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Objetivo: Avaliar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) do sistema endocanabinoide (ECS) com o subfenótipo de acidente vascular encefálico (AVE) em pacientes com anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: O grupo amostral foi composto por 217 pacientes com AF, provenientes da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (Hemope, PE), subdivididos em: (1) 73 com AVE (mediana do desenvolvimento de AVE de 8 anos [1-58 anos]) e (2) 144 pacientes como grupo controle, sem AVE (mediana de 29 anos [18-65 anos]). O fenótipo da AF foi diagnosticado por HPLC e confirmado por PCR-RE, e mutação da -α3,7kb talassemia foi detectada por GAP-PCR. Com base no impacto funcional e nas frequências alélicas mínimas (MAF) > 10%, selecionamos quatro SNPs do ECS que poderiam estar relacionados com o AVE na AF (FAAH rs324420, MAGL rs604300, CNR1 rs7766029 e CNR2 rs35761398) e a genotipagem foi realizada com ensaios TaqMan no PCR em Tempo Real, QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Resultados: Os dados de gênero, hemoglobina total (Hb), contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta, desidrogenase láctica, quantidade de crise vaso oclusivas (VOCs)/ano e o genótipo para -α3,7kb-talassemia não foram associados ao AVE, enquanto níveis mais baixos de Hb F (%) foram associados ao desenvolvimento de AVE (AVE, Hb F 5 ± 3,3 vs. grupo de controle, Hb F 9,6 ± 5,6, p < 0,0001). Em relação aos SNPs, todos encontraram-se dentro do Equilíbrio de Hardy Weinberg (p > 0,05), e o modelo de herança adotado foi o de dominância para o MAGL rs604300 e sobredominância para os demais. As frequências alélicas e genotípicas não diferiram estatisticamente entre os grupos, bem como a distribuição dos alelos não diferiu do MAF para a população adotada (NCBI's ALFA dataset, Latin America 1). Os modelos de regressão logística binária, ajustados para a Hb F como covariável, não demonstraram associação entre os SNPs e o desenvolvimento de AVE. Discussão: O AVE é um subfenótipo da AF relacionado à hemólise, à disfunção endotelial e à lesão vascular. No âmbito do ECS, estudos com modelos animais de AVE isquêmico já demonstraram a ação neuroprotetora do antagonismo de receptores CB1, codificados pelo gene CNR1, e do agonismo de receptores CB2 (CNR2), estes últimos ainda relacionados à neurogênese pós AVE. Portanto, ainda que nossos dados tenham revelado que os SNPs analisados não são bons preditores para o AVE, existem evidências crescentes para considerar estes genes como candidatos na modulação desse e de outros subfenótipos da AF. Além disso, nosso estudo fornece pela primeira vez um modelo de herança para os SNPs do ECS na AF e sua caraterização em uma coorte brasileira. O modelo de herança de um SNP pode ser vital para desvendar as características genéticas de doenças complexas, como a AF, e associar fenótipos da doença a genótipos específicos. Conclusão: Fornecemos aqui a primeira associação de SNPs do ECS com o subfenótipo da AVE na AF. Considerando os recentes avanços no sentido da utilização de canabinoides nessa e em diversas outras doenças, nossos resultados também abrem caminho para futuros estudos de caraterização dos polimorfismos genéticos do ECS nesta população.

