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Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules., Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques.

Among the super-resolution methods single-molecule localization microscopy (SMLM) is remarkable not only for best practically achievable resolution but also for the direct access to properties of individual molecules. The primary data of SMLM are the coordinates of individual fluorophores, which is a relatively rare data type in fluorescence microscopy. Therefore, specially adapted methods for processing of these data have to be developed. I developed the software SharpViSu and ClusterViSu that allow for most important data processing steps, namely for correction of drift and chromatic aberrations, selection of localization events, reconstruction of data in 2D images or 3D volumes using different visualization techniques, estimation of resolution with Fourier ring correlation, and segmentation using K- and L-Ripley functions. Additionally, I developed a method for segmentation of 2D and 3D localization data based on Voronoi diagrams, which allows for automatic and unambiguous cluster analysis thanks to noise modeling with Monte-Carlo simulations. Using advanced data processing methods, I demonstrated clustering of CENP-A in the centromeric regions of the cell nucleus and structural transitions of these clusters upon the CENP-A deposition in early G1 phase of the cell cycle., Parmi les méthodes de super-résolution, la microscopie par localisation de molécules uniques se distingue principalement par sa meilleure résolution réalisable en pratique mais aussi pour l’accès direct aux propriétés des molécules individuelles. Les données principales de la microscopie par localisation sont les coordonnées des fluorochromes, un type de données peu répandu en microscopie conventionnelle. Le développement de méthodes spéciales pour le traitement de ces données est donc nécessaire. J’ai développé les logiciels SharpViSu et ClusterViSu qui permettent d’effectuer les étapes de traitements les plus importantes, notamment une correction des dérives et des aberrations chromatiques, une sélection des événements de localisations, une reconstruction des données dans des images 2D ou dans des volumes 3D par le moyen de différentes techniques de visualisation, une estimation de la résolution à l’aide de la corrélation des anneaux de Fourier, et une segmentation à l’aide de fonctions K et L de Ripley. En plus, j’ai développé une méthode de segmentation de données de localisation en 2D et en 3D basée sur les diagrammes de Voronoï qui permet un clustering de manière automatique grâce à modélisation de bruit par les simulations Monte-Carlo. En utilisant les méthodes avancées de traitement de données, j’ai mis en évidence un clustering de la protéine CENP-A dans les régions centromériques des noyaux cellulaires et des transitions structurales de ces clusters au moment de la déposition de la CENP-A au début de la phase G1 du cycle cellulaire.

Transcription regulation of chromatin is a very dynamic process regulated through the recruitment of chromatin-remodeling complexes. My work focuses on NuRD for Nucleosome remodeling and histones deacetylation complex a 1 MDa multi-subunit protein complex and its subunit MBD3 a CpG-binding protein and more precisely on an integrated biology approach of this molecular assembly and its interaction with DNA. It combines biochemical preparation, biophysical characterization, single particle cryo-eletron microscopy and x-ray crystallography. Biophysical analysis show that MBD domain of MBD3 interacts with unmodified CpG DNA, a crystal diffracting up to 3.9 Å were obtained. Moreover a C-terminal intrinsically disordered region of MBD3 were identified and despite is inherent disorder seems to increase the binding affinity of MBD3 for DNA. Crystals were obtained for both constructs in complex with DNA and are currently optimized.Cryo-EM study of NuRD complex allows us to develop and optimized purification and grids preparation for the visualization of the complex. The present results reveal a domain organization of the complex never identify before., La régulation de la transcription est un processus dynamique faisant intervenir le recrutement de complexes protéiques impliqués dans le remodelage de la chromatine. Parmi eux, mon travail s’est focalisé sur le complexe NuRD (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation) et sa sous-unité de liaison à l’ADN CpG MBD3. Pour cela une approche de biologie structurale intégrative combinant la préparation biochimique, la caractérisation biophysique et l’étude structurale par cryo-EM et cristallographie aux rayons-X a été mise en place. Les caractérisations biophysiques de MBD3 ont permis de mettre en évidence son interaction avec un ADN non-modifié CpG et des cristaux diffractant jusqu’à 3.9 Å ont été obtenu. De plus la région désordonnée en aval du domaine de liaison a été identifiée et son impact dans la formation de complexe caractérisé. Des cristaux pour les différentes constructions en complexe avec l’ADN ont été obtenus et sont actuellement optimisés. Enfin l’optimisation de la purification et la préparation du complexe, ont permis la visualisation du complexe NuRD et mettent en avant pour la première fois une organisation en domaines du complexe.

