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Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias O periodonto é o órgão que envolve e sustenta o dente, sendo constituído pelo osso alveolar que forma o alvéolo dentário, o cemento que envolve a raiz do dente, o ligamento periodontal que estabelece a ligação entre os dois tecidos anteriores formando uma articulação e a gengiva. A periodontite é uma doença inflamatória de elevada prevalência em cães e seres humanos e que, quando não tratada, pode conduzir à esfoliação dentária e colocar em risco a vida do doente devido às manifestações sistémicas decorrentes pela dispersão sanguínea de mediadores inflamatórios e microrganismos patogénicos. Os tratamentos que atualmente se usam para tratar esta patologia revelam-se muitas vezes ineficazes. A Engenharia de Tecidos emergiu, recentemente, como uma potencial terapia alternativa. Esta abordagem consiste no fornecimento de um biomaterial de suporte semeado com células estaminais que visa a regeneração ad integrum da arquitetura e da função biológica do tecido afetado. As células estaminais mesenquimatosas de origem oral e dentária têm a capacidade de regenerar os tecidos periodontais. No entanto, as células provenientes destes locais pressupõem uma morbilidade significativa associada ao local da colheita e possuem um baixo rendimento celular em comparação com fontes não-orais, como por exemplo o tecido adiposo. As células estaminais derivadas do tecido adiposo (ASCs) possuem um grande potencial de aplicação em terapias celulares devido à sua facilidade de colheita e baixa morbidade associada, ao alto rendimento de células isoladas e à capacidade demonstrada para se diferenciarem em inúmeras linhagens celulares. O principal objetivo da presente Tese consistiu no desenvolvimento de uma nova abordagem de Engenharia de Tecidos para o tratamento de defeitos periodontais com base numa matriz biodegradável combinada com ASCs. Partindo do conhecimento de que o cão é o modelo animal mais relevante para estudar a doença periodontal em humanos, pretende validar-se esta estratégia de Engenharia de Tecidos em modelo canino antes da aplicação translacional para a Medicina Humana, sem descuidar nunca que esta doença assume também grande importância na Medicina Veterinária. Tendo isto em consideração, o trabalho desenvolvido nesta Tese teve como principais objetivos:  Otimizar a colheita e o isolamento de ASCs caninas (cASCs) provenientes de diferentes regiões anatómicas e caracterizar a sua estaminalidade e o seu potencial osteogénico em diferentes passagens;  Avaliar a resposta à implantação de cASCs em modelo subcutâneo de murganho saudável;  Desenvolver e caracterizar um material de suporte (scaffold) biodegradável de dupla camada que vise a regeneração de defeitos periodontais;  Avaliar o potencial in vitro do scaffold de dupla camada desenvolvido para uso em Engenharia de Tecidos através da sua cultura com cASCs;  Avaliar a funcionalidade in vivo do scaffold para a regeneração óssea, utilizando um modelo de defeito mandibular em rato. A fim de alcançar os objetivos propostos, numa primeira etapa, as amostras de tecido adiposo canino foram colhidas a partir de duas localizações anatómicas diferentes, a saber, tecido subcutâneo e tecido omental, e o isolamento das cASCs foi posteriormente otimizado. A estaminalidade destas células e o potencial de diferenciação osteogénica foram analisadas ao longo das diferentes passagens através de RT-PCR em tempo real e histologia. Posteriormente, as mesmas cASCs foram xenotransplantadas em murganho, a fim de avaliar a resposta xenogénica do hospedeiro contra as mesmas. Concomitantemente, desenvolveu-se um scaffold composto por uma mistura de amido e poli-ε-caprolactona e compreendendo duas camadas: uma malha tridimensional de fibras (“fiber mesh”) funcionalizadas com grupos silanol para promover a osteogénese ao nível do osso alveolar, e uma membrana obtida por evaporação de solvente com o intuito de atuar como barreira contra a migração de epitélio gengival para o interior do defeito periodontal. Os scaffolds obtidos foram extensivamente caracterizados quanto às suas propriedades mecânicas, ao comportamento de degradação e à eficácia da técnica de funcionalização. De seguida, os scaffolds foram semeados com cASCs a fim de avaliar a funcionalidade in vitro das construções obtidas. Como forma de avaliar a capacidade dos scaffolds desenvolvidos para promover a regeneração óssea, estes foram implantados num defeito circular de tamanho crítico induzido na mandíbula do rato, e a formação de novo osso foi determinada após oito semanas de implantação. Em geral, a estaminalidade e o potencial de diferenciação osteogénica das cASCs decresceu ao longo de passagens. Além disso, demonstrou-se também que a origem anatómica do tecido adiposo tem um efeito significativo nas duas características analisadas. Após a injeção de cASCs num hospedeiro xenogénico (murganho), não foi observada nenhuma resposta inflamatória local exuberante contra as mesmas. A caracterização físico-química do scaffold desenvolvido demostrou que esta matriz apresenta uma morfologia, composição da superfície, comportamento de degradação e propriedades mecânicas adequadas para auxiliar a regeneração periodontal. Os estudos biológicos com cASCs revelaram o potencial que ambas as camadas têm de permitir a adesão e proliferação celular, bem como de promover a diferenciação osteogénica na malha funcionalizada. Nos defeitos mandibulares experimentais, o scaffold funcionalizado com grupos silanol induziu uma maior formação de osso novo em comparação com a membrana comercial de colagénio e com os defeitos vazios. Além disso, a face composta pela membrana evitou o crescimento do tecido epitelial e conjuntivo para o interior do defeito, o qual é um dos requisitos para o sucesso da regeneração guiada de tecidos. Em resumo, este trabalho demonstrou que o tecido adiposo canino fornece uma fonte alternativa de células estaminais com capacidade de diferenciação osteogénica e que estas não induzem uma resposta inflamatória exuberante no hospedeiro xenogénico. Estes resultados, juntamente com o potencial