Objetivo: Demonstrar o impacto da alfa-talassemia em um caso heterozigoto de hemoglobina (Hb) variante Hope como auxílio de diagnóstico. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma paciente do sexo feminino (20 anos) proveniente do Instituto de Pesquisas, Ensino e Diagnósticos da APAE (IPED-APAE) de Campo Grande/MS, foi recebida no Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias. Em seu hemograma constava Hb (11,1 g/dL), VCM (72.5 fl), HCM (22.6 pg), CHCM (31.1 %) e RDW (13.7 %). Com base nos dados, foram realizadas análises eletroforéticas de Hb em pH alcalino e ácido, cromatográficas (HPLC de troca iônica, Premier Resolution, Trinity Biotech) e moleculares (GAP-PCR e sequenciamento de DNA por método de Sanger, sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Na corrida de eletroforese alcalina, a Hb variante migrou anodicamente para a posição da Hb A e, na eletroforese ácida, na posição da Hb F. O perfil cromatográfico indicou a presença de Hb A (49,9%, RRT/A 0.99), Hb A2 (3,7%, RRT/A2 1.00) e uma fração globínica de 30,0% eluindo no tempo de retenção da Hb F (RRT/F 0.99). A associação das análises eletroforéticas e cromatográficas, bem como informações do hemograma, orientaram a investigação molecular de Hb beta(β)-variante com coerança de alfa(α)-talassemia. A GAP-PCR detectou a mutação delecional de α-talassemia (-α3.7kb) em homozigose, e o sequenciamento do gene da β-globina (HBB) identificou a mutação de ponto HBB:c.410G>A em heterozigose, compatível com a Hb Hope. Discussão: O conjunto dos resultados possibilitou o diagnóstico de heterozigoto para Hb Hope (Hb A/Hb Hope) e homozigoto para -α3.7kb -talassemia (-α3.7kb/-α3.7kb). Hb β-variantes com carga global mais positiva do que a Hb A, como a Hb S, Hb C e Hb D-Los Angeles, formam menos dímeros (globinas-β mutante com globinas-α) do que a Hb A e, por isso, apresenta menores concentrações quando analisadas, por exemplo, por HPLC. Na presença de α-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-α impacta ainda mais na formação dessas Hb β-variantes (atingindo 20-30%), onde a menor atração eletrostática das globinas-β variantes se torna uma etapa limitante na competição entre cadeias para a formação dos dímeros. Este pode ser um indicativo de α-talassemia na ausência de análises moleculares, sendo proporcional ao número de mutações de α-talassemia herdadas. No referido caso, era de esperar, como na maioria dos casos, a diminuição da concentração da Hb variante devido a coerança de alfa talassemia. Entretanto, a Hb Hope é uma variante de cadeia β [(G>A) β136 Gly>Asp] carregada negativamente e sua concentração em heterozigose, sem α-talassemia, é de 30 a 40%. O indivíduo apresentou Hb de 30,0%, mesmo em homozigose para α-talassemia e não houve diminuição da concentração da Hb Hope devido a relação à carga das globinas-β Hope, próxima das globinas-βA. Conclusão: Conhecer os princípios teórico-práticos, desde o comportamento das globinas com suas interações até as associações dos métodos laboratoriais para identificação e determinação genotípica, garantem a compreensão e diagnóstico preciso das hemoglobinopatias. Levando posteriormente a um aconselhamento genético adequado e condizente. Além disso, o estudo dessas interações amplia o conhecimento sobre a fisiopatologia de hemoglobinopatias complexas, como a α-talassemia.

Objetivo: Analisar se a heterozigose composta de hemoglobina (Hb) S com beta(β)+ talassemia silenciosa representa fenótipo clínico da Doença Falciforme (DF). Material e Métodos: Amostras de sangue total de oito pacientes, com idades variando de 1 mês a 1 ano, foram enviadas pela Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE - Salvador/BA) para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (LGBM - UFMS/CPTL), devido ao perfil de hemoglobina inconclusivo. As amostras foram submetidas à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC – Premier Resolution, Trinity Biotech ), extração de DNA genômico (Fenol-Clorofórmio) e análises moleculares (Reação em Cadeia da Polimerase seguida de Restrição Enzimática [PCR-RE] e sequenciamento do gene da beta globina [HBB , sequenciador 3730xl DNA Analyzer , Thermo Fisher Scientific ]). Resultados: A análise por PCR-RE detectou em todos da amostra a presença de um alelo com a mutação HBB:c.20A>T (Hb S), e o sequenciamento demonstrou as mutações para β+ talassemia silenciosa: (1) HBB:c.-151C>T (-101C>T), em sete pacientes e (2) HBB:c.-176C>A (-126C>A), em apenas um paciente, ambas em heterozigose composta para a mutação de Hb S. Por meio de análises prévias, obtiveram-se as seguintes médias de concentração das frações hemoglobínicas e hematológicas para as mutações -101C>T e -126C>A, respectivamente: Hb A = 23.6 e 34.7%, Hb A2= 3.0 e 4.6%, Hb F= 31.0 e 6.7%, Hb S = 36.4 e 47.7%, Eritrócito = 4.10 e 4.07 x106/mm3, Hb total= 11.02 e 10.21 g/L, Hematócrito = 33.12 e 33.80%, VCM = 82.17 e 83.05 fL, HCM = 26.38 e 25.10 pg, RDW = 16.74 e 12.50%. Discussão: DF é um termo amplo que define um grupo caracterizado pela presença da Hb S, tanto em homozigose (Anemia Falciforme, Hb SS) quanto em heterozigose composta com outra mutação no gene HBB , ocasionando diferentes complicações clínicas. Dito isso, a coexistência de mutações para β-talassemia e Hb S no mesmo indivíduo gera casos de DF. Entretanto, existem diferentes manifestações clínicas a depender da natureza da mutação de β-talassemia, que pode acarretar na redução total (β0) ou parcial (β+) da síntese de cadeias β-globina, o que impacta na concentração da Hb A. Os pacientes aqui relatados apresentaram concentração de Hb A próximas da Hb S, aspecto que atenua os processos fisiopatológicos cruciais na DF, a exemplo da polimerização da Hb S e falcização dos eritrócitos. Portanto, o perfil hemoglobínico desses pacientes é compatível com um fenótipo assintomático, justificando a reflexão sobre essas mutações de β+-talassemia silenciosa, na associação com Hb S, pertencerem ou não ao grupo da DF. Conclusão: As mutações de β+ talassemia silenciosa caracterizadas nesse estudo, associado com a Hb S, não resulta em perfis hemoglobínicos e hematológicos condizentes com a DF, o que pode auxiliar no acompanhamento e manejo da doença.

