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Type IV secretion systems (T4SSs) are able to transport DNA and effector proteins across the inner and outer membranes of prokaryotes. T4SSs consist of a transport complex which forms the channel across the inner and outer membrane, the so called mating pair formation complex (MPF), and DNA processing and transfer proteins (Dtr proteins). A unique T4SS is encoded in the gonococcal genomic island which is found in most Neisseria gonorrhoeae strains. Remarkably, this secretion system is the first T4SSs that was shown to secrete ssDNA during all phases of growth directly into the environment. This property might facilitate functional studies on the transport mechanisms used by T4SSs. Remarkably, the T4SS encoded within the GGI consists of a MPF complex that is homolgous to the MPF complex of the E. coli F-plasmid (MPFF family) and Dtr proteins that belong to the MOBH family of targeting factors. Although many different members of the MOBH family have already been identified, almost no information is currently available on this novel group of targeting factors. To study the conservation of GGI-like T4SSs, similar T4SS were identified in a computational analysis of all currently completely sequenced chromosomes and plasmids. Next to N. gonorrhoeae very similar conserved T4SSs have been found in several other bacteria. These T4SSs are either encoded within the chromosome or on plasmids. Most of the genes encoded in the GGI between the ltgX and exp1 genes, the region which encodes mainly the MPFF proteins, were highly conserved in allmost all of the identified systems, even though, several of theses genes have been shown previously not to be important for ssDNA transport. Remarkably, all identified chromosomal GGI-like T4SSs encode mpf genes of the MPFF family and dtr genes of the MOBH family; whereas, the plasmid encoded GGI-like T4SSs always contain dtr genes of the MOBF family and mpf genes of the MPFF family. This suggests that relaxases of the MOBH family are preferentially found in chromosomally encoded T4SSs. To elucidate the functional mechanism of the DNA processing reaction of this unique DNA secretion system a biochemical approach was set up to functionally characterize the coupling protein TraD, the relaxase TraI and the hypothetical protein Yaf which are different key enzymes of the Dtr proteins of N. gonorrhoeae. The overexpression and purification of coupling proteins and relaxases of other T4SSs has previously been shown to be inherently difficult. Although many different approaches using E. coli as host for a recombinant overexpression have been tested, it was not possible to obtain soluble TraD and large amounts of inclusion bodies were produced. Small amounts of TraD have been detected in isolated inner membranes of E. coli, but all performed solubilization attempts failed. Finally, TraD was isolated and purified from inclusion bodies under denaturing conditions, but all further refolding approaches with the purified protein resulted either in the loss or the aggregation of TraD. Therefore, it was not possible to characterize the enzymatic activity of the neisserial coupling protein TraD. The hypothetical protein Yaf, which is encoded in same operon with traI and traD was sucessfully overexpressed and purified. Interestingly, Yaf forms different oligomeric states in solution. The most abundant oligomer of native Yaf was the dimeric state. The dynamic equilibrium of the different oligomeric states was strongly dependent on the concentration of the protein and the buffer conditions. The interconversion between the different oligomeric states is a slow process. The presence of an N-terminal His-tag strongly stabilized the tetrameric form. Limited proteolysis experiments showed that Yaf is highly resistant against trypsin and most likely has a very compact and stable structure. Tetrameric Yaf showed a higher resistance against proteolytic digestion than dimeric Yaf. Remarkably, the introduction of different point mutations into the sequence of Yaf resulted in a destabilization of the protein and a strong decrease in the amount of soluble protein. Different activity assays have been performed with the purified protein to study the function of Yaf. DNA binding assays showed binding of dimeric and tetrameric Yaf to dsDNA with low affinity (>5 μM). Furthermore, a metal dependent sequence unspecific nuclease activity was observed associated with elution fractions containing dimeric and tetrameric Yaf. This nuclease activity was specific for dsDNA fragments and oligonucleotides that contained secondary structures. In the presence of different divalent metals, a relaxation activity on supercoiled plasmid DNA has been observed for fractions containing dimeric and tetrameric Yaf, and was strongly enhanced in the presence of Mn2+ and Co2+, but was also observed in the presence of Mg2+. To obtain further information on the structure and function of Yaf, crystallization attempts have been started in close collaboration with Dr. S. Smits in the group of Prof. Dr. L. Schmitt (Heinrich Heine University in Düsseldorf). Small crystals of N-terminally His-tagged Yaf diffracted up to 3 Å. Remarkably, no crystals have been obtained for native Yaf in any of the tested conditions. Recentyl, crystals of N-terminal His-tagged Yaf with incorporated selenomethionine have been obtained. To characterize the MOBH relaxase TraI, many different overexpression and purification approaches have been tested. Finally, an overexpression and purification method could be established to purify soluble TraI. Isolated TraI formed stable dimers in solution, and limited proteolysis revealed the presence of at least three trypsin resistant domains in TraI. DNA binding assays showed that TraI binds to ssDNA and dsDNA with high affinity in a sequence unspecific manner. The minimal binding frame of TraI for ssDNA substrates has been determined with 9 nucleotides. Furthermore, a metal dependent sequence unspecific relaxation activity of TraI on supercoiled plasmids has been observed, with Mn2+ as preferred metal cofactor. The relaxation activity of TraI is similar to the activity of E. coli Topoisomerase I, but differs within the preferred metal cofactor and the lack of detectable intermediates during the relaxation reaction of TraI. DNA cleavage assays performed with different ssDNA substrates demonstrated that TraI cleaves oligonucleotides containing the putative oritT sequence of the GGI or the oriT region of the E. coli F plasmid strand specific in a Mn2+ dependent manner. The complementary strands and a polyT oligonucleotide were not cleaved by TraI. Analysis of the putative cleavage sites did not show any sequence similarity between both cleaved oligonucleotides. To obtain structural information about TraI, crystallization attempts in close collaboration with Dr. S. Smits in the group of Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine University in Düsseldorf) were started. Besides the characterization of the enzymatic activity of TraI and Yaf, pull down assays were performed to test whether these proteins interact with each other or with the T4SS ATPase TraC. Unfortunately, no protein-protein interactions were detected between these three proteins. The experimental results from the current study help to understand the DNA processing mechanism of the unique T4SS of N. gonorrhoeae. Important steps have been made in the functional overexpression and the purification of Yaf and TraI. The hereby obtained results from the biochemical characterization of TraI represent the first reported biochemical data which is available on the novel MOBH relaxase family. Furthermore, this study revealed first insights into a possible enzymatic activity of the previously uncharacterized hypothetical protein Yaf, even though the function of this protein still remains unknown.

Metatranscriptomics is a state-of-the-art technique to elucidate the functional activities of microbial communities, but its application is still limited to marine microbial assemblages. In my PhD project, we established the complete approach of soil metatranscriptomics, involving RNA extraction, cDNA library preparation by random priming, 454-pyrosequencing, and bioinformatic data analysis. The approach was tested on microbial communities in the oxic surface layer and the anoxic bulk soil of flooded rice paddy soil microcosms. Total RNA was recovered in high integrity and purity by low-pH phenol extraction (pH 5.0) followed by Q-Sepharose column chromatography. We were able to enrich mRNA sequences up to 50-70% in the metatranscriptome libraries using Ribo-Zero™ rRNA removal kit (Meta-Bacteria). All the 454 reads obtained were preprocessed prior to data analysis to minimize sequence ambiguities. A total of 10,000 SSU-ribotags (total RNA) were analyzed to elucidate community composition in the oxic and anoxic zones at three different incubation time points (25, 45 and 90 days after transplantation of rice seedlings). Additionally, about 45,000 and 12,000 mRNA-tags (enriched mRNA) were obtained for the analysis of functional activities in, respectively, the oxic and anoxic zone of 90-day-old rice microcosms. SSU-ribotag data analysis revealed no major temporal changes in community composition except for Geobacter, Clostridia and methanogens in the anoxic bulk soil. However, the taxonomic composition of microbial communities was clearly distinct between the oxic and anoxic zones, with cyanobacteria being the dominant group in the surface layer. Although mRNA-tags related to basic cellular functions were most abundant in both mRNA datasets, the expression of specific functions in response to different oxygen conditions was observed such as, for example, methane oxidation in the oxic zone and methanogenesis in the anoxic zone. Our metatranscriptomic approach provides a means to analyze the composition and functional gene expression of complex soil microbial communities while avoiding the limitations of PCR-based approaches., Metatranskriptomik ist eine ‘state-of-the-art’ Technik um die funktionellen Aktivitäten mikrobieller Gemeinschaften aufzuklären. Die Anwendung hat sich bis auf wenige Ausnahmen bis jetzt auf marine Lebensräume fokussiert. In meiner Doktorarbeit haben wir den gesamten Ablauf der Metatranskriptomik, einschließlich RNA Extraktion, Vorbereiten von cDNA Bibliotheken mittels Zufalls-priming, 454 Pyrosequenzierung und bioinformatische Analyse für terrestrische Lebensräume etabliert. Der gesamte, entwickelte Ablauf wurde bezogen auf mikrobielle Gemeinschaften in oxischer- und anoxischer Erde von Reisbodenmikrokosmen umfassend getestet. Gesamt-RNA von hoher Integrität und Reinheit konnte bei einem pH Wert von 5 mittels Phenolextraktion kombiniert mit Q-Sepharose Säulenchromatographie gewonnen werden. Durch Anwendung des Ribo-Zero ™ rRNA removal kits (Meta-Bacteria) war es uns möglich mRNA bis zu einem Grad von 50-70% in unseren Metatranskriptombibliotheken anzureichern. Alle erhaltenen 454 reads sind vor der eigentlichen Datenverarbeitung vorverarbeitet worden um potentielle Unklarheiten auszuräumen. Insgesamt 10,000 SSU-ribotags (Gesamt-RNA) sind analysiert worden um die Gemeinschaftsstruktur in den oxischen und anoxischen Zonen an drei unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten (25, 45 und 90 Tage, nach dem Pflanzen von Reiskeimlingen) aufklären zu können. Zusätzlich konnten 45,000 beziehungsweise 12,000 mRNA-tags (angereicherte mRNA) für die Analyse funktioneller Aktivitäten, bezogen auf die oxische und anoxische Zone 90 Tage alter Reismikrokosmen gewonnen werden. Die Analyse der SSU-ribotags hat keine gravierenden Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaften gezeigt, mit Ausnahme von Geobacter, Clostridien und Methanogenen in der anoxischen Zone. Nichtsdestotrotz konnte belegt werden das klare taxonomische Unterschiede zwischen der oxischen und anoxischen Zone vorliegen, wobei Cyanobakterien die dominierende Gruppe der oxischen Zone darstellen. Obwohl mRNA-tags bezogen auf grundlegende zelluläre Funktionen das Gros in beiden Datensätzen ausmachten, konnten spezifische Funktionen in Abhängigkeit zur Verfügbarkeit von Sauerstoff gezeigt werden. So zum Beispiel Zusammenfassung VI Methanoxidierung in der oxischen Zone und Methanogenese unter anoxischen Bedingungen. Der von uns etablierte Ansatz der Metatranskriptomik stellt ein nützliches Mittel dar um die Zusammensetznung und funktionelle Genexpression von komplexen, terrestrischen mikrobiellen Gemeinschaften untersuchen zu können, ohne den Beschränkungen PCR-basierter Techniken zu unterliegen.

In seinem natürlichen Lebensraum ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Durch komplexe Regulations- sowie Differenzierungsprozesse (Biofilm-Formation, Sporulation) besitzt dieses Bakterium die Fähigkeit, sich an diverse Stresssituationen anzupassen. Die Verfügbarkeit von Wasser ist ein Beispiel für einen solchen Stressfaktor. Als eine zentrale Anpassungsstrategie an hyperosmotische Kulturbedingungen, konnte in B. subtilis die Akkumulation von kompatiblen Soluten durch Synthese und Aufnahme identifiziert werden. In Transkriptom-Analysen hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurden jedoch zahlreiche Gene identifiziert, die unter Hochsalz Bedingungen eine Induktion in der Genexpression zeigten. Interessanterweise kristallisierte sich bei der Analyse dieser Transkriptom-Daten eine Gruppe von Genen heraus, denen eine Beteiligung am Zellwandmetabolismus zugesprochen werden konnte. Beispiele dafür sind die Gene yqiH sowie yqiI. Das Gen yqiH kodiert vermutlich für ein Lipoprotein, wohingegen das Protein YqiI Sequenzähnlichkeiten zu der Enzymklasse der N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidasen aufweist. Diese Enzyme gehören zu der Gruppe der Zellwandhydrolasen (Autolysine), die in wichtige zelluläre Prozesse involviert sind. Mit Hilfe der Zymographie konnte im Verlauf dieser Arbeit die hydrolytische Fähigkeit für das Protein YqiI in vitro bestätigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Kultivierung von B. subtilis unter hyperosmotischen Bedingungen zu einer drastischen Veränderung in der Zellmorphologie führte, die ausschließlich während der Anpassungsphase auftrat. Die Ergebnisse der Transkriptom-Analysen und auch die Beobachtung der morphologischen Veränderungen führten zu der Hypothese, dass die Restrukturierung der Zellhülle eine neue Facette in der Adaptation von B. subtilis an hochsaline Bedingungen darstellen könnte. Um eine mögliche Beteiligung der Proteine YqiH sowie YqiI zu untersuchen wurden, diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit einer biochemischen, physiologischen sowie regulatorischen Charakterisierung unterzogen. Durch eine RT-PCR-basierende Methode konnte eine Co-Transkription der yqiHI Gene mit einem weiteren Gen yqiK erstmals gezeigt werden. Die Charakterisierung einer yqiHIK Deletionsmutante zeigte unter normalen physiologischen sowie hyperosmotischen Bedingungen eine Wachstums-verzögerung im Vergleich zum Wildtyp, was alleinig auf das Fehlen der Amidase YqiI zurückgeführt werden konnte. Darüber hinaus konnte ausgeschlossen werden, dass die YqiHIK Proteine wesentlich an der Restrukturierung der Zellwand beteiligt sind. Durch Reportergenstudien wurde die osmotische Induktion des yqiHIK Operons näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Expression des yqiHIK Genclusters nur bei sehr hohen NaCl-Konzentrationen erfolgte (> 0,7 M NaCl). Die Expression wird dabei über einen SigA-Promotor vermittelt, der mit Hilfe einer Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte und ferner einer detaillierten Mutagenese-Studie unterzogen wurde. Verkürzungen in der yqiHIK Promotorregion führten zu der Identifikation einer AT-reichen Region, die kritisch für die Induktion des Operons unter hohen osmotischen Bedingungen war. Diese AT-reiche Region wurde als mögliche Binderegion für den Regulator DegU aus B. subtilis wiedererkannt. Die Beteiligung des Zwei-Komponenten-Systems DegS/DegU an der Induktion der Expression des yqiHIK Operons unter salinen Bedingungen, stellte dabei ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit dar, wobei somit erstmalig ein Hinweis darauf gegeben wurde, wie die Zelle in der Lage ist, hohe NaCl-Konzentrationen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Neben der Induktion des yqiHIK Operons unter hyperosmotischen Bedingungen wurden im Verlauf dieser Dissertation noch zwei weitere regulatorische Besonderheiten dieses Genclusters aufgedeckt. Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine Induktion der Expression des yqiHIK Operons direkt nach Initiation der Sporulation erfolgte. Dabei wurde eine Beteiligung des SinR Regulators nachgewiesen, welcher auch die Expression dieses Operons unter normalen Wachstumsbedingungen verhindert. Darüber hinaus konnte eine Erhöhung der Transkription des yqiHIK Genclusters in der sogenannten „Todeszone“ beobachtet werden. Für beide dieser regulatorischen Aspekte wurde eine Beteiligung des zuvor identifizierten SigA-Promotors ausgeschlossen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden somit drei physiologische Prozesse aufgedeckt, an denen die Genprodukte des yqiHIK Operons beteiligt zu sein scheinen, wobei die Transkription des yqiHIK Genclusters über mindestens zwei unterschiedliche Promotoren erfolgt. Zusätzlich wurden zwei Transkriptionsfaktoren identifiziert, die die Expression des yqiHIK Operons kontrollieren. Die Regulation des yqiHIK Operons ist ein gutes Beispiel dafür, wie facettenreich Bakterien ihre Umwelt wahrnehmen und genetisch darauf reagieren können.