Nuclear receptors regulate expression of important genes involved in development and homeostasis in eukaryotic cells. While some of them are regulated by the binding of a natural ligand, others, like ERR, are orphan and don’t have any natural ligand identified up to now. ERR binds to ERRE response elements through its DBD on promoter regions of genes and its activity can be modulated by the binding of synthetic antagonist ligands. By an integrative structural biology approach, my thesis work consisted in the study of the structural organization of ERR to understand the antagonism mechanisms induced by the inverse agonist XCT-790, and the adopted topology upon binding to DNA. My project focused on the study of the modular domains DBD and LBD complexes with DNA and ligand and extended to the functional study of the whole receptor. Thanks to significant biochemical work, I set up the purification protocols for these proteins and characterized by biophysics the stability and stoichiometry of the DNA and ligand complexes. This work revealed that XCT-790 binds on each LBD monomer with high affinity and that the DBD interacts to an ERRE as a monomer. Many crystallization trials led to crystals for the LBD and DBD complexes that diffracted respectively up to 3.5 Å and 7 Å of resolution but no structure could be determined. These results allow to conclude that the DBD is monomeric on the ERRE and IR3 and appears to be dimeric on the combined response element ERRE/ERE. The topology adopted by ERR on DNA is guided by the ligand binding and might be the consequence for an allosteric communication between the modular domains. These results provide the basis for a future structure determination of the full ERR by X-ray crystallography and cryo electron microscopy., Les récepteurs nucléaires régulent l’expression des gènes importants pour le développement et l’homéostasie des cellules eucaryotes. Si certains d’entre eux sont activés par la liaison d’un ligand naturel, d’autres, comme le récepteur ERR, sont orphelins et ne possèdent pas de ligand naturel connu à ce jour. ERR se lie via son domaine DBD sur un élément de réponse ERRE au niveau des régions promotrices des gènes et son activité peut être modulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant biochimie, biophysique et cristallographie aux rayons-X, mon travail de thèse consistait en l’étude de l’organisation structurale d’ERR pour comprendre les mécanismes d’antagonisme induits par le ligand agoniste inverse XCT-790, et la topologie qu’il adopte en interagissant avec l’ADN. Mon projet était axé sur l’étude des domaines modulaires DBD et LBD en complexe avec ADN et ligand transposée à l’étude fonctionnelle du récepteur entier. Par un important travail biochimique, j’ai mis en place les protocoles de purification de ces protéines et caractérisé biophysiquement la stabilité et la stœchiométrie des complexes avec ADN et ligand. J’ai mis en évidence que le ligand XCT-790 se lie sur chacun des monomères de LBD avec une forte affinité et que le DBD interagit avec un ERRE sous la forme d’un monomère. De multiples essais de cristallisation ont abouti à l’obtention de cristaux pour les complexes avec le LBD et le DBD ayant diffracté respectivement jusqu’à 3,5 Å et 7 Å de résolution sans néanmoins pouvoir en déterminer les structures. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le DBD est monomérique sur les ERRE et IR3 et semble être dimérique sur l’élément de réponse combiné ERRE/ERE. La topologie qu’adopte ERR sur l’ADN est dictée par la liaison de ligand et serait la conséquence d’une communication allostérique entre les domaines modulaires. Ces connaissances acquises faciliteront la détermination structurale d’ERR entier par cristallographie aux rayons-X ou par cryo-microscopie électronique.

Nuclear receptors regulate expression of important genes involved in development and homeostasis in eukaryotic cells. While some of them are regulated by the binding of a natural ligand, others, like ERR, are orphan and don’t have any natural ligand identified up to now. ERR binds to ERRE response elements through its DBD on promoter regions of genes and its activity can be modulated by the binding of synthetic antagonist ligands. By an integrative structural biology approach, my thesis work consisted in the study of the structural organization of ERR to understand the antagonism mechanisms induced by the inverse agonist XCT-790, and the adopted topology upon binding to DNA. My project focused on the study of the modular domains DBD and LBD complexes with DNA and ligand and extended to the functional study of the whole receptor. Thanks to significant biochemical work, I set up the purification protocols for these proteins and characterized by biophysics the stability and stoichiometry of the DNA and ligand complexes. This work revealed that XCT-790 binds on each LBD monomer with high affinity and that the DBD interacts to an ERRE as a monomer. Many crystallization trials led to crystals for the LBD and DBD complexes that diffracted respectively up to 3.5 Å and 7 Å of resolution but no structure could be determined. These results allow to conclude that the DBD is monomeric on the ERRE and IR3 and appears to be dimeric on the combined response element ERRE/ERE. The topology adopted by ERR on DNA is guided by the ligand binding and might be the consequence for an allosteric communication between the modular domains. These results provide the basis for a future structure determination of the full ERR by X-ray crystallography and cryo electron microscopy., Les récepteurs nucléaires régulent l’expression des gènes importants pour le développement et l’homéostasie des cellules eucaryotes. Si certains d’entre eux sont activés par la liaison d’un ligand naturel, d’autres, comme le récepteur ERR, sont orphelins et ne possèdent pas de ligand naturel connu à ce jour. ERR se lie via son domaine DBD sur un élément de réponse ERRE au niveau des régions promotrices des gènes et son activité peut être modulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant biochimie, biophysique et cristallographie aux rayons-X, mon travail de thèse consistait en l’étude de l’organisation structurale d’ERR pour comprendre les mécanismes d’antagonisme induits par le ligand agoniste inverse XCT-790, et la topologie qu’il adopte en interagissant avec l’ADN. Mon projet était axé sur l’étude des domaines modulaires DBD et LBD en complexe avec ADN et ligand transposée à l’étude fonctionnelle du récepteur entier. Par un important travail biochimique, j’ai mis en place les protocoles de purification de ces protéines et caractérisé biophysiquement la stabilité et la stœchiométrie des complexes avec ADN et ligand. J’ai mis en évidence que le ligand XCT-790 se lie sur chacun des monomères de LBD avec une forte affinité et que le DBD interagit avec un ERRE sous la forme d’un monomère. De multiples essais de cristallisation ont abouti à l’obtention de cristaux pour les complexes avec le LBD et le DBD ayant diffracté respectivement jusqu’à 3,5 Å et 7 Å de résolution sans néanmoins pouvoir en déterminer les structures. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le DBD est monomérique sur les ERRE et IR3 et semble être dimérique sur l’élément de réponse combiné ERRE/ERE. La topologie qu’adopte ERR sur l’ADN est dictée par la liaison de ligand et serait la conséquence d’une communication allostérique entre les domaines modulaires. Ces connaissances acquises faciliteront la détermination structurale d’ERR entier par cristallographie aux rayons-X ou par cryo-microscopie électronique.