Objetivo: Investigar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) nos genes ACE2 e CNR2 e a severidade da infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Materiais e métodos: Pacientes diagnosticados com COVID-19 por RT-qPCR (n = 469) foram triados no Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LABDIP/UFMS) quanto à gravidade clínica da infecção entre casos leves (sem necessidade de hospitalização) ou graves (com a necessidade de hospitalização e suplementação de O2). Amostras de sangue total foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM/UFMS). O DNA genômico foi extraído (PureLink Genomic DNA Mini Kit) e as amostras foram genotipadas para os polimorfismos ACE2 rs2285666 (C>T) e CNR2 rs35761398 (TT>CC) via TaqMan Genotyping SNP Assays em qPCR (QuantStudio5, Thermo Fisher Scientific). Foram realizados modelos ajustados de regressão logística binomial, com cálculo de razão de probabilidades (OR) e intervalo de confiança para 95% dos dados (p < 0,05). Resultados: Para o SNP ACE2 rs2285666 , os indivíduos foram clinicamente classificados em leves (n = 245) e graves (n = 224), e os fatores associados ao risco aumentado da forma grave de COVID-19 foram: gênero masculino [OR = 2,99 (1,96–4,57)], idade ≥ 60 anos [OR = 4,43(2,32–8,44)] e apresentar comorbidades [OR = 4,40(2,87–6,74)]. Em mulheres, o risco maior de COVID-19 severa foi associado ao polimorfismo de ACE2 em homozigose para o alelo mutante [TT = 7,1%; OR = 2,97(1,02–8,62)], e em homens (hemizigotos), o maior risco foi também associado ao alelo mutante [T = 29,9%; OR = 2,37(1,18–4,75)]. Já para o SNP CNR2 rs35761398 , obteve-se maior frequência em casos leves (n = 235) comparativamente aos graves (n = 203), de modo que os fatores idade ≥ 60 anos [OR = 1,06(1,04–1,08)], ser do gênero masculino [OR = 3,17(1,99–5,03)] e a presença de comorbidades [OR = 3,52(2,20–5,64)], foram também associados à maior severidade. A presença do alelo mutante desse SNP em heterozigose (TT-CC) demonstrou ter efeito protetivo à forma grave da doença [TT-CC; OR = 0,35(0,19–0,64)]. Discussão: A Enzima Conversora de Angiotensina-2 (ECA2), codificada pelo gene ACE2 , é responsável pela internalização do SARS-CoV-2 nas células hospedeiras. O SNP rs2285666 está localizado no início do íntron 3 deste gene, no cromossomo X, possivelmente responsável por aumentar sua expressão. Portanto, o risco aumentado de desenvolver o fenótipo grave da COVID-19 estaria associado aos portadores do alelo mutante devido ao aumento da ECA2 nas células hospedeiras, potencializando a carga viral. Já o SNP rs35761398 é caracterizado por uma mutação missense no códon 63 do gene CNR2, sendo o receptor mutante (CB2-R63) menos funcional e, portanto, associado a uma resposta imune desbalanceada ao inibir a proliferação de linfócitos. Indivíduos heterozigotos poderiam, possivelmente, manter a expressão equilibrada dos receptores CB2 Q63/R63, garantindo uma resposta imune balanceada e um menor risco de desenvolver a forma grave da doença em até 2 vezes. Conclusão: A presença do SNP rs2285666 no gene ACE2 em homozigose (mulheres) ou hemizigose (homens) está relacionado com o aumento de chance, em até 3 vezes, no estabelecimento do quadro mais grave da COVID-19. Já a presença do SNP rs35761398 em heterozigose está associada a um risco reduzido, em aproximadamente 3 vezes, no desenvolvimento de quadros severos da infecção por SARS-CoV-2.