observado do scaffold desenvolvido para acomodar a proliferação e diferenciação das cASCs cultivadas e para promover a regeneração de osso in vivo, permite propor esta construção como uma alternativa às técnicas atualmente utilizadas na regeneração periodontal, tanto no homem como no cão. Periodontium is the organ which involves and sustains the tooth and it is constituted by the alveolar bone which forms the dental alveolus, the cementum which surrounds the tooth root, the periodontal ligament, which connects them and form a joint, and the gingiva. Periodontitis is an inflammatory pathology highly prevalent in both dogs and humans that, when not treated, can lead to tooth exfoliation and also to life threatening systemic implications due to the blood dispersion of inflammatory mediators and pathogenic microorganisms. The routine clinical therapies currently used to treat periodontal defects are often ineffective. Tissue Engineering has emerged as a valuable alternative approach aiming to regenerate ad integrum the architecture and the biological function of the damaged tissue by providing the repair site with a suitable supportive biomaterial seeded with stem cells. Mesenchymal stem cells from oral and dental origin have the ability to regenerate the periodontium; however, harvesting cells from these sites implies significant local tissue morbidity and low cell yield, as compared to non-oral sources, such as the adipose tissue. Adipose-derived stem cells (ASCs) hold a great potential in cell based therapies for their easiness of harvesting with low morbidity, generating high yields of cells with capacity to differentiate into several lineages. The main goal of this Thesis was to develop a new Tissue Engineering approach for the treatment of periodontal defects, based on an innovative biodegradable supportive matrix combined with ASCs. As the dog is the most relevant animal model to study human periodontal disease and, simultaneously, an important subject in Veterinary Medicine, we envisioned to validate this Tissue Engineering strategy in a canine model prior to the translation of this strategy for human application. With this in mind, the work aimed to achieve the following distinct objectives:  Optimize harvesting and isolation of canine ASCs (cASCs) from different anatomical regions and characterize their stemness and osteogenic potential at different passages;  Evaluate the response to the implantation of cASCs in a healthy mice subcutaneous model;  Develop and characterize a double layer biodegradable scaffold meeting the requirements to achieve different functionalities, targeting regeneration of periodontal defects;  Evaluate the potential of the developed double layer scaffold for Tissue Engineering by culturing it with cASCs,  Assess the in vivo functionality of the scaffold for bone regeneration, using a rat mandibular defect model. In order to achieve the proposed objectives, in a first stage, canine adipose tissue samples were harvested from two different anatomical sites, namely subcutaneous and omental adipose tissue, and the isolation of cASCs was optimized. The stemness and the osteogenic differentiation potential of these cells were analyzed along passages using real time RT-PCR and staining procedures. Subsequently, the same stem cells were xenotransplanted (into a mouse model) in order to evaluate the response of the xenogenic host against the cASCs. Concomitantly, a double layer scaffold made of a blend of starch and poly (ε-caprolactone) was designed, comprising a 3D fiber mesh functionalized with silanol groups to promote osteogenesis and a solvent casting membrane aiming to act as a barrier against the migration of gingival epithelium into the periodontal defect. The obtained scaffolds were extensively characterized regarding their mechanical properties, degradation behaviour and effectiveness of the functionalization. Ultimately, the scaffolds were seeded/cultured with cASCs to assess the in vitro functionality of the obtained constructs. Finally, to assess the ability of the developed scaffold to promote bone regeneration, these were implanted in a circular critical size defected induced in rat mandible, and the formation of new bone was quantified after 8 weeks of implantation. In general, the stemness and osteogenic differentiation potential of the cASCs was found to decrease along increasing passages. Additionally, it was shown that the anatomical origin of the adipose tissue has a significant effect in the osteogenic differentiation ability of these cells. After the injection of cASCs in a xenogenic host (mouse), it was proved that no significant local immunogenic response was detected against them. The physicochemical characterization of the newly developed double layer scaffold showed that this matrix presents a morphology, surface composition, degradation behaviour and mechanical properties suitable for assisting periodontal regeneration. The biological studies with cASCs revealed the potential of both layers to allow cellular adhesion and proliferation, and also to promote the osteogenic differentiation on the functionalized fiber mesh. In the induced mandibular defect, the functionalized scaffold with silanol groups was shown to enhance higher new bone formation in comparison to a collagen commercial membrane and to empty defects. Moreover, the membrane layer was observed to avoid the epithelial and connective tissue ingrowth, which is one of the main requirements for guided tissue regeneration. In summary, this work demonstrated that the canine adipose tissue provides an alternative source of stem cells with the ability to differentiate into different cellular lineages and which do not induce an in vivo inflammatory response in the xenogeneic host. These findings together with the observed potential of the developed scaffold to accommodate the proliferation and differentiation of the cultured cASCs and to enhance in vivo bone regeneration allows to propose this tissue-engineered matrix for periodontal regeneration as an alternative to the techniques currently used in the dentistry field, both in human and in veterinary medical practice.