. Además, los análisis mostraron que parecen triadas de dihos ácidos urónicos. El fraccionamiento con Cetrimide mostró que EAR y EAH1 tienen características de un típico galactofucano sulfatado, con cantidades muy pequeñas de otras estructuras. Conforme el fraccionamiento continúaba, a bajas redisoluciones, la cantidad de fucosa disminuía y la xilosa, manosa y ácidos urónicos se incrementaban. A medida que el fraccionamiento continúó esta tendencia predominó, la fucosa dejó de ser el monosacárido principal en la mayoría de las subfracciones en los siguientes extractos, mientras, que los manosa, xilosa y ácidos urónicos se incrementaron. El análisis estructural de las fracciones purificadas mostraron un core basado en residuos de →2)-Man-(1→ con sustituciones en O-3 o en O-6 y →6)-Gal-(1→, sulfatada en O-3. Además, se observó que los residuos de fucosa se encontraron enlazados en proporciones variables en C-2, C-3 y C-4, y en buena medida terminales, así como altas proporciones de ramificaciones de β-D-xilosa. La acción antiviral contra el virus HHV1 en las diferentes fracciones tanto a temperatura ambiente como a 70 °C, mostró que la fracciones -0,5, con características de uronofucoidanos, presentaron la más alta actividad antiviral, seguida de las fracciones EAR-2 y EAR-4. Por otro lado, a pesar que la actividad de las fracciones obtenidas a temperatura poseían menor actividad antiviral, las fracciones EAH2-0,5, EAH4-0,5 y EAH9-0 presentaron actividades moderadas. Con respecto al virus CVB3, los extractos de la feofita D. dichotoma mostraron actividades moderadas frente este virus, siendo las fracciones EAR-1,5, EAR-4 y EAH1-4, las que presentaron la mejor actividad antiviral. Cabe señalar que la fracción EAR-4, caracterizada por presentar un fucogalactano sulfatado, mostró ser la de mayor actividad frente a ambos virus, mientras que los altos valores obtenidos de CC50 en todas las fracciones indican una baja citotoxicidad para los fucoidanos extraídos de Dictyota dichotoma., Facultad de Ciencias Exactas

La tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, el objetivo general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis. Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal., Facultad de Ciencias Exactas

El trabajo de tesis consta de tres bloques: 1) la caracterización de dos proteínas (BatA y BatB) codificadas en el genoma de Leptospira interrogans; 2) el estudio del rol de los neutrófilos durante la infección con Leptospira interrogans, utilizando un modelo de leptospirosis murina experimental; 3) el análisis de la relación entre el polimorfismo Arg753Gln del TLR2 humano y la leptospirosis., Facultad de Ciencias Exactas

Objetivo general Estudiar los mecanismos patogénicos moleculares en tipos celulares claves en la infección experimental por CVB3. Objetivos específicos e hipótesis de trabajo 1. Estudiar la expresión de los receptores celulares y su correlación con la susceptibilidad a la infección por virus Coxsackie B (CVB) en células cardíacas murinas y humanas y en ratones de distintas cepas Acorde a trabajos previos (Kandolf et al. 1985; Gomez et al. 1993), los cardiomiocitos murinos y humanos son susceptibles a la infección por CVB. Partiendo de la hipótesis que la susceptibilidad a la infección correlaciona con la expresión del o los receptores virales, se propone estudiar en modelos in vitro de cardiomiocitos humanos derivados de células embrionarias madres totipotenciales (hESC-C) y en cardiomiocitos murinos recién nacidos y adultos, la infección con CVB a nivel de la replicación viral, y la sobrevida celular y su correlación con los niveles de expresión del receptor viral CAR y DAF, en el caso humano. Asimismo se buscará determinar si existen cambios en los niveles de CAR entre distintas cepas de ratones y la asociación de estos eventuales cambios con la susceptibilidad a la infección viral. Para ello se procederá a inocular ratones de distintas cepas con CVB3 para determinar en los mismos los niveles de replicación viral en corazón; el grado de injuria tisular y los niveles tisulares de CAR. Estos estudios podrán determinar la susceptibilidad de hESC-C a la infección por CVB3, la correlación con la expresión de los receptores y las eventuales diferencias en el sistema murino donde DAF no es utilizado y clarificar el rol de la expresión de CAR en la miocarditis y si aquellas cepas de ratones que expresan más o menos CAR son más o menos susceptibles a la replicación viral y a la subsecuente enfermedad. 2. Estudiar la infección de macrófagos por CVB Considerando como hipótesis de trabajo que los macrófagos juegan un rol esencial en la miocarditis y sus secuelas, se intentará caracterizar la infección de CVB3 en macrófagos teniendo en cuenta los niveles de replicación viral, el estado de activación y/o diferenciación celular y el efecto en la síntesis de moléculas con eventual rol en la patogénesis de la infección por CVB3. 3. Estudiar el rol de macrófagos en la miocarditis viral y la fibrosis Partiendo de la hipótesis ya mencionada, se analizará el rol de los macrófagos en la replicación de CVB3 in vivo y su estado de activación en los distintos estadios de la infección viral. Asimismo se buscará correlacionar la activación de macrófagos, la expresión de Gal-3 y la activación de fibroblastos con la fibrosis cardíaca y las consecuencias por la depleción de macrófagos., Facultad de Ciencias Exactas

En el presente trabajo, se ahondó en el estudio de las diferencias entre las variantes intratípicas CVB1N y CVB1Nm con respecto a sus diferencias genómicas, replicativas ex vivo, in vivo, estructurales y en el uso de los receptores celulares., Facultad de Ciencias Exactas

El presente trabajo consta de 2 capítulos. El primer capítulo describe: • el clonado, la expresión y la purificación de la proteína LIC10365; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis del grado de conservación y expresión de LIC10365 entre diferentes serotipos de leptospira; • el estudio de su expresión durante la infección in vivo; • el estudio de su capacidad para activar a la célula endotelial. El segundo capítulo describe: • la construcción de 1 clon codificante de la proteína CTB en fusión con LipL32; • la expresión y purificación de la proteína recombinante; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis de la reactividad de la proteína recombinante contra sueros de pacientes convalecientes; • el estudio de la capacidad de la proteína recombinante para proteger a animales inmunizados con la misma frente a la infección con leptospiras patogénicas; • el análisis de la respuesta inmune de los animales inmunizados., Facultad de Ciencias Exactas