Objetivo: O estudo se refere ao relato de caso de uma criança com dupla heterozigose de beta talassemia, sendo portanto, o primeiro registro da interação entre as mutações HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87). Materiais e métodos: Uma amostra de sangue total de um paciente com 12 anos proveniente do estado do Maranhão (MA) foi encaminhada ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM - UFMS/CPTL), juntamente às informações do indivíduo e seu hemograma para uma confirmação de diagnóstico de hemoglobinopatias. A análise cromatográfica foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech (Premier Resolution) e o DNA genômico foi extraído por fenol clorofórmio. A caracterização dos alelos mutantes para o gene HBB foi realizado por sequenciamento de DNA pelo método de Sanger e análise de Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal (PHHF) por PCR-Multiplex. Resultados: O hemograma do paciente evidenciou anemia hemolítica (reticulócitos = 166.300 mm3), microcítica (VCM = 62,5 fL) e hipocrômica (HCM = 20,60 pg), enquanto o resultado da cromatografia indicou Hb F (86,5%), Hb A (3,3%) e Hb A2 (2,7%), inicialmente levando à suspeita de heterozigose composta para beta talassemia e PHHF. Entretanto, a PCR-GAP não identificou mutações para PHHF. O sequenciamento demonstrou duas mutações, ambas em heterozigose, HBB:c.48G>A (Códon 15) e HBB:c.137C>T (Códon 87), ou seja, uma de Beta0 e uma de Beta+ talassemia, respectivamente. Discussão: Na presença de uma beta talassemia, a síntese da cadeia beta globina é reduzida (Beta+) ou ausente (Beta0), levando a formação de cadeias alfa globínicas em excesso, as quais são instáveis e precipitam nas membranas dos precursores eritróides e dos eritrócitos, ocasionando a eritropoiese ineficaz e a hemólise. Por isso, a anemia hemolítica, microcítica e hipocrômica detectada no hemograma indicou a existência desta hemoglobinopatia, a qual por apresentar uma ampla variedade de alterações genéticas, se faz essencial a realização do sequenciamento a fim da correta identificação da mutação no gene HBB. A PHHF foi investigada pela alta concentração de HbF para idade do investigado, porém não condizente com perfil do hemograma. Dessa forma, a amostra foi sequenciada e duas mutações foram detectadas sendo equivalentes a uma redução parcial e uma total da síntese das cadeias beta-globina. Ou seja, um dos alelos não sintetiza cadeia beta-globina, enquanto o outro produz em baixa concentração, explicando os níveis reduzidos de HbA. A elevação da HbF se trata de uma reação de compensação, em que o gene gama, localizado no cluster do gene HBB, é hiperexpresso para suprir a demanda da beta-globina deficiente. Conclusão: A associação de diversas metodologias de análises hematológicas e moleculares laboratoriais foi determinante para o diagnóstico preciso do paciente, dado que a beta talassemia apresenta vasta possibilidades de mutações, especialmente as de ponto. Além disso, a determinação acurada da hemoglobinopatia serve de base para o tratamento e cuidado adequado ao indivíduo, além de ser essencial para o responsável pelo aconselhamento genético à família e ao afetado.

Objectives: Evaluate the association of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the endocannabinoid system (ECS) with the hemolytic and vasculopathy subphenotypes in sickle cell anemia (SCA) patients. Methodology: The study was performed with 297 SCA patients (median age 30 years, range 6 to 66 years, 171 males, 57.6%), enrolled and regularly followed in a reference center in northeast Brazil. Clinical and laboratory data were obtained from medical records. Patients were divided into subgroups according to clinical complications. The control group was patients without complications. Peripheral blood samples from all patients were collected, and genomic DNA was extracted using the phenol-chloroform protocol. The SCA genotype was confirmed with PCR followed by restriction analysis with Dde I, and alpha thalassemia (-α3.7kb) mutation was detected with GAP-PCR. MAGL (rs604300, A>G), FAAH (rs324430, C>A), CNR1 (rs7766029, T>C), and CNR2 (rs35761398, TT>CC) polymorphisms were genotyped using TaqMan assays. Results: Overall, 73 patients developed stroke (24.6%), 80 of the men presented priapism (46.8%), and 144 (48.5%) were assigned as the control group (for priapism, n = 58). Regarding clinical and laboratory data, gender, total hemoglobin (Hb), reticulocyte count, indirect bilirubin, and lactate dehydrogenase were not associated with clinical complications. Lower levels of Hb F (%) were associated with stroke (stroke, Hb F 5 ± 3.3% vs. control group, Hb F 9.6 ± 5.6, p < 0.0001), and the non-mutated genotype for -α3.7kb was associated with priapism (p < 0.0001). Due to a better fit of data, the overdominant model of inheritance was adopted for all SNPs. The TT-CC genotype for CNR2 SNP (33 [42.3%] in the priapism group and 31 [53.4%] in control) was independently associated with priapism, even when -α3.7kb was included as a confounder (OR = 0.386 [0.175 – 0.854], p = 0.019). No statistical association was found for the other SNPs analyzed. Discussion: SCA is an inherited disease characterized by the homozygous genotype of HBB:c.20 T>A mutation, which encodes Hb S. The main determinant of SCA severity is the Hb S polymerization level, leading to hemolysis, vasculopathy, vaso-occlusion, and an inflammatory state. In a quest for new insights into the pathophysiology and therapies in SCA, the ECS posts as a potential candidate once it demonstrates a significant role in several biochemical and physiological pathways of clinical interest. The receptor cannabinoid 2 (CB2), encoded by the CNR2 gene, is mainly expressed in immune cells and plays a crucial role in the regulation of the immune system. Activation of CB2 receptors exerts potent anti-inflammatory effects, reducing the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β and reducing leukocyte infiltration and migration, decreasing tissue damage and inflammation. In our study, the lower chance of developing priapism associated with the TT-CC genotype for CNR2 demonstrates a potential CB2 effect in regulating SCA complications by modulating inflammation. Conclusion: The genetic and biochemical basis of SCA complications still needs to be completed, and searching for new predictors is essential. Based on CB2 functions and our findings, this gene represents a potential candidate for modulating SCA pathophysiology. Now, it's important to find out how this modulation functionally occurs.