Das Nukleoprotein der Arenaviren erfüllt zentrale Aufgaben im viralen Replikationszyklus. Dazu gehört die Enkapsidierung des viralen Genoms und die Regulation von Transkription und Replikation sowie die Interaktion mit dem Matrixprotein und die Inhibition der Typ I Interferon-Antwort. Über die Homo-Oligomerisierung des Nukleoproteins, ihre Bedeutung für diese vier Aufgaben sowie die hierfür notwendigen Domänen innerhalb des Nukleoproteins war bisher nichts bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das Nukleoprotein in Abwesenheit viraler RNA zu symmetrischen, ringförmigen Trimeren zusammenlagert. Die Bildung dieser Trimere ist unabhängig von posttranslationalen Modifikationen und ist innerhalb der Arenaviren konserviert. Mutationsanalysen ergaben, dass Bereiche innerhalb der N- und der C-terminalen Domäne kritisch für die Trimerisierung des Nukleoproteins sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Oligomerisierung des Nukleoproteins eine Grundvorraussetzung für seine Funktion bei der Replikation und Transkription des viralen Genoms ist. Im Gegensatz dazu spielt sie bei der Interaktion des Nukleoproteins mit dem Matrixprotein und für die Fähigkeit des Nukleoproteins zur Inhibition der Typ I Interferon-Antwort keine Rolle. Vermutlich wird das Nukleoprotein der Arenaviren durch Wirtszell-spezifische Proteasen verkürzt. Die dabei entstehenden, großen Spaltfragmente liegen als Monomere vor und könnten in der infizierten Zelle die Funktion als Interferon-Antagonist übernehmen, während ungespaltenes Nukleoprotein für die Replikation, Transkription und Enkapsidierung des viralen Genoms verwendet wird. Das Nukleoprotein sorgt durch seine Interaktion mit dem Matrixprotein für den Einbau des viralen Genoms in neu entstehende Virionen. In dieser Arbeit wurden die dafür verantwortlichen Aminosäurebereiche auf kurze Bereiche innerhalb der C-terminalen Proteindomäne des Nukleoproteins eingegrenzt. Anhand dieser Untersuchungen wurde ein Modell für die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein an der Virusmembran aufgestellt. Vergleichende Studien zwischen den Nukleoproteinen und Matrixproteinen verschiedener Arenaviren ergaben zudem, dass heterotypische Interaktionen nur zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein nahe verwandeter Arenaviren möglich sind. Die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein wurde somit als Faktor identifiziert, der die die Bildung von Arenavirus-Reassortanten stark einschränkt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen der Homo-Oligomerisierung und den biologischen Funktionen des Nukleoproteins aufgezeigt werden. Darüber hinaus wurden funktionelle Domänen für die NP-NP-Interaktion und die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein innerhalb des Nukleoproteins identifiziert.

Feuchtgebiete stellen wichtige Quellen und Senken von klimawirksamen Treibhausgasen wie Kohlendioxid (CO2) und Methan (CH4) dar. Rhizodeposition von Pflanzen ist eine wichtige Kohlenstoff- und Nährstoffquelle für die im Boden lebenden Mikroorganismen und fördert den anaeroben Abbau von organischem Material durch hydrolytische, fermentative und methanogene Gemeinschaften. Bisher ist jedoch wenig über die biotischen und abiotischen Faktoren bekannt, die die Kohlenstoffumsetzung in der Rhizosphäre von Hydrophyten beeinflussen. Diese Arbeit befasst sich mit den Kohlenstoffflüssen im komplexen System Boden-Pflanze und den zugrundeliegenden biogeochemischen Prozessen um den Einfluss der mikrobiellen Vielfalt auf die Funktionen des Ökosystems zu erforschen. Das Mikrobiom der Reiswurzel wurde in gefluteten Mikrokosmen basierend auf einem Sand-Vermikulit-Gemisch durch Zugabe von sieben ausgewählten Böden aus verschiedenen Ökosystemen gezielt manipuliert. Mit Hilfe von 13C-Pulsmarkierung und molekularen Analysen wurde der Kohlenstofffluss zwischen Atmosphäre, Pflanze und Boden und die mikrobiellen Gemeinschaften in der Rhizosphäre untersucht. Die Translokation von Kohlenstoff (C) und die Emission von Methan wurden zu verschiedenen Wachstumsstadien der Reispflanze in italienischem Reisfeldboden mit reduziertem und sterilem Boden untersucht und die Bedeutung der Bodentypen auf die Biomasseproduktion und den Kohlenstoffzyklus bewertet. Die 13C-Pulsmarkierung von Reismikrokosmen ermöglichte es ausschließlich den aus der Pflanze stammenden Kohlenstoff zu markieren und dessen Dynamik im geschlossenen System zu studieren. Insgesamt verblieb unabhängig vom Bodentyp der überwiegende Teil des assimilierten Kohlenstoffs in oberirdischen Pflanzenorganen, etwa 10% wurden in die Wurzel eingebaut und weniger als 2% fanden sich im Boden wieder. Allerdings war in sterilem Boden die Verlagerung des assimilierten 13C unter die Bodenoberfläche deutlich geringer. Die Anreicherung an 13C in den verschiedenen Kohlenstoffpools wurde durch den Bodengehalt und das Wachstumsstadium der Pflanze bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass wurzelbürtiger Kohlenstoff eine bedeutende Methanquelle darstellt, welche je nach Bodentyp bis zu 7% des in fünf Tagen emittierten Methans ausmachen kann. Zudem wurde die Biomasseproduktion der Reispflanzen durch den Bodentyp beeinflusst und korrelierte mit der Methanemission aus italienischem Reisfeldboden. Die Abundanz der Archaea veränderte sich mit fortschreitendem Entwicklungsstadium der Pflanze und stand im direkten Zusammenhang mit der Methanemission aus frischen Photosyntheseprodukten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Wurzelausscheidungen und das zahlenmäßige Vorkommen von Mikroorganismen in der Rhizosphäre kritische Faktoren für die Methanemission insbesondere während der späten vegetativen und der reproduktiven Wachstumsphase der Pflanze sind. Die sieben Böden aus fünf verschiedenen Ökosystemen unterschieden sich nicht nur in ihren allgemeinen Bodeneigenschaften, sondern auch in ihrer archaeellen (16S rRNA) und methanogenen (mcrA) Gemeinschaft mit unterschiedlich stark ausgeprägten potentiellen Methanproduktionsraten. Multivariate Analysen zeigten, dass sich die archaeellen und methanogenen Populationsmuster in der Rhizosphäre veränderten, wenn die Böden zum Animpfen von Reismikrokosmen eingesetzt wurden. Das Mikrobiom der Wurzeln war durch eine diverse mikrobielle Gemeinschaft gekennzeichnet, wobei bestimmte archaeelle und methanogene Gruppen charakteristisch für die Rhizosphäre der Reispflanzen waren. Da diese Mikroorganismen nicht in den ursprünglichen Böden detektierbar waren, könnten sie entscheidend für die unterschiedlichen Methanemissionsraten aus wurzelbürtigem Kohlenstoff sein. Eine Kanonische Korrespondenzanalyse ergab, dass die Unterschiede in der methanogenen Rhizosphärengemeinschaft hauptsächlich auf den Kohlenstoff- und Nährstoffgehalt der verschiedenen Böden sowie die Pflanzenbiomasse zurückzuführen waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl die Pflanze als auch der Bodentyp die Zusammensetzung des Mikrobioms der Reiswurzel und die Methanemission aus Photosyntheseprodukten steuern. Zusammenfassend zeigte die Arbeit, dass sowohl das Wachstumsstadium der Pflanze, als auch der Bodengehalt und der Bodentyp die Verteilung von frisch assimiliertem Kohlenstoff in überschwemmten Reispflanzen, die Kohlenstofftranslokation in die Rhizosphäre und die Gasemission in die Atmosphäre entscheidend prägten. Die im Boden lebenden Mikroorganismen als treibende Kraft der globalen Stoffkreisläufe beeinflussen nachhaltig den Kohlenstofffluss in Feuchtgebieten und die Produktion der klimarelevanten Spurengase CO2 und CH4., Wetlands are important sources and sinks of effective greenhouse gases including carbon dioxide (CO2) and methane (CH4). Rhizodeposition by plants plays an essential role in carbon and nutrient supply for the soil microbiota and stimulates anaerobic decomposition of organic material by hydrolytic, fermenting and methanogenic microorganisms. However, little is known about the biotic and abiotic factors influencing the carbon turnover in the rhizosphere of wetland plants. This thesis focuses on the biogeochemical processes involved in carbon cycling of complex plant-soil systems to link microbial community structure to ecosystem functioning. Flooded rice microcosms were generated based on sand-vermiculite inoculated with seven soils from different ecosystems to manipulate the root microbiome. Using 13C pulse-labeling and molecular analyses, the carbon translocation from the atmosphere through the plant into the soil and back to the atmosphere as well as the microbial communities were studied in order to explore the impact of rice growth stages on C translocation and CH4 emission in Italian paddy soil in comparison to reduced soil content and sterile soil, and to evaluate the effect of the seven soils on plant biomass production and carbon cycling. The application of isotopic pulse-labeling allowed tracing the carbon that exclusively derived from recent plant photosynthates. Overall, the majority of freshly assimilated C remained in aboveground plant biomass, about 10% was allocated into the roots and less than 2% was recovered in soil organic matter independently from the soil type; however, sterile soil strongly inhibited belowground 13C translocation. The 13C enrichment in the different C pools was affected by the soil content and the plant growth stage and revealed that recently plant-assimilated carbon was an important source for methanogenesis accounting for up to 7% of the total CH4 emitted within five days depending on soil type. Rice biomass production was affected by the soil type and was positively correlated with CH4 emission in Italian paddy soil. The abundance of archaeal communities changed in response to plant developmental growth stage and was correlated with the amount of emitted 13CH4 that was exclusively derived from fresh photosynthates. These findings indicate that rhizodeposition and microbial abundances in the rhizosphere were critical for the emission of methane especially during the late vegetative and reproductive stages of rice plants. The seven soils covering five different ecosystem types not only differed in the main soil characteristics, but also contained distinct archaeal (16S rRNA) and methanogenic (mcrA) populations and exhibited different CH4 production potentials. Multivariate analyses demonstrated that the archaeal and methanogenic fingerprints were also distinct in the rice rhizosphere when soils were used for generating rice-planted microcosms. The root microbiome was characterized by a highly diverse community where characteristic archaeal and methanogenic groups were detected in the rice rhizosphere. These microorganisms were not detected in the original soils and thus could be critical for the different rates of emitted 13CH4 observed. Canonical correspondence analysis indicated that the differences in methanogenic communities colonizing the rice rhizosphere were mainly attributed to the carbon and nutrient content of the inoculated soils and to the plant biomass. These results suggest that plant and soil factors cooperatively shape the root microbiome and affect methane emission from fresh photosynthates. Collectively, the study revealed that allocation of freshly assimilated carbon in submerged rice plants, C translocation into the rhizosphere and gas emission to the atmosphere were affected by both the plant growth stage, and also by the amount and type of soil in which the rice plants grew. The soil-inhabiting microorganisms as principle drivers of global nutrient cycles have an important impact on carbon translocation between hydrophytic plants and wetland soils and influence the emission of the climate-relevant trace gases CO2 and CH4.

The methanotrophic bacteria are the only known biological sink for the third most important greenhouse gas methane, performing an important ecosystem function influencing global climate change. In the soil surface layer of water logged soils aerobic methanotrophs thrive at the oxic-anoxic interface attenuating the amount of potentially emitted methane. The highly diverse methanotroph community is shaping the interface characterized by overlapping methane and oxygen gradients by their own activity. However, how the different methanotrophs physically share their microhabitat at the interface is unknown. Here we highly resolved the vertical distribution and activity of methanotrophs at the interface. To assess the structure of the present and active methanotroph community the particulate methane monooxygenase gene pmoA was used as a functional and phylogenetic marker. For quantification of pmoA genes and transcripts a new method, the competitive-(reverse transcriptase)-t-RFLP was established. Only a subset of the methanotroph community was shown to be active and the major activity was confined to a small zone around the interface. The predominantly active methanotrophs were affiliated to Methylobacter and no transcripts of type II methanotrophs (Methylosinus, Methylocystis) were found. Hence, different species within this guild exploited different niches in the same microenvironment. Furthermore, the methanotrophs resistance to desciccation (up to 18 years) was tested. Longer-lasting droughts reduced methanotrophic diversity, and adversely affected methane oxidation upon rewetting. Type I methanotrophs showed relatively higher pmoA gene expression, while type II were more resistant to desiccation. Finally, we showed that high methane source strength aids the ability of the methanotroph community to recover from the effect of a strong disturbance. However, recovery of the type II community was independent of pmoA gene expression and source strength indicating facultative growth. Overall, the methanotroph community in the soil surface layer is highly diverse. This work contributed to understand the high and apparently redundant diversity by unravelling niche differentiation at the fine spatial resolution and evaluating the effect of different source strength. Moreover, the range of alternative substrates used for growth seems to be another important factor in the environment.

