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Additional file 2. Detailed description of the study intervention

Additional file 3. Ankle range of motion measurement

Additional file 1. CONSORT checklist - extension to randomised pilot and feasibility trials

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Blutdruckregulation. Dabei stellt die Reninexpression ein sehr plastisches System dar. Eine Möglichkeit des Organismus auf über längere Zeit bestehende Einflüsse zu reagieren und eine adäquate Blutdruckregulation zu gewährleisten ist die Anpassung der Zahl renin¬bildenden Zellen. Hierbei wird ein Mehrbedarf physiologisch über eine retrograde Rekrutierung kompensiert, wobei eine Differenzierung glatter Muskelzellen der afferenten Arteriolen in Reninzellen stattfindet. Eine entscheidende Bedingung für die physiologische Lage der renin-produzierenden Zellen in der Media der präglomerulären Gefäße ist das Transmembranprotein Connexin 40. In dieser Arbeit wurden Anzahl und Lokalisation reninproduzierender Zellen bei der Cx40 defizienten Maus untersucht, bei der über eine Gendeletion der Aldosteronsynthase das RAAS von Geburt an dauerhaft stimuliert ist. Darüber hinaus sollte die altersabhängige Entwicklung der Reninexpression bei Aldosteronsynthase-Connexin 40-Doppel-Knockout-Maus (AS-Cx40-/--Maus) untersucht werden. Sowohl in den angefertigten 3 D-Rekonstruktionen als auch in den histologischen Schnittbildern zeigte sich bei jungen AS-Cx40-/--Mäusen eine deutlich gesteigerte Reninexpression gegenüber gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen. Dies spiegelt sich auch bei den gemessenen renalen Renin-mRNA-Werten wider, die bei AS-Cx40-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp deutlich erhöht sind. Mit fortschreitendem Alter kommt es zu einer ausgeprägten Veränderung der Reninexpression. So findet zunächst ein Zuwachs von reninbildenden Zellen statt, welcher sein Maximum in der 16. Woche erreicht. Bei der 22 Wochen alten AS-Cx40-/--Maus kommt es zu einer leichten Verringerung der Anzahl an reninbildenden Zellen. Dieser regrediente Prozess verstärkt sich gravierend mit zunehmendem Alter. Bei der 34 Wochen alten Maus läßt sich ein auffälliger Rückgang der Reninexpression beobachten. Dieser Prozess setzt sich bei der 46 Wochen alten Maus weiter fort, bei der es zu einer weiteren erheblichen Reduzierung der Reninzellen kommt. Auffällig hierbei ist, dass an einem Großteil der Glomeruli keine Reninsignale vorhanden sind. Dieser Verlauf zeigt sich auch in den Werten der Renin-mRNA-Level, mit einer nicht signifikanten Zunahme der Reninexpression bei den jüngeren und einer nicht signifikanten Abnahme bei den älteren Tieren. Nur bei den 34 Wochen alten Mäusen findet sich eine signifikante Abnahme der Werte im Vergleich zu den jüngeren Mäusen. Bei der Kontrollgruppe der Wildtyp-Mäuse fand sich in den unterschiedlichen Altersstadien eine gleichbleibende Reninexpression. Auch wurden bei den untersuchten Wildtyp-Mäusen nahezu konstante Werte der Renin-mRNA-Level in den verschiedenen Altersstadien gemessen. In den unterschiedlichen Altersstadien der AS-Cx40-/--Mäuse kam es auch zu einer veränderten Lokalisation der Reninzellen. Während bei den jüngeren Tieren die Reninzellen auf den perivaskulären Bereich um die afferente Arteriole beschränkt waren, kam es mit zunehmendem Alter zu einer Ausbreitung sowohl ins Interstitium als auch den periglomerulären Bereich und der Region der efferenten Arteriole. Teilweise war die Bowman’sche Kapsel regelrecht von Reninzellen umhüllt. Dieses Auftreten von Reninzellen in ektopischer Lage im Bereich um die Bowman’sche Kapsel, der efferenten Arteriole und des periglomerulären Interstitiums sind charakteristisch bei Verlust von Cx40. Während bei Cx40 Knockout-Mäusen keine Reninzellen in der Media der afferenten Arteriolen in normaler Lage vorhanden sind, waren bei der AS-Cx40-/--Maus auch reninbildende Zellen in juxtaglomerulärer Position in der Media der afferenten Arteriole zu finden. Eine mögliche Erklärung dafür ist die starke und dauerhafte Stimulation durch die Deletion einer Komponente des RAAS. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Cx40 notwendig für eine korrekte Lokalisation der Reinzellen ist, jedoch keine zwingende Notwendigkeit für die Positionierung in der Media der Gefäßwand. Des Weiteren hat sich gezeigt, dass es bei AS-Cx40-/--Mäusen mit zunehmendem Alter zu sehr ausgeprägten Veränderungen der Reninexpression kommt., The renal renin-angiotensin-aldosterone-system (RAAS) is of major importance for the regulation of the arterial blood pressure. The level of renin expression is thereby highly plastic. One possibility to adjust to long-term effects on arterial blood pressure is to alterate of the number of renin-producing cells. A higher demand is met by the transformation of vascular smooth muscle cells in the media of the afferent arterioles to renin-producing cells. An important precondition for the physiologic position of renin-producing cells in the juxtaglomerular arterioles media is the expression of the gap junction protein connexin 40 (Cx40). The aim of this study was to analyse the number and location of renin cells in mice with genetic deletion of connexin 40 and aldosterone synthase (AS-Cx40-/--mice) in dependency of their age. Mice with genetic deletion of aldosterone synthase exert a permanent stimulated RAAS. Both histological specimen and 3D-reconstructions showed a strong increase in renin expression as well as renin-mRNA-levels for young AS-Cx40-/--mice in comparison to wildtype mice of the same age. Renin expression in AS-Cx40-/--mice changes in parallel with increasing age. Initially the number of renin-expressing cells raises and peaks around the 16th week after birth. In the 22th week a slight reduction in the number begins that leads to a considerable regress of their number and function in the 34th and again in the 46th week. The same trend is found in the expression of renin-mRNA, with a non-significant rise in young mice and a non-significant decline of expression in older mice. Only 34th weeks old animals show a decline that is statistically significant. In the control-groups levels of renin-expression and renin-mRNA levels were virtually constant over time. In contrast AS-Cx40-/--mice showed changes in the localization of renin-producing cells with increasing age. In younger mice the cells were limited to the perivascular region of the afferent arteriole. With increasing maturity, renin-producing cells were also found in the stroma as well as in the periglomerular region and around the efferent arteriole, occasionally leading to a near complete enclosure of the Bowman‘s capsule. The ectopic location of renin-producing cells around the Bowman‘s capsule, the efferent arteriole and in the surrounding stroma are characteristic for a deficiency of Cx40. In Cx40-/- - mice no renin-producing cells are found in the media of the afferent arteriole. However AS-Cx40-/--mice exhibit renin-producing cells in juxtaglomerular position of the afferent arteriole. A possible explanation for this could be the permanent stimulation of the RAAS due to the aldosterone synthase-deficiancy. In summary our results show the important role of Cx40 for the physiologic location of renin-producing cells in the media of afferent arterioles. Furthermore we found significant changes to renin-expression during the maturation of AS-Cx40-/--mice.