Objetivo: Avaliar a influência da alfa talassemia em portadores da hemoglobina S (Hb AS) e determinar as concentrações de hemoglobina S (Hb S) como suporte de diagnóstico laboratorial. Materiais e métodos: Foram encaminhadas 182 amostras de sangue total com suspeitas de traço falciforme, provenientes de doadores de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Mato Grosso do Sul (HEMOSUL), ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para a confirmação de diagnóstico molecular. Os perfis cromatográficos foram obtidos por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Ultra 2 Resolution e Premier Resolution (Trinity Biotech). As análises moleculares foram realizadas após extração do DNA genômico, seguido de PCR-RE (Hb S) e GAP-PCR (alfa talassemia). Para as análises estatísticas foram realizados testes de ANOVA com post hoc de Tukey, p < 0,05. Resultados: Dos 182 doadores avaliados, 139 indivíduos (76,4%) apresentaram o perfil Hb AS sem alfa talassemia e 43 (23,6%) apresentaram alfa talassemia, sendo 37 (86%) heterozigotos para mutação -α3.7 e 6 (14%) homozigotos para deleção -α3.7. A concentração da Hb S obtida no HPLC Premier e Ultra 2 em indivíduos Hb AS foi de 36,33 ±3,15% e 38,37 ±2,29%, respectivamente. Indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em heterozigose apresentaram Hb S de 32,25 ± 3,58% (Premier) e 32,96 ± 2,94% (Ultra2). Nos indivíduos Hb AS com alfa-talassemia em homozigose a média de Hb S foi 27,86 ±3,18% (Premier) e 29,58 ±3,41% (Ultra2). Foi observado diferença significativa (p < 0,0001) em relação às concentrações médias de Hb S nos perfis encontrados, sendo menor para o perfil AS/homozigoto para alfa talassemia, independente dos equipamentos avaliados. Discussão: De acordo com os resultados apresentados podemos verificar que houve diminuição da concentração de Hb S nos indivíduos Hb AS com coerança de alfa talassemia. Tal diminuição é reflexo da característica das Hb beta-variantes, como a Hb S, mais carregada positivamente em comparação com a Hb A, e forma menos dímeros de Hb (globinas-beta com globinas-alfa), por isso, sua concentração é reduzida. Na presença de alfa-talassemia, a menor disponibilidade de globinas-alfa impacta ainda mais na formação de Hb beta-variante e este pode ser um indicativo de alfa-talassemia na ausência de análises moleculares. Logo, é importante estabelecer os valores de corte da Hb S em indivíduos com a presença e ausência da alfa talassemia para auxiliar no direcionamento de diagnóstico, principalmente, em diferentes modelos de HPLC disponíveis no mercado. Conclusão: Compreender a coerança de alfa talassemia em indivíduos com Hb AS é importante para auxiliar no diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias, principalmente, na ausência de análise molecular para alfa-talassemia, uma vez que com dados da análise cromatográfica foi possível estabelecer a concentração da Hb S para os diferentes tipos de indivíduos que foram avaliados neste estudo.

Objetivo: Demonstrar a relevância do diagnóstico molecular na identificação de heterozigoto composto para beta talassemias HBB:c.118C>T (CD39) e HBB:c.-138C>T (-88C>T) em recém-nascido da triagem neonatal. Materiais e métodos: Amostra de sangue de um paciente do sexo masculino, três meses de idade, procedente do Hospital Universitário Júlio Müller (HUJM-UFMT), foi encaminhada para Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para análise laboratorial de perfil hemoglobínico inconclusivo, juntamente com exames hematológicos complementares. Para determinar as frações hemoglobínicas do paciente, a amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performace (HPLC-Ultra2, Trinity Biotech, Kit Resolution) e para o estudo molecular foi realizado o sequenciamento do gene beta globina (HBB) (sequenciador 3770xl DNA analyser). Resultados: Após análises por HPLC e sequenciamento, o perfil de hemoglobina da criança foi Hb F (90,2%), Hb A (3%) e Hb A2 (0,9%) com a presença das mutações HBB:c.-138C>T (Beta++ talassemia, -88C>T) e HBB:c.118C>T (Beta0 talassemia, CD39), ambas em heterozigose. Em relação aos dados hematológicos os seguintes parâmetros foram observados: RBC de 3,77 milhões/mm3, Hb de 9,9 g/dL, Hct de 29,3%, VCM de 77,7 fl, HCM de 26,4 pg, CHCM de 34,0 g/dL, RDW de 23,5%, contagem de reticulócitos 4,62%, ferritina 384,3 ng/mL, Lactato Desidrogenase (LDH) 418 U/L, bilirrubina total 1,2 mg/dL, bilirrubina direta 0,4 mg/dL e bilirrubina indireta 0,8 mg/dL. Discussão: Na mutação CD39 um códon de parada é gerado impedindo a tradução eficaz do RNAm do gene HBB, o que leva ao fenótipo β0. Por outro lado, a mutação -88C>T, presente na região promotora, causa uma leve redução na expressão da β-globina. A interação dessas mutações resulta no fenótipo de beta talassemia intermédia, a qual é caracterizada por uma heterogeneidade clínica que se situa entre os sintomas leves do traço talassêmico e as manifestações graves da beta talassemia maior. Neste relato, o probando apresentou anemia discreta, acentuada anisocitose, aumento de reticulócitos, de LDH e de bilirrubina indireta, caracterizando uma anemia hemolítica. O aumento da ferritina pode ser resultado de um processo inflamatório. No entanto, o perfil clínico poderá ser melhor avaliado após os seis meses de vida, uma vez que nesse período ocorre a estabilização nas concentrações das Hbs. É importante salientar que outros fatores genéticos, como a presença de alfa talassemia e mutações que influenciam em maior expressão de Hb F, podem estar associados, contribuindo assim para uma forma mais leve da doença. Conclusão: Considerando a diversidade de manifestações fenotípicas, a heterogeneidade genotípica e a gravidade dos sintomas clínicos, a detecção e o tratamento adequados dos pacientes com talassemia intermédia permanecem um desafio significativo. Análises moleculares são imprescindíveis para um diagnóstico confirmatório da doença, permitindo assim a implementação de estratégias que visam otimizar a qualidade de vida dos pacientes e minimizar possíveis complicações.