Die Koordination von Wachstum und Differenzierung als Antwort auf verschiedene Signale und Umweltbedingungen ist eine grundlegende Eigenschaft von Organismen. Hierbei erfordern die Anpassung von Zellteilungszyklus und Stoffwechsel und morphologische Änderungen eine spezifische Regulation der Genexpression mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren. Eine zentrale Frage ist, welche Kombinationen von Transkriptionsfaktoren an welchen Promotoren bei der Regulation von Wachstum und Differenzierung überhaupt eine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde exemplarisch die kombinatorische und promotorspezifische Kontrolle des TEA-Transkriptionsfaktors Tec1 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Tec1 ist zusammen mit dem Transkriptionsfaktor Ste12 an der Regulation der Differenzierungsprogramme Biofilmbildung und Konjugation beteiligt und wird unter anderem über den Fus3/Kss1-MAPK-Signalweg gesteuert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Komplexbildung von Tec1 und Ste12 analysiert. Es stellte sich heraus, dass Tec1-Zielgene in eine Ste12-abhängig und in eine Ste12-unabhängig regulierte Klasse eingeteilt werden können. Ste12 kann die Stabilität von Tec1 über dessen C-terminale Domäne regulieren, die zudem eine Ste12-unabhängige Transkriptionsaktivierungsdomäne enthält. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Co-Regulatoren Msa1 und Msa2 als neue Interaktionspartner von Tec1 identifiziert. Tec1, Msa1 und Msa2 regulieren gemeinsam zelluläre Differenzierungsprogramme wie Biofilmbildung und Konjugation. Zudem wirken sie auf den Zellteilungszyklus und die Ribosomensynthese. Dies sind Prozesse, die das Wachstum und die Zellgröße beeinflussen. Tec1, Ste12, Msa1 und Msa2 können verschiedene Komplexe ausbilden und in unterschiedlichen Kombinationen an gemeinsam regulierte Promotoren binden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt den Aufbau und die Validierung eines Mess-systems, mit dessen Hilfe man in lebenden Zellen die Signaltransduktionsdynamik im Fus3/Kss1-MAPK-Modul unter verschiedenen Bedingungen quantitativ messen kann. Dies geschieht durch Bestimmung von Menge, Lokalisierung und programm-spezifischer Aktivität der Regulatoren Tec1, Ste12, Dig1 und Dig2 mittels Fluoreszenz-mikroskopie.

Histidine-aspartate signaling systems are used by bacteria, archaea and eukarya to integrate stimuli over time and space generating coordinated, fine-tuned cellular responses. A hallmark feature is the high modularity of the signaling protein modules which can form simple ’two-component‘ systems, and also sophisticated ’multi-component’ systems. The deltaproteobacterium Myxococcus xanthus contains a large repertoire of signaling proteins, many of which regulate its complex multicellular developmental program. In this respect, one important systems is the Esp signaling system, consisting of the hybrid histidine protein kinase, EspA, two serine/threonine protein kinases (PktA5 and PktB8), and a putative transport protein (EspB). In the presented study, I assign an orphan hybrid histidine protein kinase, EspC, to the Esp signaling system which negatively regulates progression through the M. xanthus developmental program. The genetic analysis revealed that EspC is an essential component of this system, because ΔespA, ΔespC, and ΔespAΔespC double mutants shared an identical early developmental phenotype. Surprisingly, disruption of EspC’s auto-phosphorylation in vivo did not produce a mutant developmental phenotype, whereas substitution of its phospho-accepting residue within the receiver domain resulted in the null phenotype. Furthermore, it is shown that although the EspC histidine kinase could efficiently autophosphorylate in vitro, it did not act as a phospho-donor to its own receiver domain. Instead, both, in vitro and in vivo analyses elucidated that the phospho-donor instead is EspA’s histidine kinase. Therefore, EspA and EspC participate in a novel hybrid histidine protein kinase signaling mechanism involving both inter- and intraprotein phosphotransfer. This inter- and intraprotein phosphotransfer results in the combined phosphorylation of EspA’s and EspC’s receiver domains which represents the output of the Esp signaling system. Further genetic analyses suggested that this Esp system is regulated on the level of its phosphatase activity, likely involving the sensing domains of EspC for regulation. Finally, I uncovered that the Esp system stimulates the proteolytic turnover of MrpC, a crucial transcription factor of the developmental program, via as yet unidentified serine protease. Altogether, these data unravel a novel signaling mechanism of His-Asp signaling systems, and thus expand the knowledge about the complexity and plasticity of these crucial signal transduction systems.

Der mutualistische Wurzelendophyt Piriformospora indica besitzt die Fähigkeit eine Vielzahl unterschiedlicher Pflanzen, einschließlich der monokotylen Gerste (Hordeum vulgare) und der dikotylen Modelpflanze Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), zu besiedeln. Die Besiedelung sowohl von Ackerschmalwand als auch von Gerste ist durch eine Besiedlungsstrategie charakterisiert, welche sich in zwei Phasen unterteilt: einer initialen, biotrophen Interaktion und einer, sich daran anschließenden, Zelltot- assoziierten Phase. Im Verlauf beider Phasen können Pilzhyphen inter- und intrazellulär beobachtet werden. Das Pilzwachstum beschränkt sich hierbei jedoch auf die Cortexzellen der Wurzel, eine Besiedelung von Endodermis oder Zentralzylinder konnte nie beobachtet werden. Die Besiedlung der Wurzelzellen durch P. indica ist dabei oft mit vorteilhaften Effekten für den Wirt assoziiert, wie zum Beispiel Wachstumsförderung und Änderungen der Wurzelmorphologie. Das breite Wirtsspektrum und die positiven Effekte für den Wirt lassen auf eine generelle Interaktionsstrategie schließen, bei der Proteine des Pilzes mit pflanzlichen Signalwegen interagieren, die in vielen verschiedenen Pflanzenarten vorkommen. Ein solcher Mechanismus könnte der Eingriff von P. indica in die Phytohormonbiosynthese sein. Hierzu konnte kürzlich gezeigt werden, dass Phytohormone neben ihrer Rolle als Regulatoren von Entwicklungsprozessen in Pflanzen auch an der Pflanzenabwehr beteiligt sind. Des weiteren wurde bereits die Sekretion von Indol-3-Essigsäure (IAA) in das Wachstumsmedium durch P. indica beschrieben. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Produktion von IAA aus Tryptophan in P. indica durch eine Reihe biochemischer und molekularer Methoden charakterisiert. Die Hauptziele lagen dabei auf einer funktionellen Untersuchungen der IAA Biosynthese in P. indica und welche Auswirkung diese auf die Kompatibilität während der biotrophen Interaktion von P. indica mit Gerstenwurzeln haben. Hierfür wurden geeignete molekulare Methoden für den Gebrauch in P. indica etabliert und optimiert. Zu diesen gehören eine PEG-vermittelte genetische Transformation, sowie ein GFP-Reporter- und ein RNA-Interferenz (RNAi) System. Mittels zeitabhängiger Analyse der Transkriptionsrate nach Zugabe von Tryptophan, konnte das Tryptophan-Aminotransferase Gen piTam1 als Kandidat für die Beteiligung an der IAA-Produktion in P. indica identifiziert werden. Die Untersuchung des piTam1 Promoters durch ein GFP-Reporter System sowie transkriptionelle Analysen des Genes in besiedelten Gerstenwurzeln, verifizierten die Aktivierung der piTam1 Expression während der biotrophen Phase. Durch Suppression dieser Expression mittels RNA-Interferenz (RNAi) wurde piTam1 als Schlüsselgen in der Umwandlung von Tryptophan in Indol-3-Pyruvat (IPA) identifiziert, welches den ersten Schritt in der Produktion von Auxin aus Tryptophan darstellt. RNAi Transformanden, deren Auxin-Produktion gehemmt war, zeigten ein weniger kompaktes Koloniewachstum und unterschieden sich in ihrer Fähigkeit Indol-3-Acetaldehyd (IAD) umzusetzen. Zusätzlich führte die gehemmte IAA-Biosynthese zu einer verminderten Besiedlung von Gerstenwurzeln durch P. indica während der ersten drei Tage der Interaktion, wobei jedoch die wachstumsfördernden Effekte nicht beeinflusst wurden. Konsequent, ein erhöhter Gehalt an freiem IAA und Indol-3-Lactat (ILA) einem Nebenprodukt der IAA Biosynthese in P. indica, konnten in besiedelten Wurzeln im Vergleich zu Kontrollwurzeln beobachtet werden. Obwohl 3 Tage nach Inokulation mit P. indica eine erhöhte IAA Konzentration in planta gemessen wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die beobachteten Unterschiede lediglich durch pilzliches IAA verursacht wurden. Dies lässt eine Akkumulation von pilzlichen und pflanzlichen IAA vermuten und stimmt mit den Änderungen der IAA Signalübertragung und der Biosynthese im Gerste-Transkriptom zu diesem Zeitpunkt überein., The mutualistic root endophyte Piriformospora indica has the ability to colonize a wide range of plants including the monocot barley (Hordeum vulgare) and the dicot model plant Arabidopsis thaliana. The colonization of both, Arabidopsis and barley is characterized by a biphasic colonization strategy with an initial biotrophic interaction followed by a cell death associated phase. During both phases fungal inter- and intracellular growth is restricted to the root cortex cells and can never be observed in the endodermis or the central cylinder. The colonization of root cells by P. indica is often associated with beneficial effects to the host, such as growth promotion and changes in root morphology. The broad host range and the widely conferred benefits to the hosts suggest that the beneficial outcome could be based on general mechanisms and signaling pathways common to many different plant species. One such mechanism could be the recruitment of phytohormone pathways by P. indica. Beside their function in plant developmental processes, phytohormones were recently described to be involved in plant defence responses. Secretion of indole-3-acetic acid (IAA) by P. indica into the growth medium has already been reported. In this PhD study a tryptophan dependent IAA production pathway was identified in P. indica using biochemical and molecular methods. The main goals were focused on the functional analyses of the P. indica tryptophan dependent IAA pathway and how this may affect compatibility during the biotrophic interaction between P. indica and barley roots. For this, suitable molecular tools such as a PEG-mediated genetic transformation, a GFP reporter and an RNAi-mediated silencing system were established or optimized for use in P. indica. Time course transcriptional analyses after exposure to tryptophan designated the tryptophan aminotransferase piTam1 gene as the top candidate gene involved in the production of IAA in P. indica. A green fluorescence protein (GFP) reporter study and transcriptional analysis of colonized barley roots showed that piTam1 is induced during the biotrophic phase. Via an RNAi-mediated gene silencing piTam1 was identified as a key gene involved in the first step of auxin biosynthesis. RNAi transformants impaired in auxin production were characterized by a less compact colony growth phenotype and differences in their ability to utilize indole-3-acetaldehyde (IAD). Additionally, silencing of the piTam1 gene resulted in a reduced P. indica colonization of barley roots at 3 days after inoculation (dai) but the elicitation of growth promotion was not affected compared with barley colonized by the P. indica wild-type strain. Consistently an increased amount of free IAA and free indole-3-lactate (ILA), a byproduct of P. indica IAA biosynthesis pathway, could be detected in P. indica colonized barley roots compared to non colonized control plants at this time point Given the large amount of IAA detected in planta at 3 dai and the amount of IAA produced by P. indica in culture after tryptophan induction, it is unlikely that the differences in free IAA levels observed in planta are merely derived from fungal IAA. This suggests a local accumulation of both fungal and plant IAA during the initial biotrophic phase and is consistent with changes in IAA signaling and biosynthesis observed in barley transcriptome at this time point.

Diatomeen besitzen zwei divergente eukaryote Cytoplasmen: (i) das Cytosol der Wirtszelle, und (ii) das periplastidäre Kompartiment (PPC), welches das reduzierte Cytoplasma eines rhodophytischen Endosymbionten (komplexe Plastide) darstellt. Letzteres findet sich bei einer Vielzahl ökologisch höchst relevanter Mikroalgen und pathogener Protisten (Apicomplexa), welche komplexe Plastiden mit vier Hüllmembranen besitzen. Über die Proteinzusammensetzung und Funktion des PPC war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinkomposition des PPC der Diatomee Phaeodactylum tricornutum über einen kombinierten in silico/in vivo Ansatz untersucht. PPC-Kandidaten wurden dabei anhand der Präsenz spezifischer N-terminaler Zielsteuerungssequenzen genomisch identifiziert und über die Expression von eGFP-Fusionsproteinen auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Insgesamt konnten dadurch in dieser Arbeit 29 neue PPC-Proteine detektiert werden, welche sowohl bereits bekannte Funktionen im PPC, wie Proteintransport (SELMA), Proteinfaltung und Metabolismus, ergänzen, als auch auf bisher unbekannte putative Prozesse im PPC hindeuten. Insbesondere sind dabei Proteolyse und Degradation, Plastidenteilung, Lipidtransfer und eine potentielle strukturelle Organisation zu nennen. In gleichem Maße relevant sind Prozesse, die im Zuge bioinformatischer Analysen nicht im PPC der Diatomee detektiert werden konnten, was für klassische eukaryote Cytoskelett- und Vesikelkomponenten, sowie typische Signaltransduktionsfaktoren zutrifft. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass es sich beim PPC von P. tricornutum um ein auf natürliche Weise minimiertes eukaryotes Cytoplasma mit stark begrenzten metabolischen und zellulären Kapazitäten handelt, welches mit einem autonomen eukaryoten Cytoplasma nur wenige Gemeinsamkeiten aufweist und dessen Funktion höchstwahrscheinlich vor allem der Selbsterhaltung und Homöostase der ehemals primären Plastide dient. Ein weiteres Thema dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung und Lokalisation von Metabolittranslokatoren in P. tricornutum, die eine Verbindung zwischen den Stoffwechselprozessen von Wirt und Symbiont ermöglichen. Dabei gelang es mittels in silico Analysen und anschließenden in vivo GFP-Lokalisationsstudien mehrere putative Triosephosphat/Phosphat Translokatoren in den Membranen der komplexen Plastide von P. tricornutum nachzuweisen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese, möglicherweise durch den Transport von Triosephosphaten, eine metabolische Kommunikation zwischen Wirt und Symbiont gewährleisten könnten.

Secreted effectors play crucial roles during the establishment of the biotrophic interaction between Ustilago maydis and maize. In a previous study (Schipper, 2009) it had been demonstrated that a deletion of the stp1 effector gene resulted in a complete loss of virulence symptoms in maize infection and that such mutants elicited a hypersensitive response. This distinguishes stp1 from most other secreted effectors that are either dispensable for pathogenicity or have only a minor effect on virulence. This study focuses on the functional analysis of Stp1. A mutational analysis showed that the conserved N- and C-terminal domains of Stp1 can be separately expressed but are both required for Stp1 protein function. The long central variable domain was demonstrated to be dispensable yet may promote fungal growth in vascular bundles. stp1 homologs from closely related smut fungi of U. maydis could replace stp1 in U. maydis, indicating a conserved function. Stp1Δ136-432 lacking the central domain could be purified to homogeneity and was stable, while the isolated C-terminal domain, Stp1433-515, was unstable after purification. This could suggest that N- and Cterminal domains of Stp1 stabilize each other. Stp1-HA expressed by U. maydis was detected in the nucleus of plant cells by immunolocalization suggesting that Stp1 may suppress plant defense responses by affecting the transcription of respective genes. Both cytoplasmic and apoplastic maize proteins were identified as interaction partners of Stp1 by yeast two-hybrid assays using Stp1Δ136-432 as bait, suggesting that Stp1 may be an effector with both apoplastic and cytoplasmic functions The C-terminus of Stp1 as well as Stp1Δ136-432 could inhibit the activity of a maize extracellular cysteine protease, Sip3, which was identified as one of the apoplastic interaction partners. The interactions between Stp1 and the cytoplasmic interactors Sip9, a cell number regulator 8, Sip16, a CCR4-NOT transcription complex subunit, Sip19, a serine/threonine-protein kinase and Sip21, a VIP2 protein were verified with full-length cDNA but await to be confirmed by other techniques. RNA-Seq analysis demonstrated that several early defense response genes are not induced by stp1 mutants expressing the N-terminus of Stp1 while stp1 mutants expressing the Cterminus of Stp1 triggered even stronger plant defense responses than stp1 mutants during colonization. This suggests that N- and C-terminal domains of Stp1 have distinct functions., Bei der Etablierung der biotrophen Interaktion zwischen Ustilago maydis und Mais spielen sekretierte Effektoren eine entscheidende Rolle. In einer vorausgegangenen Studie(Schipper, 2009) konnte gezeigt werden, dass die Deletion des stp1 Effektor-Gens zu einem vollständigen Verlust der Virulenz führt und dass entsprechende Mutanten eine hypersensitive Reaktion auslösen. Diesbezüglich unterscheidet sich stp1 von den meisten anderen untersuchten Effektoren, die entweder keinen oder nur einen geringen Beitrag zur Virulenz des Pilzes leisten. Diese vorliegende Arbeit befasst sich mit der funktionellen Analyse von Stp1. Mutationsanalysen zeigten, dass die konservierten N- und C-terminalen Domänen von Stp1 zwar als separate Polypeptide exprimiert werden können, aber die Gegenwart beider Domänen nötig ist, um die Stp1 Funktion zu komplementieren. Es wurde nachgewiesen, dass die zentrale variable Domäne von Stp1 keine essentielle Funktion übernimmt, allerdings könnte diese Domäne für die Proliferation des Pilzes entlang der Leitbündel eine Rolle spielen. stp1 Homologe aus mit U. maydis nahe verwandten Brandpilzen waren in der Lage, die Funktion von stp1 in U. maydis zu komplementieren, was für eine konservierte Funktion spricht. Eine Stp1 Version, bei der die zentrale Domäne deletiert wurde (Stp1Δ136-432), konnte bis zur Homogenität aufgereinigt werden und erwiess sich als stabil, während die isolierte C-terminale Domäne, Stp1433-515, nach der Aufreinigung instabil war. Diese Beobachtung könnte darauf hinweisen, dass sich die N- und C-terminalen Domänen von Stp1 gegenseitig stabilisieren. Durch Immunlokalisierung konnte ein Stp1-HA Fusionsprotein im Zellkern von Pflanzenzellen detektiert werden, die mit dem Stamm SG200stp1-HA infiziert waren. Demzufolge könnte Stp1 auf die Transkription von Genen Einfluss nehmen und dadurch die pflanzliche Abwehrreaktion unterdrücken. In einem Hefe-zwei-Hybrid-System, bei dem Stp1 als Köder benutzt wurde, konnten sowohl apoplastische als auch cytoplasmatische Mais Proteine als Stp1-Interaktoren identifiziert werden. Dies könnte bedeuten, dass Stp1 ein Effektorprotein mit dualer Funktion zum einen im Apoplasten und zum anderen im pflanzlichen Zytoplasma ist. Sowohl die gereinigte C-terminale als auch die N-terminale Domäne von Stp1war in der Lage, die Aktivität der extrazellulären Mais Cystein-Protease Sip3 zu inhibieren, die zuvorals ein apoplastischer Interaktionspartner von Stp1 identifiziert werden konnte. Die Interaktion zwischen Stp1 und den cytoplasmatischen Interaktoren Sip9 (cell number regulator 8), Sip16(CCR4-NOT Transkriptionskomplex Untereinheit), Sip19(Serine/Threonin- Kinase) und demVIP2 Protein Sip21 konnten nach Expression der jeweiligen Gene in voller Länge verifiziert werden, müssen aber zukünftig noch durch weitere Methoden bestätigt werden. RNA-Seq Analysen des Transkriptoms infizierter Mais Blätter zeigten, dass einige der frühen pflanzlichen Abwehrgene, die nach Infektion mit einem stp1-Deletions Stamm induziert werden, Hingegen führte die Infektion mit einem stp1-Deletions Stamm komplementiert durch den Stp1 C-Terminus sogar zu einer stärkeren Abwehrreaktion als sie nach Infektion mit dem stp1- Deletionsstamm beobachtet wurde. Dies weist darauf hin, dass die N- und C-terminale Domänen von Stp1 unterschiedliche Funktionen erfüllen könnten.

For establishment of the biotrophic interaction with its host plant maize, the corn smut fungus Ustilago maydis depends on a variety of secreted effector proteins. A deletion of um01987, the gene encoding for the secreted effector Pep1 (protein essential during penetration 1), leads to a complete loss of pathogenicity. Penetration attempts of the deletion mutant elicit strong plant defense responses such as the accumulation of reactive oxygen species (ROS), papilla formation and necrotic lesions. Pep1 localizes in the biotrophic interface and is conserved within different smut fungi. This study focuses on the functional characterization of Pep1 with biochemical and molecular biological methods. It was demonstrated that heterologously expressed Pep1 protein from Escherichia coli inhibits the oxidative burst in maize. Treatment of maize plants with the ROS scavenger ascorbate led to reduced defense responses in reaction to Δpep1 infections. In addition, Pep1 was shown to inhibit activity of a class III peroxidase from horseradish in vitro. Class III peroxidases play a pivotal role in ROS production during the oxidative burst. In maize plants, inoculated with the pep1 deletion mutant, the secreted peroxidase 12 (POX12) is transcriptionally induced. Bimolecular fluorescence complementation and yeast-2-hybrid experiments revealed a direct interaction of Pep1 with POX12. Virus induced gene silencing of pox12 in maize partially restored the Δpep1 phenotype. Silencing of pox12 led to reduced plant defense responses, such as papilla formation at penetration sites. As a consequence, hyphae of the pep1 mutant penetrated epidermal cells of pox12 silencing plants. Furthermore, orthologs of pep1 in additional smut species were identified. In vitro studies showed peroxidase inhibition by Pep1 orthologs from Ustilago avenae, Ustilago nuda and Melanopsichium pennsylvanicum. Additionally, inhibition of apoplastic peroxidases from different host plants by Pep1 was demonstrated. Maize infection studies with U. maydis confirmed the biological function of the identified pep1 orthologs. In summary, these results suggest a role of Pep1 as inhibitor of peroxidases, a core component of the basal plant defense response., Der Brandpilz Ustilago maydis benötigt während der Interaktion mit seiner Wirtspflanze Mais eine Vielzahl sekretierter Effektoren zur Etablierung der Biotropie. Eine Deletion des Gens um01987, das für den sekretierten Effektor Pep1 (protein essential during penetration 1) codiert, führt zum vollständigen Verlust der Pathogenität. Auf Penetrationsversuche der pep1-Deletionsmutante reagiert die Maispflanze mit der Induktion verschiedener Abwehrmechanismen wie der Bildung von Papillen, der Anreicherung reaktiver Sauerstoffspezies und nekrotischen Läsionen. Pep1 lokalisiert in der biotrophen Interaktionszone und ist in verschiedenen Brandpilzarten konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Pep1 durch biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass heterolog in Escherichia coli exprimiertes Pep1 den oxidative burst in Mais inhibieren kann. Eine Behandlung von Maispflanzen mit dem Radikalfänger Ascorbat hatte verminderte Abwehrreaktionen gegenüber Infektionen mit der pep1-Deletionsmutante zur Folge. Weiterhin wurde gezeigt, dass Pep1 die Aktivität einer Klasse-III-Peroxidase aus Meerrettich in vitro hemmt. Klasse-III-Peroxidasen spielen eine zentrale Rolle in der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies beim oxidative burst. Bei Infektionen von Mais mit der pep1-Deletionsmutante ist die sekretierte Peroxidase-12 (POX12) transkriptionell induziert. Durch Bimolekulare Fluoreszenzkompementatiion und Hefe-2-Hybrid-Experimente konnte eine direkte Interaktion von Pep1 mit POX12 nachgewiesen werden. Durch virusinduziertes Gen-Silencing von pox12 in Mais konnte eine partielle Rettung des Δpep1-Phänotyps erreicht werden. Das Silencing von pox12 bewirkte verminderte Abwehrreaktionen der Wirtspflanze wie z. B. Papillenbildungen an Penetrationsstellen, so dass die Hyphen der pep1-Deletionsmutante in der Folge die Epidermiszellen penetrieren konnten. Darüber hinaus konnten Orthologe von pep1 in weiteren Brandpilzspezies identifiziert werden. Es wurde in vitro gezeigt, dass die Pep1-Orthologe aus Ustilago avenae, Ustilago nuda und Melanopsichium pennsylvanicum ebenfalls als Peroxidaseinhibitoren agieren. Weiterhin wurde die Inhibition apoplastischer Peroxidasen aus verschiedenen Wirtspflanzen durch Pep1 nachgewiesen. Schließlich wurde die Funktion der identifizierten Pep1-Orthologe in Infektionen von Mais mit U. maydis bestätigt. Diese Ergebnisse sprechen für eine Rolle von Pep1 als Inhibitor von Peroxidasen, einer zentralen Komponente der basalen pflanzlichen Abwehrreaktion.

The strictly anaerobic Deltaproteobacteria Geobacter metallireducens and Desulfobacula toluolica are able to use toluene as sole energy- and carbon source. The degradation of toluene proceeds similar to that in the denitrifying organism Thauera aromatica. In the initial step (R)-benzylsuccinate is generated from toluene and fumarate which is catalyzed by the enzyme (R)-benzylsuccinate synthase. The further degradation of (R)-benzylsuccinate is carried out in a modified b-oxidation to the central intermediate benzoyl-CoA.In an early step of the b-oxidation (R)-benzylsuccinate is oxidized to (E)-phenylitaconyl-CoA.Beside the (R)-benzylsuccinyl-CoA dehydrogenase (BbsG), there is also an electron transferring flavoprotein (EtfBA) involved. In contrast to facultative anaerobic organisms like T. aromatica for example, the genes etfB and etfA of the two subunits of the electron transferring flavoprotein of G. metallireducens and D. toluolica are coded in the bbs-operon (betaoxidation of benzylsuccinate). Aim of this work was to characterize the electron transferring flavoprotein and the (R)-benzylsuccinate synthase from the corresponding organisms., Die strikt anaeroben Deltaproteobakterien Geobacter metallireducens und Desulfobacula toluolica sind in der Lage Toluol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen. Der Abbau von Toluol verläuft ähnlich wie in dem denitrifizierenden Organismus Thauera aromatica. Im initialen Schritt entsteht aus Toluol und Fumarat (R)-Benzylsuccinat, katalysiert durch das Enzym (R)-Benzylsuccinat Synthase. Der weitere Abbau von (R)-Benzylsuccinat erfolgt über eine modifizierte b-Oxidation bis hin zum zentralen Intermediat Benzoyl-CoA. In einem frühen Schritt dieser b-Oxidation wird (R)- Benzylsuccinyl-CoA zu (E)-Phenylitaconyl-CoA oxidiert. An dieser Reaktion ist neben der (R)-Benzylsuccinyl-CoA Dehydrogenase (BbsG) auch ein Elektronen-Transferierendes Flavoprotein (EtfBA)beteiligt. Im Gegensatz zu fakultativ anaeroben Organismen, wie beispielsweise T. aromatica, sind in G. metallireducens und D. toluolica die Gene der beiden Untereinheiten des Elektronen-Transferierenden Flavoproteins (etfB und etfA) im bbs-Operon (Beta-Oxidation von Benzylsuccinat) kodiert. Außerdem befindet sich dort ein weiteres Gen (orfX), welches offensichtlich für eine membranständige Oxidoreduktase mit zwei [4Fe-4S]-Clustern kodiert. Ziel dieser Arbeit war es, die (R)-Benzylsuccinyl-CoA Dehydrogenasen mit ihren Elektronen-Transferierenden Flavoproteinen aus den verschiedenen Organismen zu charakterisieren.