Abstract Background Malaria represents a worldwide medical emergency affecting mainly poor areas. Plasmodium parasites during blood stages can release kinins to the extracellular space after internalization of host kininogen inside erythrocytes and these released peptides could represent an important mechanism in liver pathophysiology by activation of calcium signaling pathway in endothelial cells of vertebrate host. Receptors (B1 and B2) activated by kinins peptides are important elements for the control of haemodynamics in liver and its physiology. The aim of this study was to identify changes in the liver host responses (i.e. kinin receptors expression and localization) and the effect of ACE inhibition during malaria infection using a murine model. Methods Balb/C mice infected by Plasmodium chabaudi were treated with captopril, an angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitor, used alone or in association with the anti-malarial chloroquine in order to study the effect of ACE inhibition on mice survival and the activation of liver responses involving B1R and B2R signaling pathways. The kinin receptors (B1R and B2R) expression and localization was analysed in liver by western blotting and immunolocalization in different conditions. Results It was verified that captopril treatment caused host death during the peak of malaria infection (parasitaemia about 45%). B1R expression was stimulated in endothelial cells of sinusoids and other blood vessels of mice liver infected by P. chabaudi. At the same time, it was also demonstrated that B1R knockout mice infected presented a significant reduction of survival. However, the infection did not alter the B2R levels and localization in liver blood vessels. Conclusions Thus, it was observed through in vivo studies that the vasodilation induced by plasma ACE inhibition increases mice mortality during P. chabaudi infection. Besides, it was also seen that the anti-malarial chloroquine causes changes in B1R expression in liver, even after days of parasite clearance. The differential expression of B1R and B2R in liver during malaria infection may have an important role in the disease pathophysiology and represents an issue for clinical treatments.

During liver fibrogenesis, there is an imbalance between regeneration and wound healing. The current treatment is the withdrawal of the causing agent; thus, investigation of new and effective treatments is important. Studies have highlighted the action of chondroitin sulfate (CS) in different cells; thus, our aim was to analyze its effect on an experimental model of bile duct ligation (BDL). Adult Wistar rats were subjected to BDL and treated with CS for 7, 14, 21, or 28 days intraperitoneally. We performed histomorphometric analyses on Picrosirius-stained liver sections. Cell death was analyzed according to caspase-3 and cathepsin B activity and using a TUNEL assay. Regeneration was evaluated using PCNA immunohistochemistry. BDL led to increased collagen content with corresponding decreased liver parenchyma. CS treatment reduced total collagen and increased parenchyma content after 21 and 28 days. The treatment also promoted changes in the hepatic collagen type III/I ratio. Furthermore, it was observed that CS treatment reduced caspase-3 activity and the percentage of TUNEL-positive cells after 14 days and cathepsin B activity only after 28 days. The regeneration increased after 14, 21, and 28 days of CS treatment. In conclusion, our study showed a promising hepatoprotective action of CS in fibrogenesis induced by BDL.

Plasmodium falciparum, the most virulent of the human malaria parasite, is responsible for high mortality rates worldwide. We studied the M1 alanyl-aminopeptidase of this protozoan (PfA-M1), which is involved in the final stages of hemoglobin cleavage, an essential process for parasite survival. Aiming to help in the rational development of drugs against this target, we developed a new strain of P. falciparum overexpressing PfA-M1 without the signal peptide (overPfA-M1). The overPfA-M1 parasites showed a 2.5-fold increase in proteolytic activity toward the fluorogenic substrate alanyl-7-amido-4-methylcoumarin, in relation to the wild-type group. Inhibition studies showed that overPfA-M1 presented a lower sensitivity against the metalloaminopeptidase inhibitor bestatin and to other recombinant PfA-M1 inhibitors, in comparison with the wild-type strain, indicating that PfA-M1 is a target for the in vitro antimalarial activity of these compounds. Moreover, overPfA-M1 parasites present a decreased in vitro growth, showing a reduced number of merozoites per schizont, and also a decrease in the iRBC area occupied by the parasite in trophozoite and schizont forms when compared to the controls. Interestingly, the transgenic parasite displays an increase in the aminopeptidase activity toward Met-, Ala-, Leu- and Arg-7-amido-4-methylcoumarin. We also investigated the potential role of calmodulin and cysteine proteases in PfA-M1 activity. Taken together, our data show that the overexpression of PfA-M1 in the parasite cytosol can be a suitable tool for the screening of antimalarials in specific high-throughput assays and may be used for the identification of intracellular molecular partners that modulate their activity in P. falciparum.