The syncytial larval musculature of Drosophila melanogaster develops during embryogenesis by fusion of two different cell types, the founder cells (FCs), which determine the identity of an individual muscle, and the fusion competent myoblasts (FCMs). During the fusion events in the somatic mesoderm, which gives rise to the body wall muscles, a Fusion-restricted Myogenic-Adhesive Structure (FuRMAS) is established, consisting of a ring of adhesion molecules and their adaptor proteins as well as of an actin-rich plug on the side of the FCM and an actin sheet on the side of the FC. This FuRMAS is supposed to act as a signaling center, linking cell adhesion to downstream fusion steps. The actin cytoskeleton is supposed to be important in processes like vesicle transport, fusion pore expansion and force generation at the FuRMAS. This thesis provides analyses of transport processes via microtubules during myogenesis by analyzing the expression of -Tubulin isoforms, as the structural subunits of microtubules. Although strongly expressed in the mesoderm, the somatic and visceral musculature develops independently of the 3-Tubulin isoform. Furthermore, a low level of maternally supplied 1-Tubulin is sufficient for body wall muscle formation. Thus, it is concluded that newly synthesized microtubules and microtubule-based transport processes are less important for Drosophila myogenesis. Rolling pebbles 7 (Rols7) is an essential adaptor protein at the FuRMAS on the side of the FCs, which interacts in vitro with Myosin heavy chain-like (Mhcl). In this thesis, it is shown that Mhcl is also expressed in FCs, and localizes at the contact sites towards the adhering FCM. This unconventional myosin might act as a motor protein for F-actin at the FuRMAS, being involved in vesicle transport or widening of the fusion pore, most likely redundantly to other myosin heavy chains. The syncytial visceral muscles of the embryo surround the gut as a network of binucleated circular muscles and perpendicularly arranged multinucleated longitudinal muscles. The longitudinal FCs migrate from the caudal visceral mesoderm and are shown in this thesis to fuse with a different FCM type than the circular FCs do. Furthermore, Rols7 is needed during myoblast fusion giving rise to the longitudinal gut muscles, while proteins regulating actin polymerization are involved either already in migration of the longitudinal FCs or also in the fusion processes itself. In conclusion, this muscle type develops distinct to the circular gut muscles and the body wall musculature of Drosophila.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evolution der plastidären RNA-Edierung und dem evolutionären Hintergrund der komplexen Plastide in Peridinin-haltigen Dinoflagellaten. Das Plastidengenom des Lebermooses P. endiviifolia wurde vollständig sequenziert (120554 bp) und C zu U Edierung konnte an 54 Stellen nachgewiesen werden. Aufgrund der relativ geringen Anzahl an Edierungen stützt dies einen sekundären Verlust der RNA-Edierung in dem Lebermoos M. polymorpha. Weiterhin sind die Edierungsstellen in P. endiviifolia auf einen Sequenzkontext mit geringerer Mutationsrate konzentriert. Dadurch erfüllen sie die Kriterien für das Modell der Entstehung der RNA-Edierung nach Tillich (Tillich et al., 2006). Ein RNA-Edierungssystem entwickelte sich um Mutationen der DNA auf RNA Ebene zu kurieren. Rückmutationen, teilweise begünstigt durch Zeiten dynamischer Sequenzevolution, führten zu den heute beobachtbaren Editotypen bzw. zum Verlust der Edierung in M. polymorpha. Außerdem wurde die plastidäre Genomreduktion der Peridinin-haltigen Dinoflagellaten untersucht. Mittels Transposonmutagenese konnten minicircles aus A. carterae isoliert werden, die unter anderem eine Stammspezifität der core-Region verdeutlichen. Die minicircles zeigen eine ausgesprochene Varianz und ihre möglichen Funktionen, unter anderem als mögliches Gen-shuttle, werden diskutiert. Im Zuge der Betrachtung des plastidären Proteinimports zeigte sich, dass die Transitpeptide Nukleus-codierter Plastidenproteine der Peridinin-haltigen Dinoflagellaten und Chromisten, entgegen bisherigen in vitro Daten, keinen Import in die primäre Plastide von Landpflanzen vermitteln können und die sogenannten Klasse I Transitpeptide weitere potentielle Zielsteuerungsinformationen enthalten (TPL2), welche die nötigen Informationen für eine Assoziation mit einer primären Plastide tragen. Proteine dieser Klasse weisen häufig eine größere Homologie zu ‚grünen Genen‘ auf, was auf einen Ursprung aus einem potentiellen horizontalen Gentransfer schließen lässt. Zusätzlich konnte durch elektronenmikroskopische Studien bestätigt werden, dass Proteine mit Klasse I Transitpeptid nicht sensitiv für eine Inhibition mit Brefeldin A sind und somit einen vom Golgi-Apparat unabhängigen Transportweg in die komplexe Plastide zu nutzen scheinen. Diese Klasse zeigt also Besonderheiten im plastidären Proteinimport, womöglich resultierend aus einem abweichenden evolutionären Ursprung., Topics of this thesis are the evolution of RNA-editing in plastids of land plants and the evolutionary background of the complex plastid in peridinin-containing dinoflagellates. The plastid genome of P. endiviifolia was completely sequenced (120554 bp) and transcripts of protein-coding genes showed only C to U RNA-editing at 54 sites. The relatively low number of editing sites supports the secondary loss of RNA-editing in M. polymorpha and, furthermore, editing sites are predominantly found in a sequence context known for low re-mutation rates. For this reason RNA-editing in P. endiviifolia meets the criteria for the evolution of chloroplast RNA-editing in land plants stated by Tillich (Tillich et al., 2006). RNA-editing was established to cure DNA mutations, which occurred in the plastid genomes of the first land plants, on the level of RNA. Re-mutations, eventually fostered by times of accelerated evolution rates, can cure these mutations on DNA level and thereby lead to the editotypes we observe today or even to a complete loss of RNA-editing as in M. polymorpha. Another topic was the plastidial genome reduction and the protein import in the complex plastid of peridinin-containing dinoflagellates. The method of transposon mutagenesis was used to isolate minicircles of A. carterae, which revealed that the core region of minicircles is at least subspecies-specific. Minicircles are extraordinary variant and their possible roles, as for example gene-shuttle, are discussed. Studies of protein import showed, that, in contrast to previous in vitro data, transit peptides of nucleus-encoded plastid proteins of peridinin-containing dinoflagellates and cromists were not able to mediate import into the primary plastid of land plants in vivo. For so called class I transit peptides potential additional targeting sequences were identified, named TPL2, which contained the necessary targeting information for directing proteins towards the primary plastid of land plants as it is known from proteins of the outer envelope membrane. Furthermore, class I proteins seem to have a phylogenetic bias towards the ‘green line’ of plastids indicating a possible origin via horizontal gene transfer. Finally, electron microscopy showed the insensitivity of class I protein transport to inhibition with Brefeldin A suggesting an alternative transport route for this class of transit peptides, most probably directly from the ER to the complex plastid. Therefore, proteins with class I transit peptide show specific transport mechanism for protein import into the plastid, potentially as a result of particular evolutionary origin.

In dieser Arbeit wurden Entwicklung, Charakterisierung und erste in vitro Versuche eines neuen, nanoskaligen Ultraschallkontrastmittels (NUSCA) vorgestellt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines NUSCA zur Verbesserung der Behandlung thromboembolischer Erkrankungen. Kapitel 1 enthält eine allgemeine Einführung in das Thema der Arbeit, während in Kapitel 2 die verwendeten Methoden zusammengefasst werden. Kapitel 3 gibt verschiedene Herstellungsmethoden und Lipidmischungen und ihren Einfluss auf physikochemische Eigenschaften der NUSCA wieder. Die Auswirkungen von Extrusion, Lyophilisation, DPPG-Zusatz und Veränderungen der PEG40S-Konzentration bei zusätzlicher Beschallung mit einem Ultraschallhomogenisator auf Größe, Zetapotential und Struktur der NUSCA wurden getestet. Dabei konnten liposomale Strukturen bei DPPC/CH-Formulierungen und Mischungen aus Liposomen und Mizellen für PEG40S-haltige Formulierungen gefunden werden. Die Extrusion führte zu einer deutlichen Verringerung der hydrodynamischen Durchmesser aller Formulierungen. Lyophilisation, als Möglichkeit die Lagerstabilität zu verbessern, führte zu einer deutlichen Vergrößerung der Formulierungen. Das negative Lipid DPPG, zugesetzt um eine Aggregation der Partikel zu verhindern, veränderte Größe und PDIs der Formulierungen nicht, senkte aber ab einer Konzentration von 1 mol% das Zetapotential deutlich auf Werte kleiner -20 mV ab. Die zusätzliche Beschallung der PEG40S-haltigen NUSCA am Ultraschallhomogenisator führte zu einer deutlichen Verminderung der Größen. Ein Einfluss der PEG40S-Konzentration konnte dabei sowohl auf die Struktur als auch auf die Größe festgestellt werden. Die Ultraschallkontrastverstärkung der einzelnen NUSCA wurde in Kapitel 4 in einem speziellen Durchflussmodell getestet. Der Einfluss der verschiedenen Herstellungsmethoden auf die Echogenizität war in den meisten Fällen negativ. Nach der Extrusion verschwand der Kontrast der DPPC/CH-Liposomen vollständig und der Kontrast der PEG40S-haltigen NUSCA wurde deutlich schwächer. Die Lyophilisation, die eigentlich dafür bekannt ist die Echogenizität zu verbessern, schwächte den Kontrast, außer bei Zusatz von PEG4000 zu den DPPC/CH-Liposomen, ab. Eine Konzentrationsabhängigkeit der Echogenizität war für den DPPG-Zusatz zu beobachten, aber auch hier blieb der Kontrast hinter den Werten der Formulierungen ohne DPPG zurück. Die zusätzliche Beschallung konnte die Echogenizität verbessern, wobei eine Abhängigkeit von der PEG40S-Konzentration deutlich wurde. Das Verhältnis der Liposomen und Mizellen zueinander schien einen Einfluss auf die Echogenizität zu haben, allerdings waren zwischen den DPPC- und DSPC-Formulierungen Unterschiede sichtbar. Untersuchungen zur Mischbarkeit von DPPC und DSPC mit PEG40S wurden daher in Kapitel 5, zur weiteren Erklärung der Kontrastverstärkungen, durchgeführt. Mit Hilfe von П/A - Isothermen wurde eine Mischbarkeit für DPPC und PEG40S in der flüssig-expandierten Phase festgestellt. DSPC und PEG40S dagegen waren nicht miteinander mischbar. Epifluoreszenzmessungen nach Beimischung eines fluoreszenzmarkierten Lipids konnten diese Ergebnisse bestärken. Die Konformation der PEG-Ketten in den Formulierungen wurde als weitere Erklärung für die konzentrations-abhängige Echogenizität aus diesen Ergebnissen abgeleitet. Bei den DPPC/PEG40S-NUSCA war das PEG40S gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt und lag daher länger in der geknäulten mushroom- Konformation vor. Höhere Konzentrationen an PEG40S führten zu einer stärkeren Interaktion der PEG-Ketten und einer Veränderung der Anordnung dieser in die gestreckte brush- Konformation. Bei Formulierungen aus den nicht mischbaren DSPC und PEG40S bildeten sich PEG40S-Domänen, in denen die Ketten sehr früh stark interagierten und daher in der brush- Konformation vorlagen. Die weiter in das Medium herausstehenden Ketten dieser Anordnung konnten stärker mit dem Ultraschall (US) interagieren und sorgten so für eine bessere Echogenizität. Eine in vitro Studie zur Bestimmung des sonothrombolytischen Potentials des NUSCA mit den besten Eigenschaften wurde in Kapitel 6 beschrieben. Thromben aus menschlichem Vollblut wurden dabei einer Behandlung mit diagnostischem US und verschiedenen Kombinationen der thrombolytischer Arzneistoffe und des NUSCA ausgesetzt. Die ermittelten Gewichtsverluste waren deutlich höher als in vergleichbaren in vitro Studien und Effekte des NUSCA auf das Fibrinnetz konnten gezeigt werden. NUSCA und US alleine führten zu einer deutlichen Zunahme der Porengröße im Fibrinnetz. Nach der Kombination von US, NUSCA und Arzneistoff konnte kein Fibrinnetz mehr auf der Oberfläche der Thromben nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse machen unser NUSCA zu einem vielversprechenden neuen Ansatz in der sonothrombolytischen Therapie.