Estudou-se a influência do posicionamento no solo na dinâmica da decomposição de resíduos de arbustos mediterrânicos, numa comunidade característica de montados do Alentejo, durante um período de cerca de 2 anos. Para o efeito, monitorizaram-se as variações de matéria orgânica e de nutrientes em folhas e raminhos de Cistus salviifolius L. colocados na superfície do solo e incorporados a 10 cm de profundidade, através da técnica dos “sacos de decomposição” A taxa anual decomposição das folhas na superfície do solo (-0,71) foi mais rápida do que a dos raminhos em posição homóloga (-0,17). Esta diferenciação foi também observada para as folhas e raminhos incorporados a 10 cm de profundidade, tendo a taxa sido bastante mais elevada (respectivamente -0,98 e -0,43). A diminuição da matéria orgânica ocorreu em duas fases: uma fase inicial de decréscimo bastante rápido, influenciado principal-mente pela natureza do substrato, à qual se seguiu uma fase de decréscimo muito lento, no qual se fez sentir tanto o efeito do substrato como o da sua localização. A libertação dos nutrientes foi mais influenciada pela composição inicial dos resíduos do que pela localização destes no solo, tendo a libertação sido mais rápida nas folhas do que nos raminhos. As relações lineares inversas observadas entre a MO remanescente e a concentração de N no material residual indicam maiores períodos de imobilização de N nas folhas colocadas na superfície do que nas incorporadas no solo.The influence of placement on litter decomposition dynamics was studied in the Mediterranean shrub Cistus salviifolius L. Litter bags containing either leaf or branch were placed at soil surface and others buried at 10 cm depth, in a Mediterranean shrubland of Alentejo, Southern Portugal. Changes in organic matter and nutrient content were assessed over a 2-year period. Decomposition was faster for leaves than for branches, as well as for buried residues than for those placed on soil surface. The annual decomposition rates, k, at surface were -0.71 for leaf and -0.17 for branches, while for buried litter they were -0.98 and -0.43, respectively. Organic matter decrease showed two phases: one initial decomposition phase of fast loss, mainly influenced by litter quality, followed by a very slow phase, influenced by both litter quality and placement. Nutrient dynamics was more influenced by litter initial chemical composition than by its placement, and the release was faster in the residues with the highest initial content, the leaves. The linear inverse relations, determined between remaining OM and N concentration in the remaining material, indicate longer N retention periods in the surface leaves than in buried ones.

Plasmodium chabaudi malaria parasite organelles are major elements for ion homeostasis and cellular signaling and also target for antimalarial drugs. By using confocal imaging of intraerythrocytic parasites we demonstrated that the dye acridine orange (AO) is accumulated into P. chabaudi subcellular compartments. The AO could be released from the parasite organelles by collapsing the pH gradient with the K+/H+ ionophore nigericin (20 µM), or by inhibiting the H+-pump with bafilomycin (4 µM). Similarly, in isolated parasites loaded with calcium indicator Fluo 3-AM, bafilomycin caused calcium mobilization of the acidic calcium pool that could also be release with nigericin. Interestingly after complete release of the acidic compartments, addition of thapsigargin at 10 µM was still effective in releasing parasite intracellular calcium stores in parasites at trophozoite stage. The addition of antimalarial drugs chloroquine and artemisinin resulted in AO release from acidic compartments and also affected maintenance of calcium in ER store by using different drug concentrations.