Bakterien sind in ihren Lebensräumen ständig wechselnden Bedingungen ausgesetzt. Dies erfordert eine aktive und gerichtete Fortbewegung, um das Überleben und die Anpassungsfähigkeit zu sichern. Ein höchst effizienter Weg der Fortbewegung wird durch die Rotation von Flagellen vermittelt. Der Modellorganismus Shewanella oneidensis MR-1 stammt – im Gegensatz zu anderen Shewanellen – aus einem Süßwasserhabitat und besitzt eine polare Flagelle, die sowohl von einem natriumabhängigen PomAB- als auch von einem protonenabhängigen MotAB-Statorsystem getrieben werden kann. Zwar wird der Flagellenmotor in S. oneidensis in erster Linie von PomAB betrieben, jedoch sind beide Statorsysteme durchgehend präsent und werden für maximale Geschwindigkeit der Flagellenrotation unter natriumlimitierenden Bedingungen benötigt. Für die Erzeugung des Drehmoments, bzw. der Rotation der Flagelle ist der Flagellenmotor – bestehend aus einem rotierendem Element, dem Rotor, und mehreren statischen Elementen, den Statoren – von essentieller Wichtigkeit. Obwohl die Statoren – welche den Rotor als ringähnliche Struktur einfassen – zur Erzeugung des Drehmoments fest in der Zellwand verankert sind, werden dessen Elemente stetig ausgetauscht, was erstaunlicherweise auch während der Rotation des Motors funktioniert. Klar ist bislang nur, dass sowohl Natrium- als auch Protonenabhängige Statoren denselben Motor antreiben können, jedoch wurde noch nie ein Hybridmotor beschrieben für dessen volle Leistung zwei verschiedene, gleichzeitig arbeitende Statorsysteme unabdingbar sind. Das wirft die Frage auf, wie PomAB und MotAB von S. oneidensis in einem Flagellenmotorsystem arbeiten. Während meiner Arbeit konnte ich ein neuartiges Modell für den dynamischen Statoraustausch, als Anpassung an unterschiedliche Salzkonzentrationen, im Flagellenmotor von S. oneidensis entwerfen. Eine wichtige Voraussetzung für dieses Modell war eine synchrone und von der Salzkonzentration unabhängige Expression von pomAB und motAB, deren Nachweis über transkriptionelle Fusionen an lucB erbracht wurde. Mit Hilfe von Fluoreszensfusionen der B-Untereinheiten der Statoren an mCherry wurde deutlich, dass eine Fraktion von PomB – im Gegensatz zu MotB – unabhängig von der Natriumkonzentration polar lokalisiert. Bei hohem Salzgehalt wird PomB effizienter rekrutiert und erschwert somit vermutlich den Einbau von MotAB in den Statorring. Dagegen ließ das Lokalisationsmuster unter niedrigen Natriumkonzentrationen auf einen zeitgleichen Einbau von PomAB und MotAB in den Statorring schließen. Interessanterweise wird MotB in Abwesenheit von PomAB unter allen Natriumbedingungen zum flagellierten Pol rekrutiert. Wird jedoch PomAB wieder produziert, wird MotAB aus dem Statorring in die Membran verdrängt und von PomAB ersetzt. Über eine Quantifizierung von sfGfp-PomB Molekülen wurde deutlich, dass sich die Anzahl von mindestens neun in salzhaltiger auf fünf PomAB Komplexe in salzarmer Umgebung reduziert. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die Inkorporation von PomAB dynamisch und in direkter Antwort auf die Natriumbedingung erfolgt, während die Rekrutierung von MotAB von der Anzahl an inkorporierten PomAB Statoren abhängig ist. Zwei weitere Proteine, MotX und MotY wurden im Laufe dieser Arbeit als essentiell für die Funktionalität, jedoch nicht für die Rekrutierung, von PomAB oder MotAB in den Flagellenmotor beschrieben. Zusammenfassend unterstützen diese Daten das Modell des dynamischen Statoraustausches zur Anpassung des Flagellenmotors an wechselnde Umweltbedingungen. Der zeitgleiche Einbau von PomAB und MotAB in einen funktionellen Statorring lässt auf die Existenz eines Hybridmotors in S. oneidensis schließen. Es bleibt zu zeigen, welche Rolle MotAB in diesem bislang einzigartigen Hybridmotor übernimmt. Daher sole sich nun der zweite Abschnitt meiner Arbeit mit der biophysikalischen Charakterisierung des Flagellenmotors auf Einzelzellebene und somit mit der Analyse der Beteiligung von MotAB und PomAB an der Flagellenrotation beschäftigen. Dafür wurden zwei Assays etabliert, zum einen der “bead assay” und zum anderen der “tethered cell assay”. Die Vorrausetzungen dafür waren, eine lateral lokalisierte Flagelle und ein Antikörper gegen natives Flagellin, um sowohl die Anheftung der “beads” an die Flagelle, als auch die Anheftung der Flagelle an eine Oberfläche zu gewährleisten. Während der “Bead Assay” auf Kurzzeitmessungen beschränkt war, konnte der “tethered cell assay” funktional etabliert werden. Letzterer erlaubt nun einen konstanten Pufferwechsel und eine Modulierung des Statorproteinlevels. Erste Ergebnisse zeigten, dass der Motor des Wildtyps bei geringen Natriumkonzentrationen signifikant schneller rotiert, als der rein natriumabhängige Motor. Desweiteren konnte über die kontrollierte Produktion von PomAB ein schrittweiser Anstieg der Rotationsgeschwindigkeit beobachtet werden. Die Produktion von MotAB hingegen senkte die Geschwindigkeit eines PomAB-getriebenen Motors schrittweise ab. In anderen Arbeiten konnte bereits zuvor gezeigt werden, dass MotAB-getriebene Motoren geringere Rotationsgeschwindigkeiten erreichen, als PomAB-getriebene. Diese Ergebnisse deuten auf einen Einbau von MotAB hin, was in der Folge zu einem Abbremsen des PomAB getriebenen Motors führt. Die alleinige Produktion von MotAB konnte die Rotation des Zellkörpers nicht wiederherstellen. Jedoch können Zellen, welche nur MotAB besitzen, schwimmen, was impliziert dass MotAB prinzipiell funktional ist. Statorhomolgievergleiche deuten darauf hin, dass MotAB erst vor kurzem – vermutlich über lateralen Gentransfer in Zusammenhang mit der Anpassung an niedrige Salzbedingungen im Oneida See – in S. oneidensis gelangte. Die Aufnahme eines protonenabhängigen Stators erleichtert eventuell die Rotation der Flagelle im natriumarmen Süßwasserhabitat. Eine bioinformatischen Analyse aller sequenzierten bakteriellen Genome zeigte, dass multiple Statorsets bei Organismen mit nur einem Flagellensystem häufiger vorkommen, als bisher angenommen. Der dynamische Statoraustausch, mit dem S. oneidensis vermutlich seinen Flagellenmotor adaptiert, könnte auch in anderen Organismen eine Strategie zur Anpassung an schnell wechselnde Umweltbedingungen darstellen. S. oneidensis besitzt einen Hybridmotor, der sich vermutlich noch immer in einem Prozess der Optimierung befindet. Die spezifische Charakterisierung von MotAB und dessen Beitrag zur Rotation in einem dual getriebenen Statorring ist notwendig, um die Existenz eines funktionalen Hybridmotors auf biophysikalischer Ebene zu beweisen., Bacteria are exposed to constantly changing environments. An efficient way to navigate towards favourable conditions is flagella-mediated motility. Flagellar rotation is achieved by the bacterial flagellar motor, composed of the rotor and stator complexes which surround the rotor in a ring-like structure. As an exception among the Shewanella species, the fresh-water organism S. oneidensis MR-1 harbours two different stator complexes, the sodium-ion dependent PomAB and the proton-dependent MotAB, differentially supporting rotation of a single polar flagellum. Both PomAB and MotAB are simultaneously present and required for full speed under low sodium-ion conditions. Although tightly anchored to the cell wall, stators are constantly exchanged even during ongoing rotation. Moreover, sodium-ion and proton-dependent stators can function with the same rotor. This raises the question of how PomAB and MotAB contribute to rotation of a single flagellum and whether PomAB and MotAB coexist in the stator ring of S. oneidensis MR-1, forming a hybrid motor. Here, I report a novel model for the dynamic adaptation of the rotor-stator configuration in response to the environmental sodium ion level in S. oneidensis MR-1. Transcriptional fusions to lucB revealed that both pomAB and motAB are concurrently transcribed. By using fluorescence microscopy, functional fusions of mCherry to the B-subunits revealed that in sharp contrast to MotB, a fraction of PomB is polarly positioned independently of the sodium-ion concentration. At low sodium-ion concentration, PomB and MotB appear to coexist in the flagellar motor. However, in the absence of PomAB, MotB is recruited to the flagellated pole independently of the sodium-ion concentration. Interestingly, induced production of PomAB displaces polar MotB from the motor and confines it to the membrane. By quantifying single sfGfp molecules fused to PomB, I could show that the number of PomB in the stator ring is reduced from nine to five complexes when cells were shifted from a high to a low sodium-ion concentration. Thus, the incorporation efficiency of PomAB is directly modified in response to the sodium-ion concentration, whereas the association of MotAB into the stator ring rather depends on the presence of PomAB. Furthermore, two auxiliary proteins, MotX and MotY, were identified and shown to be essential for functionality of both PomAB and MotAB. Localisation studies revealed that, in contrast to Vibrio MotXY are not required for recruitment of the stator complexes to the flagellated pole. Taken together, my data support the model of dynamic stator swapping to tune the flagellar motor in response to environmental conditions, e.g. the availability of sodium ions. The concurrent presence of PomB and MotB at low sodium-ion concentration suggests the existence of a hybrid motor in S. oneidensis. Since it remains to be demonstrated whether MotAB stators are functionally incorporated in this hybrid motor, the second aim of this work was to biophysically analyse the contribution of MotAB and PomAB to motor rotation at the single cell level. To this end, a ‘bead assay’ and a ‘tethered cell assay’ were established. These set-ups required the delocalisation of the polar filament to a lateral position, the preparation of a highly specific antibody against the modified filament and, for the bead assay the attachment of polystyrene beads to the filament. While the bead assay was limited to short-term measurements, the tethered cell assay was optimised for long-term studies. The optimisation now permits a constant buffer exchange as well as the modulation of the stator complex level by an inducible promoter upstream of pomAB and motAB. Single cell analysis comparing the wild-type and the PomAB-driven motor revealed a significantly higher rotation speed for the wild-type motor at low sodium-ion concentration. Moreover, induced production of PomAB in a stator deletion background resurrected rotation speed in a stepwise manner, whereas production of MotAB in a PomAB-driven motor decreased rotation speed stepwise. These results strongly indicate that MotAB is incorporated into the force-generating PomAB-occupied stator ring, slowing down motor rotation. MotAB production in a stator deletion background did not restore rotation. However, swimming assays revealed that MotAB is sufficient to drive flagellar rotation in a subpopulation of cells, strongly suggesting that both stators are able to function together in a single motor. To clearly characterise the role of MotAB and PomAB in the hybrid motor of S. oneidensis MR-1 further biophysical studies are required. The genome wide bioinformatic analysis of all sequenced bacterial genomes revealed that dual or multiple stator complexes along with a single flagellar system are surprisingly widespread among bacterial species. Moreover, stator complex homology comparison in S. oneidensis MR-1 indicated that MotAB has recently been acquired by lateral gene transfer as a consequence of adaptation to a fresh-water environment. Thus, the flagellar motor might still be in a process of optimisation. Collectively, I hypothesize that S. oneidensis tunes its flagellar motor by exchanging stator complexes and that stator swapping represents a common mechanism applicable to other bacteria to adapt to changing environments.

Layoutgetreues Digitalisat der Ausg.: Paris : Libr. J. B. Baillière et fils, 1892 Standort: Fachgebiet für Geschichte der Medizin (192) Signatur: 754/IV Provenienz: Behring, Emil von

Der intrazelluläre Parasit Toxoplasma gondii zeichnet sich wie die meisten Mitglieder der Chromalveolaten durch den Besitz einer sekundären Plastide aus, die man als Apikoplasten bezeichnet. Diese Art von Plastide ist durch einen Vorgang der sekundären Endosymbiose entstanden, bei der ein Rhodophyt von einer eukaryotischen Zelle aufgenommen und im Laufe der Evolution als Organell etabliert wurde. Aufgrund des horizontalen Gentransfers zwischen dem Nukleus und der Plastide werden die meisten Proteine des Apikoplasten im Wirtsgenom kodiert und im ER synthetisiert. Proteine des Apikoplastenstromas müssen daher aus dem ER, über die insgesamt vier Membranen der Plastide mit Hilfe einer Proteinimportmaschinerie zu ihrem Bestimmungsort befördert werden. Wie dieser Import im Detail erfolgt, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar. Jedoch konnten einige Komponenten dieser Maschinerie, wie SELMA in der PPM und ein Tic20-Homolog in der innersten Membran des Apikoplasten identifiziert werden. Basierend auf bioinformatischen Analysen konnten zwei Proteine der OMP85-Familie im Genom von T. gondii identifiziert werden. Die Mitglieder dieser Familie können aufgrund ihrer Funktionalität zwei Subtypen (Toc75- und Sam50-Subtyp) zugeordnet werden. Während Proteine des Toc75-Subtyps am Transport von Proteinen über Membranen beteiligt sind, sind die des Sam50-Subtyps in der Integration von Proteinen in Membranen involviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für eines der beiden in T. gondii identifizierten OMP85 Proteine (TgOMP85) eine Funktion im Proteinimport in die Plastide postuliert. Nach Überprüfung des Genmodells konnte TgOMP85 eindeutig der OMP85-Familie zugeordnet und im Apikoplasten des genannten Parasiten lokalisiert werden. Des Weiteren wurde der Nachweis erbracht, dass TgOMP85 eine funktionelle BTS-Sequenz aufweist, welche den Transport und die Lokalisation in den Apikoplasten vermittelt. Um die Vermutung, dass es sich bei TgOMP85 um eine, in der dritten Apikoplastenmembran lokalisierte, Komponente der Proteinimportmaschinerie handelt, bestätigen zu können, sind weiterführende Analysen nötig. Das zweite identifizierte Protein (TgSam50) könnte aufgrund seiner Gensequenz und mitochondrialen Lokalisation dem Sam50-Subtyp zugeordnet werden. Ob es jedoch tatsächlich an der Assemblierung und Integration von Proteinen in die äußere mitochondriale Membran involviert ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden., As with many members of the Chromalveolates, the intracellular parasite Toxoplasma gondii harbors a plastid which is called the apicoplast. This kind of plastid has been evolved by secondary endosymbiosis, an event in which a rhodophyte was engulfed by another eukaryotic cell. During the course of evolution, the endoysmbiont became established as an organelle. Due to the horizontal gene transfer between the host nucleus and the secondary plastid most of the apicoplast proteins are encoded in the host nucleus, synthesized in the ER and therefore must be reimported into the plastid. Since the apicoplast features four membranes, proteins destined for the plastid stroma have to traverse them by using a protein import machinery. Even though some components of this machinery, SELMA in the PPM and a Tic20-homologue in the innermost apicoplast membrane, have been identified, the details of the import mechanism are still unknown. Based upon bioinformatic analyses, two proteins of the OMP85-family were identified in the genome of T. gondii. Depending on their function proteins of this family can be devided further into two subgroups. Proteins of Toc75-subtype are involved in protein transport whereas members of Sam50-subtype are characterized as components of protein insertion and assembly machineries. During the course of this work one protein of the OMP85-family (TgOMP85) could be localized in the apicoplast of the parasite. After a verification of the gene model TgOMP85 can definitely be assigned to the OMP85-family. Furthermore like most of the apicoplast proteins it possesses a functional BTS-sequence at its N-terminus, which is responsible for targeting the protein to the plastid. In order to verify if TgOMP85 respresents a component of the protein import machinery in the third apicoplast membrane, further analysis has to be carried out. The second identified protein in the apicomplexan parasite was localized in the mitochondrium and is designated as TgSam50. Due to its gene sequence and its localization this protein can be assigned to the Sam50-subtype of the OMP85-family. Whether TgSam50 is in fact involved in the integration events of proteins into the outer mitochondrial membrane remains to be clarified.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine PCR-basierte Methode zum Nachweis der Abwesenheit von Mykoplasmen (Mollicutes) in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle der Firma Novartis Vaccines & Diagnostics (NVD) am Standort Marburg etabliert. Ziel war es, die Grundlagen für die anschließende Validierung und Zulassung dieser Methode durch die Behörden zu schaffen, sodass beide, aktuell zur Freigabe der Impfstoffe verwendeten Test-Methoden (Kultivierungstest und Indikatorzelltest gemäß Europäischem Arzneibuch) durch das neue Verfahren ersetzt werden können. Die hierfür am besten geeignete Methode zur PCR-basierten Detektion der Mollicutes war das CytoInspectTM System der Firma Greiner Bio-One, deren Prinzip auf einer touch-down PCR, gefolgt von einer Microarray Analyse zur Detektion und Identifizierung der PCR-Produkte, beruhte. Im direkten Vergleich wurden drei „ready-to-use“-Kits betrachtet. Die Hauptkriterien waren dabei die in praktischen Versuchen gemessene Sensitivität für Proben mit hohen Zell- (>107 Zellen/ml) und Viruskonzentrationen, die Spezifität und die Positivkontrollen zur Überwachung der Funktionalität jedes einzelnen Tests. Für die Validierung des PCR-basierten Verfahrens und den Vergleich mit den bisherigen Methoden auf Kultivierungsbasis wurden Referenzstandards von zehn verschiedenen Mollicutes-Spezies etabliert. Es handelte sich dabei um aliquotierte und tiefgefrorene Zellsuspensionen. Das Hauptkriterium für die Eignung dieser Standards war ein möglichst niedriges und gleichmäßiges Verhältnis von Genkopien (GC) pro koloniebildender Einheit (KBE) in den einzelnen Aliquots der jeweiligen Zellsuspensionen. Alle zehn Referenzstandards wiesen einen stabilen Titer (KBE/ml) und ein Verhältnis von < 20 GC/KBE auf. Die Sensitivität des CytoInspectTM Kits wurde in Form der Nachweisgrenze bestimmt. Für die zehn, in dieser Arbeit getesteten Mollicutes-Spezies lag sie zwischen 22 und 0,5 GC/ml (entsprach 4,5 0,1 KBE/ml), bei einem Probenvolumen von 10 ml. Sie war vergleichbar mit der Nachweisgrenze des Kultivierungstests, die in dieser Arbeit bei 2 bis 0,1 KBE/ml gemessen wurde. Durch die ebenfalls hohe Sensitivität bei der Detektion freier DNA von bereits abgestorbenen Zellen, bietet diese Methode zusätzlich die Möglichkeit zur Prävention lebender Kontaminationen in den Produktionsanlagen. Die Robustheit des Verfahrens und die spezifische (ausschließliche) Detektion von Mollicutes mit dem CytoInspectTM Kit konnten durch praktische Tests gezeigt werden. Im Rahmen der Etablierung der Methode als Routineanwendung zur Chargenfreigabe von Impfstoffen unter den örtlichen Gegebenheiten in den Laboren der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von NVD in Marburg wurde die Sicherheit des Testverfahrens bewertet. Dies erfolgte zum einen durch die Evaluierung der kritischen Schritte, die zu einem falsch-negativen Ergebnis führen könnten. Zum anderen wurde das Risiko für falsch-positive Ergebnisse, die durch Kontaminationen der Proben während der Testdurchführung entstehen könnten, bewertet und durch entsprechende Maßnahmen minimiert.