Os componentes dos ciclos de nutrientes em montados de Quercus rotundifolia Lam., relacionados com a precipitação foram estudados na região de Évora, de Novembro de 1996 a Dezembro de 2000. A precipitação bruta, o gotejo a diferentes distâncias do tronco e o escorrimento ao longo do tronco das árvores foram quantificados de modo contínuo, sendo colhidas amostras semanalmente para se proceder à respectiva caracterização química. A quantidade de nutrientes transferidos para o solo através das diferentes soluções foi também determinada. Verificou-se um acréscimo da concentração das espécies iónicas no gotejo em relação à precipitação bruta, o qual foi ainda mais manifesto no escorrimento ao longo do tronco. Estudaram-se, igualmente, as características físico-químicas do solo sob e fora da influência da copa destas árvores, num montado relativamente esparso. Além disso, também se avaliou a quantidade das camadas orgânicas e a quantidade de nutrientes aí retidos. As características físicas e químicas do solo apresentaram, de um modo geral, uma diferenciação positiva em resultado da presença das árvores. Avaliou-se a taxa de mineralização de N nas áreas sob e fora da acção do coberto das árvores, tendo-se observado uma mais elevada disponibilidade deste nutriente nas áreas do sob coberto.Nutrient cycling in Quercus rotundifolia Lam. systems, regarding precipitation was studied at Évora (Southern Portugal), since November of 1996 until December of 2000. The amounts of gross rainfall, throughfall (at different distances from the tree trunk) and stemflow were measured continuously and samples for chemical analysis were collected weekly. The concentration of nutrients was higher in the throughfall than in the gross rainfall, especially in the areas closer to the tree trunk. Nutrients transferred to soil, through bulk rainfall, throughfall and stemflow were quantified. The highest concentration of nutrients was observed in the stemflow water. Soil physical and chemical characteristics, underneath and outside Quercus rotundifolia crowns, were studied in areas where trees commonly are wide spaced. The amounts of the forest floor litter layer were also evaluated. Soil physical and chemical characteristics showed in general a positive effect with tree presence. Nitrogen transformation was examined under and outside the influence of the tree canopies. Nitrogen availability was higher in the soil of under crowns areas.

Antimalarial drug resistance remains a major obstacle in malaria control. Evidence from Southeast Asia shows that resistance to artemisinin combination therapy (ACT) is inevitable. Ethnopharmacological studies have confirmed the efficacy of curcumin against Plasmodium spp. Drug interaction assays between curcumin/piperine/chloroquine and curcumin/piperine/artemisinin combinations and the potential of drug treatment to interfere with the ubiquitin proteasome system (UPS) were analyzed. In vivo efficacy of curcumin was studied in BALB/c mice infected with Plasmodium chabaudi clones resistant to chloroquine and artemisinin, and drug interactions were analyzed by isobolograms. Subtherapeutic doses of curcumin, chloroquine, and artemisinin were administered to mice, and mRNA was collected following treatment for RT-PCR analysis of genes encoding deubiquitylating enzymes (DUBs). Curcumin was found be nontoxic in BALB/c mice. The combination of curcumin/chloroquine/piperine reduced parasitemia to 37% seven days after treatment versus the control group’s 65%, and an additive interaction was revealed. Curcumin/piperine/artemisinin combination did not show a favorable drug interaction in this murine model of malaria. Treatment of mice with subtherapeutic doses of the drugs resulted in a transient increase in genes encoding DUBs indicating UPS interference. If curcumin is to join the arsenal of available antimalarial drugs, future studies exploring suitable drug partners would be of interest.

Malaria is among the tropical diseases that cause the most deaths in Africa. Around 500,000 malaria deaths are reported yearly among African children under the age of five. Chloroquine (CQ) is a low-cost antimalarial used worldwide for the treatment of Plasmodium vivax malaria. Due to resistance mechanisms, CQ is no longer effective against most malaria cases caused by P. falciparum. The World Health Organization recommends artemisinin combination therapies for P. falciparum malaria, but resistance is emerging in Southeast Asia and some parts of Africa. Therefore, new medicines for treating malaria are urgently needed. Previously, our group identified the 4-aminoquinoline DAQ, a CQ analog containing an acetylenic bond in its side chain, which overcomes CQ resistance in K1 P. falciparum strains. In this work, the antiplasmodial profile, drug-like properties, and pharmacokinetics of DAQ were further investigated. DAQ showed no cross-resistance against standard CQ-resistant strains (e.g., Dd2, IPC 4912, RF12) nor against P. falciparum and P. vivax isolates from patients in the Brazilian Amazon. Using drug pressure assays, DAQ showed a low propensity to generate resistance. DAQ showed considerable solubility but low metabolic stability. The main metabolite was identified as a mono N-deethylated derivative (DAQM), which also showed significant inhibitory activity against CQ-resistant P. falciparum strains. Our findings indicated that the presence of a triple bond in CQ-analogues may represent a low-cost opportunity to overcome known mechanisms of resistance in the malaria parasite.

Malaria is a parasitic disease caused by protozoan parasites from the genus Plasmodium. Plasmodium falciparum is the most prevalent species worldwide and the causative agent of severe malaria. The spread of resistance to the currently available antimalarial therapy is a major concern. Therefore, it is imperative to discover and develop new antimalarial drugs, which not only treat the disease but also control the emerging resistance. Brussonol is an icetexane derivative and a member of a family of diterpenoids that have been isolated from several terrestrial plants. Here, the synthesis and antiplasmodial profiling of a series of brussonol derivatives are reported. The compounds showed inhibitory activities in the low micromolar range against a panel of sensitive and resistant P. falciparum strains (IC50s = 5–16 μM). Moreover, brussonol showed fast-acting in vitro inhibition and an additive inhibitory behavior when combined with the antimalarial artesunate (FICindex~1). The mode of action investigation indicated that brussonol increased the cytosolic calcium levels within the parasite. Hence, the discovery of brussonol as a new scaffold endowed with antiplasmodial activity will enable us to design derivatives with improved properties to deliver new lead candidates for malaria.