Layoutgetreues Digitalisat der Ausg.: Berlin : Hirschwald, 1904 Standort: Fachgebiet für Geschichte der Medizin (192) Signatur: 729/IV Provenienz: Behring, Emil von

Layoutgetreues Digitalisat der Ausg.: Berlin : Hirschwald, 1874 Standort: Fachgebiet für Geschichte der Medizin (192) Signatur: 538/III Provenienz: Behring, Emil von

Layoutgetreues Digitalisat der Ausg.: Giessen : Ricker, 1862 Standort: Fachgebiet für Geschichte der Medizin (192) Signatur: 620/IV Provenienz: Behring, Emil von

Die hoch pathogenen Filoviren Ebola- (EBOV) und Marburg-Virus (MARV) sind Erreger eines hämorrhagisches Fiebers mit Lethalitätsraten von bis zu 90%. Bislang sind weder spezifische antivirale Medikamente noch eine Impfung für den Einsatz am Menschen verfügbar. Die hohe Sterblichkeitsrate sowie die fehlende Therapie und Prophylaxe bedingen, dass Filoviren als Erreger der höchsten biologischen Sicherheitsstufe (4) klassifiziert werden und somit eine Erforschung nur in Hochsicherheitslaboratorien erlaubt ist. Herstellung eines rekombinanten Marburg-Virus mit Fluoreszenzmarker Ziel dieses Projekts war die Herstellung eines rekombinanten MARV, welches das „enhanced green fluorescence protein“ (EGFP)-Gen von einer zusätzlichen, in das virale Genom eingefügten Transkriptionseinheit exprimiert. Viren, die fluoreszierende Proteine exprimieren, erleichtern die Untersuchung des viralen Vermehrungszyklus und sind wertvolle Hilfsmittel für das „Screenen“ von potentiellen antiviralen Medikamenten. Das EGFP-Gen wurde zwischen dem zweiten Gen des MARV-Genoms, dem VP35-Gen, und dem nachfolgenden VP40-Gen eingefügt. Das rekombinante Virus (rMARV-EGFP) wurde über ein cDNA-Zwischenprodukt in transfizierten Zellen generiert und anschliessend in „live-cell imaging“ Versuchen eingesetzt. Eine Expression von EGFP wurde 32 Stunden nach Infektion erstmals detektiert und eine Infektion von Nachbarzellen nach 55 Stunden. Im Vergleich zum rekombinanten Wildtyp-MARV wurde ein eingeschränktes virales Wachstum festgestellt. Dies ist wahrscheinlich auf die Insertion einer zusätzlichen Trankriptionseinheit zurückzuführen, da Gene, die hinter dem eingefügten EGFP-Gen liegen, weniger stark exprimiert wurden. In filoviralen Infektionen können charakteristische virale Einschlusskörper (inclusion bodies) detektiert werden, die sich im Zytoplasma infizierter Zelle bilden. Initiiert wird die Bildung dieser Einchlusskörper durch die Akkumulation des viralen Nukleoproteins (NP). Immunfluoreszenzanalysen von Zellen, die mit rMARV-EGFP infiziert waren, zeigten eine Akkumulation des EGFP in viralen Einschlusskörpern. In Tansfektionsexperimenten wurde die Relokalisierung verschiedener Fluoreszenzproteine in filovirale Einschlusskörper untersucht. Dies zeigte, dass ektopisch exprimierte Fluoreszenzproteine sowohl mit MARV- als auch mit EBOV-spezifischen Einschlusskörpern colokalisierten. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von NP in der Abwesenheit anderer viraler Proteine ausreichend für die Akkumulation von EGFP in den Einschlusskörpern ist. Im Gegensatz dazu akkumulierten ektopisch exprimierte GFP-Fusionsproteine, die ein zelluläres Lokalisierungssignal besitzen, nicht in MARV-spezifischen Einschlusskörpern. Dies lässt darauf schließen, dass ektopisch exprimierte Proteine unspezifisch in den viralen Einschlusskörpern akkumulieren, wenn sie kein Lokalisierungssignal besitzen. Durch Immunfluoreszenzanalysen konnte zudem gezeigt werden, dass die EGFP-Aggregate zwar durch die Autofluoreszenz detektiert werden konnten, aber nicht in der Antikörperfärbung sichtbar waren. Dies weist darauf hin, dass Antikörper nicht in der Lage sind, virale Einschlusskörper zu durchdringen. Die zelluläre Stressantwort in Ebola-Virus Infektion Ebola-Viren sind in der Lage, essentielle antivirale Signalwege der Interferon-induzierten Immunantwort zu hemmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von EBOV mit einem weiteren antiviralen Abwehrmechanismus, der zellulären Stressantwort, untersucht. Exogen induzierter Stress kann zur Aktivierung vier verschiedener Kinasen führen, die in aktivierter Form die α-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 (eIF2) phosphorylieren. Dies wiederum führt zu einer Hemmung der Proteinsynthese, welche mit der Bildung von cytoplasmatischen „stress granules“(SG) und „processing bodies“ (PB) einhergeht. Viren, die auf den zellulären Proteinsyntheseapparat angewiesen sind, haben vielseitige Abwehrstrategien gegen die zelluläre Stressantwort entwickelt. Im Folgenden wurde untersucht, wie EBOV mit SG und PB interagiert. Aufgrund der dynamischen Struktur von SG und PB wurden vorwiegend mikroskopische Analysen durchgeführt. Zunächst wurde untersucht, ob filovirale Infektionen eine Stressantwort induzieren. Es konnte gezeigt werden, dass in EBOV-infizierten Zellen keine endogenen SG gebildet werden. Die Behandlung von EBOV-infizierten Zellen mit dem Stressinduktor Natriumarsenit (As) führte zur Bildung von SG, allerdings in einer geringeren Anzahl von infizierten Zellen, verglichen mit nicht infizierten, behandelten Zellen. Die Ergebnisse weisen auf eine Hemmung von SG in mit EBOV infizierten Zellen hin. Zur besseren Visualisierung von SG wurde für die weiteren Untersuchungen eine Zelllinie verwendet, die das SG-Markerprotein „ras-GAP SH3 domain binding protein 1“ (G3BP) konstitutiv exprimiert. In mit EBOV infizierten, G3BP-exprimierenden Zellen wurden SG mit zwei verschiedenen Toxinen induziert, As und Hippuristanol (Hip). Während As die Phosphorylierung von eIF2α induziert, bewirkt Hip die Hemmung der eIF4A-abhängigen Translationsinitiation, ein Prozess, der unabhängig von der Phosphorylierung von eIF2α zu der Bildung von SG führt. SG-Bildung wurde durch beide Toxine in mit EBOV infizierten Zellen ausgelöst, eine Reduktion wurde allerdings nur für die Bildung von As-induzierten SG in mit EBOV infizierten Zellen beobachtet. Interessanterweise wurden zudem SG-ähnliche G3BP-EGFP-Aggregate in den viralen Einschlusskörpern beobachtet, die sowohl in behandelten als auch in nicht behandelten EBOV-infizierten Zellen auftraten. Es konnte weiterhin durch Transfektionsversuche gezeigt werden, dass die Bildung viraler Einschlusskörper, die durch die Expression von Nukleokapsidproteinen induziert wurde, nicht ausreichend war, um die Aggregation von G3BP-EGFP in den viralen Einschlusskörpern zu bewirken. Dies lässt darauf schließen, dass andere Faktoren, wie beispielsweise virale RNA, benötigt werden, um SG-Komponenten in die viralen Einschlusskörper zu rekrutieren. Diese Ergebnisse weisen auf eine Hemmung der zellulären Stressantwort durch EBOV hin, die auf der Inhibition der Bildung von SG und auf einer Sequestierung essentieller SG-Komponenten beruht. Zur weiteren Charakterisierung der Inhibition von SG durch EBOV wurden in Transfektionsversuchen die RNA-bindenden EBOV Proteine NP, VP30 und VP35 einzeln exprimiert. Während VP30 mit SG kolokalisierte ohne diese zu beeinträchtigen, wurde für das dsRNA-bindende VP35 eine inhibierende Wirkung auf die Bildung von SG beobachtet. In Zellen, die VP30 oder VP35 gemeinsam mit NP exprimierten, wurden beide Proteine in die von NP induzierten Einschlusskörper rekrutiert, und die Kolokalisation mit SG war entweder stark reduziert oder nicht vorhanden. Dies wurde auch in mit EBOV infizierten Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass VP30 und VP35 nur in ungebundener Form mit SG interagieren. Die Menge an freien VP30- und VP35-Proteinen in EBOV-infizierten Zellen ist wahrscheinlich zu gering, um in der Immunfluoreszenzanalyse detektiert zu werden. Unter As-induzierten Stressbedingungen wird die „dsRNA dependent protein kinase“ (PKR) von dem zellulären Protein „PKR activating protein“ (PACT) aktiviert. Aktivierte PKR phosphoryliert eIF2α, was zur Bildung von SG führt. Die Aktivierung von PKR durch dsRNA wird von dem EBOV-Protein VP35 effizient inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die As-induzierte Aktivierung von PKR nicht von EBOV inhibiert werden kann. Fabrozzi et al. (2011) konnten bereits eine Bindung zwischen VP35 und PACT in nicht gestressten Zellen nachweisen. In dieser Arbeit wurde diese Bindung durch Coimmunpräzipitationsanalysen bestätigt und zudem gezeigt, dass in mit As behandelten Zellen VP35 nicht in der Lage ist an PACT zu binden. Dies könnte eine Bindung von PACT an PKR ermöglichen und damit zu der beobachteten Aktivierung von PKR führen. Die Aktivierung von PKR in mit EBOV infizierten Zellen nach As-Behandlung könnte auch die Bildung von SG in diesen Zellen erklären. Aus der beobachteten Reduktion von As-induzierten SG in EBOV-infizierten Zellen wird geschlossen, dass VP35 SG-Komponenten inhibiert oder relokalisiert. Dies scheint mit der Expressionsrate von VP35 zusammenzuhängen. Zur weiteren Charakterisierung der zellularen Stressantwort wurde die Rolle von PB in EBOV infizierten Zellen näher untersucht. Hierzu wurde eine Zelllinie verwendet, die das PB-Markerprotein „mRNA-decapping enzyme 1A” (DCP1a) exprimiert. Eine Rekrutierung von As-induzierten PB an die viralen Einschlusskörper, die aber nicht zu einer Kolokalisation führte, konnte in EBOV infizierten Zellen beobachtet werden. Diese wurde auf die von NP initiierte Bildung von Einschlusskörpern zurueckgefuehrt. Expressionsstudien zeigten, dass PB mit VP35 kolokalisierten, aber nicht mit VP30 oder NP. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in Zellen, in denen es zu einer durch VP35 bedingten Hemmung der SG-Bildung kam, die entstandenen, diffusen G3BP-EGFP-Aggregate nicht nur mit VP35 kolokalisierten, sondern auch mit PB interagierten. Dies weist darauf hin, dass VP35 mit SG- und PB-Komponenten interagiert und diese verbindet. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass EBOV Mechanismen zur Kontrolle der antiviralen zellulären Stressantwort entwickelt hat, in denen VP35 eine wichtige Rolle spielt, da es mit Komponenten von SG und PB interagiert. Des Weiteren scheint die Bindung zwischen VP35 und PACT eine wichtige Rolle in der Kontrolle von PKR zu spielen.

Land-use change and agricultural intensification are responsible for a global decline of forest cover entailing the fragmentation of forests. Landscapes are increasingly shaped by a mosaic of forest fragments within variable matrix habitat. It is thus essential to understand how these habitat alterations influence function and stability of forest ecosystems. However, the complex relationships between anthropogenic disturbance of forests, concurrent species loss and ecosystem functions are not fully clarified yet. In the present thesis, I investigated the impact of structural forest fragment quality and variable matrix habitat on biodiversity and ecological processes of forest regeneration. For this purpose, I conducted three studies in a fragmented mosaic-forest landscape in KwaZulu-Natal, South Africa. In particular, I assessed (1) seed predation by rodents, (2) establishment of woody seedlings and saplings, and (3) leaf damage on woody seedlings and saplings by insects and pathogens in 24 study plots in scarp forest fragments. These fragments were embedded in four variable matrices: two natural, heterogenous (forest, grassland) and two modified, homogenous matrices (eucalypt plantations, sugarcane fields). In the first field study I assessed rodent diversity and conducted seed predation experiments. As a measure for forest fragment quality important for rodents, I estimated herbal ground vegetation cover. For the second study I identified all trees on 500 m², seedlings on 10 m² and saplings on 50 m² per study plot. I categorized trees, seedlings and saplings as either early- or late-successional species. Moreover, I differentiated between seedlings and saplings of external and local origin depending on the presence of conspecific adult tress within fragments to be able to identify potential seed influx by seed dispersers. Additionally, I measured canopy cover, light intensity and vegetation complexity as parameters of forest fragment quality relevant to seedling establishment. In the third study I used beating samples to collect the arthropod community. Furthermore, I estimated proportions of leaf damage by insect herbivory and leaf pathogens on woody seedlings and saplings. I determined tree diversity, canopy cover and vegetation complexity in terms of forest fragment quality. My investigations showed an increase of rodents and seed predation in small forest fragments, potentially caused by enhanced ground vegetation cover. Especially in fragments with sugarcane matrix rodent abundance and seed predation were significantly higher than in fragments with forest matrix. Further, I found reduced seedling and sapling establishment in forest fragments with modified homogenous surroundings. In particular, these fragments consisted of less late-successional species. This could predominantly be ascribed to reduced canopy cover and increased light intensity. However, seed influx occurred in all forest fragments indicating high matrix permeability for seed dispersers. Moreover, forest fragment quality amplified arthropod predator abundance and reduced arthropod herbivore abundance. Fragment quality effects on herbivory were variable. This mismatch might be related to weak trophic interactions. Matrix habitat had merely marginal effects on the investigated factors. Overall, my results illustrate that forest fragment quality as well as matrix habitat have the potential to alter biodiversity and ecological processes of forest regeneration, but effects on the observed processes differed in strength. Yet, I generally found that forest fragment quality appears to be of high relevance for regeneration, indicating its potential for conservation management of the remaining fragments. Further, the rather weak overall effects of matrix habitat indicate a comparable and generally high permeability for the investigated groups of species. This emphasizes the significant value of forest fragments for the connectivity of remaining forests and the conservation of biodiversity and ecological processes at a landscape scale. Nevertheless, conclusions have to be treated with care. Due to the historical natural fragmentation of scarp forests in KwaZulu-Natal, which might have caused a higher robustness of species towards human-induced fragmentation, my findings might not be transferable to other regions. The scarp forest fragments are characterized by high habitat quality for the different species groups. However, potential shifts in the plant community from late- to early-successional species in fragments enclosed by modified matrices might entail unforeseen cascading effects and negative feedback loops within the ecosystem that still need to be examined. Thus, the value of natural forest as a source of propagules and as habitat for forest specialists remains indisputable.

CPD-Photolyasen sind Enzyme, die lichtabhängig Cyclobutanpyrimidindimer (CPD), eines der Hauptprodukte der UV-abhängigen DNA-Schädigung, reparieren. Sie können bei fast allen Lebewesen gefunden werden und spielen eine zentrale Rolle bei der UV-Resistenz dieser Organismen. Als monomeres, fehlerfrei und energieneutral arbeitendes Reparatursystem sind sie ein geeignetes Werkzeug für die biotechnologische Verbesserung der UV-Toleranz. So könnten sie helfen, den negativen Folgen der erhöhten UV-Belastung, die durch das Ozonloch entstehen, entgegen zu wirken. In Escherichia coli rekombinant überexprimiert bindet die CPD-Photolyase aus Thermus thermophilus FMN als zweiten Kofaktor. Im Gegensatz hierzu binden die meisten anderen diesbezüglich analysierten Photolyasen Methenyltetrahydrofofalt oder Deazaflavin als zweiten Kofaktor. In dieser Arbeit wird durch Absorptions- und Wirkungsspektroskopie gezeigt, dass FMN als Antennenchromophor fungiert und die absorbierte Lichtenergie auf den katalytisch aktiven FAD-Kofaktor überträgt. Hierdurch wird die Photoreduktion und Enzymaktivität der Thermus thermophilus Photolyase deutlich verbessert. Als sessile und photoautotrophe Organismen sind Pflanzen in besonderem Maße UV- und Lichtstress ausgesetzt. Sie besitzen hochkomplexe Signal- und Schutzmechanismen, um sich optimal an die an ihrem Standort vorherrschenden Lichtbedingungen anzupassen. Bei der UV-Toleranz von Pflanzen spielen CPD-Photolyasen eine zentrale Rolle. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die gezielte Verbesserung der Reparatur von CPD-Schäden durch die Überexpression der Arabidopsis CPD-Photolyase in Arabidopsis thaliana einen positiven Effekt auf die UV-Toleranz der Pflanzen hat. Hierfür wurde der kodierende Bereich des CPD- Photolyasegens (At-PHR1) mit dem starken und konstitutiven 35S CaMV Promotor fusioniert und Arabidopsis stabil mit dem resultierenden Konstrukt transformiert. Die stabile Integration des Transgens in das Genom wurde durch Southern Blot überprüft und zudem die Anzahl der T-DNA-Insertionen bestimmt. Die Überexpression wurde dann auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene bestimmt. Es konnten deutlich erhöhte Transkript- und Proteinmengen von CPD-Photolyase in den transgenen Linien nachgewiesen werden. Um den Einfluss der At-PHR1-Überexpression auf die Reparatur von CPD-Schäden zu untersuchen, wurden Rosettenblätter mit UV-B und UV-A reichem Licht bestrahlt und die CPD-Akkumulationsrate bestimmt. Hierbei zeigte sich eine deutlich verringerte Akkumulation von CPDs in den transgenen Linien. Weiterhin wurde untersucht, wie sich die Reduktion der CPD-Akkumulation auf das Wachstum der Pflanzen auswirkt. Hierzu wurde das Frischgewicht und der Rosettendurchmesser der unter UV-Stress angezogen Pflanzen bestimmt. Hierbei zeigen die Photolyase-überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp eine deutlich geringere Sensitivität gegenüber UV-B. In der Literatur gibt es widersprüchliche Angaben zur zellulären Lokalisation von CPD-Photolyasen in Pflanzen. Durch Konfokale Laser Scanning Mikroskopie von Arabidopsis Protoplasten, die ein At-PHR1::GFP Fusionsprotein exprimierten, wird hier gezeigt, dass die zelluläre Lokalisation von At-PHR1 auf den Zellkern beschränkt ist.

The data presented in this thesis identifies a subpopulation of CCR9- MHC class IIlow BST2+ Siglec H+ plasmacytoid dendritic cells (pDCs) within the bone marrow (BM) pDC population. CCR9- MHC class IIlow BST2+ Siglec H+ pDCs express the essential pDC transcription factor E2-2 and produce high levels of interferon-α (IFN-α) and proinflammatory cytokines upon toll-like receptor 9 (TLR9) stimulation. This phenotypically immature pDC population is an immediate precursor for fully differentiated CCR9+ pDCs in vitro as well as in vivo, but does not harbour a pDC-specific gene rearrangement in the Ig gene locus. CCR9- pDCs retain plasticity to downregulate pDC specific surface molecules and upregulate CD11b and MHC class II, acquiring phenotype and function of CD8α- CD11b+ conventional dendritic cell (cDC) - like cells after conditioning with supernatant derived from colonic epithelial cells or exposure to recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) in vitro. Functionally cDC-like cells generated from CCR9- pDCs acquire properties of cDCs such as efficient T cell activation and the production of high levels of proinflammatory cytokines comparable to those of splenic CD8α- DCs. This phenotypic and functional change is also reflected on the level of transcription factor expression by downregulation of E2-2, Spi-b and IRF8 but upregulation of ID2, PU.1 and BATF3. CCR9- pDCs can give rise to fully differentiated CCR9+ pDCs and CD11b+ MHC class IIhigh cDC-like cells locally in the tissue in vivo in the steady state. However the plasticity and lineage commitment of CCR9- pDCs is regulated in a tissue specific manner. In BM and liver CCR9- pDCs primarily give rise to CCR9+ pDCs, whereas in spleen, lymph nodes, lung and small intestine a substantial fraction deviates from the pDC lineage to the cDC lineage. Furthermore, this study shows that GM-CSF is necessary for the appearance of CCR9- pDCs and CCR9+ pDCs in lung and small intestine but is dispensable for the generation of CD11b+ MHC class IIhigh cDCs from CCR9- pDCs in vivo. Moreover, GM-CSF controls the proliferation of CCR9- and CCR9+ pDCs in BM and spleen upon adoptive transfer. In conclusion these results show that CCR9- pDCs are tissue resident precursors of pDCs and cDCs and that the generation of DC subsets is regulated by tissue derived factors, thereby allowing adaptation to local microenvironments. This increases the flexibility of the DC compartment under circumstances of infection or inflammation.

Die extrazelluläre Matrix von Myxococcus xanthus ist ein essentieller Bestandteil für ein funktionelles Typ-IV-Pili-abhängiges Bewegungssystem sowie für den kontrollierten Ablauf des charakteristischen Entwicklungs-programms in nährstoffarmer Umgebung. Die korrekte Zusammensetzung der extrazellulären Matrix wird über Proteine von Zwei-Komponenten-Systemen einschließlich des verwaisten Antwortregulators DigR reguliert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die verwaiste Hybrid-Histidinkinase SgmT charakterisiert und als korrespondierender Partner von DigR identifiziert. Neben einer Kinase- und einer Empfängerdomäne besitzt SgmT eine N-terminale GAF-Domäne und eine C-terminale GGDEF-Domäne. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Analysen wurde die Funktion der einzelnen Domänen von SgmT untersucht, wobei die GAF-Domäne als sensorische Haupteinheit fungiert und die Kinaseaktivität von SgmT steuert. Die GGDEF-Domäne ist ein Rezeptor für den sekundären Botenstoffs c-di-GMP, der SgmT abhängig von dessen Bindung zellulär lokalisiert. Desweiteren wurde eine DigR-Bindestelle im Promoter von fibA identifiziert, einem Gen, das für eine extrazelluläre Matrixprotease kodiert. Die Identifikation weiterer DigR-Bindestellen in den Promotorregionen von signifikant-regulierten Genen aus vergleichenden Transkriptomstudien lässt vermuten, dass das SgmT/DigR-Regulon aus Genen besteht, die für sekretierte Proteine sowie für Enzyme des Sekundärmetabolismus kodieren. Diese Beobachtungen geben Grund zur Annahme, dass SgmT und DigR die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix direkt regulieren, und dass die Funktion von SgmT über zwei sensorische Domänen gesteuert wird, wobei die Kinaseaktivität durch Ligandenbindung an die GAF-Domäne und die zelluläre Lokalisierung von SgmT über die Bindung von c-di-GMP an die GGDEF-Domäne reguliert wird. Desweiteren wurden konservierte c-di-GMP-abhängige Proteine in M. xanthus identifiziert und damit begonnen deren Einfluss auf wichtige zelluläre Prozesse hin zu untersuchen. Darüber hinaus wurden erste Erkenntnisse gewonnen, dass c-di-GMP möglicherweise an der Koordination des Entwicklungsprogramms beteiligt sein könnte., The extracellular matrix of Myxococcus xanthus is essential for type IV pili-dependent motility and starvation-induced fruiting body formation. The composition of the extracellular matrix is regulated by proteins of two-component systems including the orphan response regulator DigR. In this work I identified and characterized the orphan hybrid histidine kinase SgmT as corresponding partner of DigR. SgmT contains an N-terminal GAF domain and a C-terminal GGDEF domain. Using genetical and biochemical analyses the function of each domain was addressed. I found that the GAF domain is the primary sensor domain, while the GGDEF domain binds the second messenger bis-(3′-5′)-cyclic-dimeric-GMP (c-di-GMP) and functions as a receptor to spatially sequester SgmT. In addition, a DigR binding site has been identified in the promoter of the fibA gene, encoding for an abundant extracellular matrix-associated zinc-metalloprotease. Comparative expression studies in combination with the identified DigR binding site allowed the revelation of the SgmT/DigR regulon-containing genes, encoding for secreted proteins and enzymes involved in secondary metabolite synthesis. These findings strongly indicate that: 1.) SgmT/DigR regulates the composition of the extracellular matrix and 2.) SgmT activity is regulated by two sensor domains with ligand binding to the GAF domain resulting in SgmT kinase activation and c-di-GMP binding to the GGDEF domain resulting in spatial sequestration of SgmT. Additionally, conserved c-di-GMP-dependent proteins were identified in M. xanthus and I started to investigate their function in important cellular processes. Preliminary data show that c-di-GMP participates in the regulation of the starvation-induced developmental program of M. xanthus.

Ustilago maydis, the causative agent of corn smut disease, depends on a variety of secreted effector proteins, to establish a biotrophic interaction with its host plant maize. The deletion of the gene um01987, which encodes the effector protein Pep1, leads to a complete loss of pathogenicity. Moreover the plant reacts to penetration attempts of the Δpep1-mutant strain with the induction of different defense reactions. This results in e.g. the formation of necrotic lesion as well as in the production of reactive oxygen species at the penetration sites. Pep1 is conserved among different species of smut fungi and contains a N-terminal signal peptide, a conserved core region as well as a low conserved glycine- and serine-rich C-terminus. In the present study, the effector protein Pep1 was heterologously expressed and purified. Via biochemical and molecular biological methods, two plant interaction partners of Pep1 were identified. By Activity based protein profiling it could be demonstrated, that Pep1 specifically inhibits the activity of papaine like cysteine proteases. Particularly, the activity of papaine like cysteine proteases, induced by the salicylic acid signaling pathway, was inhibited by Pep1 very efficiently. Obviously, these proteases are critical for the induction of maize plant defense. Additionally, Pep1 binds and inhibits plant class-III-heme-peroxidases. In cooperation with Christoph Hemetsberger, the in vitro inhibition of the horseradish peroxidase (HRP) could be shown. Moreover the physical interaction of Pep1 with the HRP was demonstrated. During the Δpep1-infection, a single peroxidase, the maize peroxidase-12, is transcriptionally upregulated. Virus induced gene silencing of the peroxidase-12 lead to a partial complementation of the Δpep1-mutant phenotype on POX12si plants. Thus, silencing of peroxidase-12 leads to the suppression of plant defense reactions, such as the formation of papillae, which enables the Δpep1-mutant strain to successfully penetrate the plant tissue. Taken together these results show, that Pep1 inhibits enzymes of the basal plant defense and therefore suppressing the innate immunity of maize against U. maydis., Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, benötigt zur Etablierung einer biotrophen Interaktion mit seiner Wirtspflanze Mais eine Vielzahl sekretierter Effektoren. Die Deletion des für den Effektor Pep1 kodierenden Gens um01987 führt zum vollständigen Pathogenitätsverlust. Die Pflanze reagiert auf Penetrationsversuche der Δpep1-Mutante mit der Induktion verschiedener Abwehrreaktionen, was sich z.B. durch die Bildung nekrotischer Läsionen sowie reaktiver Sauerstoffspezies an den Penetrationsstellen zeigt. Pep1 ist zwischen verschiedenen Brandpilzarten konserviert und besteht aus einem N-terminalen Signalpeptid, einem konservierten Kernbereich sowie einem weniger konservierten Glycin- und Serin-reichen C-Terminus. In der vorliegenden Arbeit wurde das heterolog in E. coli exprimierte Pep1 aufgereinigt. Durch biochemische und molekularbiologische Methoden konnten zwei pflanzliche Bindungspartner von Pep1 identifiziert. So konnte mittels Aktivitäts-basiertem Protein-Profiling gezeigt werden, dass Pep1 spezifisch apoplastische Papain-ähnliche Cysteinproteasen inhibiert. Diese Proteasen spielen offenbar eine wichtige Rolle in der Abwehrinduktion in der Maispflanze. Des Weiteren bindet und inaktiviert Pep1 pflanzliche Klasse-III-Häm-Peroxidasen. In Kooperation mit Christoph Hemetsberger konnte die Hemmung der Horseradish-Peroxidase (HRP) durch Pep1 in vitro gezeigt. Außerdem konnte die physische Interaktion von Pep1 mit der HRP bewiesen werden. Während der Δpep1-Infektion wird eine Mais Peroxidase, die sekretierte Peroxidase-12, transkriptionell induziert. Durch Virus-induziertes-Gen-silencing der Peroxidase-12 konnte eine partielle Restauration des Δpep1-Phänotyps auf POX12si-Pflanzen bewirkt werden. So führte das silencing der Peroxidase-12 zu einer Unterdrückung pflanzlicher Abwehrreaktionen, wie z.B. der Papillenbildung, was eine erfolgreiche Penetration der Δpep1-Mutante ermöglichte. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass Pep1 Enzyme der basalen Pflanzenabwehr inhibiert und somit die angeborene Resistenz der Wirtspflanze gegen U. maydis unterdrückt.