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International audience; Symbiosis is a key source of ecological and evolutionary diversification of eukaryotic organisms throughout the animal and plant kingdoms. In insects that are obligatorily dependent on intracellular bacterial symbionts, novel host cells, the bacteriocytes, have evolved for harboring beneficial microbial partners. These cells constitute a fascinating riddle in developmental cell biology, as their embryonic origin and the molecular mechanisms governing their development and organogenesis, as well as their elimination in response to host physiology, remain largely unsolved.Here we report the discovery of a hitherto unknown cell-death process involved in the degeneration of bacteriocytes in the pea aphid Acyrthosiphon pisum/Buchnera aphidicola symbiotic system, which emerged in recent years as a powerful model for studying symbiotic relationships. This new form of cell death is activated progressively throughout aphid adulthood and exhibits morphological features distinct from evolutionary conserved pathways, including apoptosis- or autophagy-dependent cell deaths. By combining electron microscopy, immunohistochemistry, and molecular analyses, we demonstrated that the initial event of bacteriocyte cell death is the cytoplasmic accumulation of non-autophagic vacuoles, followed by a sequence of cellular stress responses including the formation of autophagosomes in intervacuolar spaces, swelling of bacteriocyte mitochondria, activation of reactive oxygen species, and Buchnera aphidicola endosymbiont degradation by the lysosomal system. This multistep cell-death process originates from the endoplasmic reticulum, an organelle exhibiting a unique reticular network organization in these cells, probably imposed by the presence of millions of Buchnera endosymbionts in each bacteriocyte (Simonet et al., 2018, PNAS, doi: 10.1073/pnas.1720237115). Our findings reveal novel mechanisms by which both bacteriocyte cell and symbiotic bacterial numbers are controlled to maintain organismal homeostasis. They also shed light on previously unknown consequences of persistent obligatory symbiotic bacteria on the cellular organization and functioning of bacteriocytes in their eukaryotic hosts.

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International audience; « ArthropodaCyc » : une collection de bases de données enrichies à l’aide de CycADS pour étudier et comparer le métabolisme des arthropodes.Patrice Baa-Puyoulet1, Augusto F. Vellozo2,3, Jaime Huerta-Cepas4, Gérard Febvay1, Federica Calevro1, Toni Gabaldon4, Marie-France Sagot2,3, Hubert Charles1,3 et Stefano Colella1,*.1 UMR203 BF2I, Biologie Fonctionnelle Insectes et Interactions, INRA, INSA-Lyon, Université de Lyon, Villeurbanne, France; 2 Université Lyon 1, CNRS, UMR5558, Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive, Villeurbanne, France; 3 BAMBOO, INRIA Rhône-Alpes, France; 4 Center for Genomic Regulation, Barcelona, Spain ; * contact : Stefano.Colella@lyon.inra.frAprès la publication de plusieurs génomes d’arthropodes, de nombreuses autres espèces vont être séquencées dans un futur proche, en particulier à travers l’initiative i5ki. La disponibilité de ces multiples séquences ouvre la voie à des études comparatives entre espèces afin de mieux comprendre les différents aspects de la biologie des arthropodes. Ces études nécessitent l’intégration des données génomiques et fonctionnelles en évolution constante : les séquences génomiques et l’annotation fonctionnelle des protéines devant être collectées de sources et méthodes variées et mises à jour régulièrement.Durant l’annotation du génome du puceron du pois (Acyrthosiphon pisum) nous avons développé CycADSii (Cyc Annotation Database System), un système de gestion d’annotations automatisé permettant l’intégration des informations qui sont utilisées pour la reconstruction des réseaux métaboliques. Les données issues de Genbank et/ou de bases de données génomiques spécifiques, ainsi que les annotations fonctionnelles obtenues par les méthodes KAAS-KEGG, PRIAM, Blast2GO, PhylomeDB et MetaPhOrs, sont collectées dans CycADS. Ces annotations sont ensuite extraites, avec possibilité d’appliquer différents filtres de qualité, pour produire les fichiers d’entrée de PathwayTools, un logiciel qui génère et/ou met à jour des bases de données métaboliques de type BioCyc. Nous avons utilisé CycADS pour créer ArthropodaCyciii, une collection de bases de données métaboliques qui, à ce jour, contient 22 arthropodes: [Arachnida] Ixodes scapularis ; [Coleoptera] Tribolium castaneum ; [Crustacea] Daphnia pulex ; [Diptera] Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus, Drosophila melanogaster, Glossina morsitans ; [Hemiptera] Acyrthosiphon pisum, Rhodnius prolixus ; [Hymenoptera] Apis mellifera, Nasonia vitripennis, Atta cephalotes, Acromyrmex echinatior, Camponotus floridanus, Harpegnathos saltator, Linepithema humile, Pogonomyrmex barbatus, Solenopsis invicta, [Lepidoptera] Danaus plexippus, Heliconius melpomene ; [Phthiraptera] Pediculus humanus. Dans ces bases, nous avons ajouté de nombreux liens externes vers les données génomiques de chaque organisme (AphidBase, BeetleBase, VectorBase, Hymenoptera Genome, FlyBase, wFleaBase, MonarchBase, ButterflyGenome) et d’annotation fonctionnelle (Brenda-Enzyme, Gene Ontology, KEGG Orthology et PhylomeDB). Notre collection de bases métaboliques permet alors de réaliser des analyses comparatives en utilisant les fonctionnalités web interactives d’ArthropodaCyc.Dans le futur, nous prévoyons d’ajouter l’annotation métabolique d’autres génomes en cours de séquençage et d’implémenter des passerelles vers des outils d’analyses de réseaux (tels que MetExplore). Nous sommes aussi ouverts à des collaborations sur des projets de séquençage d’arthropodes en cours, pour participer à la première annotation fonctionnelle des protéines et réaliser la reconstruction de leur métabolisme.i http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K ii http://www4.inra.fr/cycads/iii http://arthropodacyc.cycadsys.org/

International audience; Le puceron du pois est un ravageur important des cultures en région tempérée. Le grand potentiel invasif de cet insecte est essentiellement dû à son système de reproduction, basé pendant le printemps et l’été sur une parthénogenèse vivipare, et à la symbiose obligatoire avec la bactérie Buchnera aphidicola, qui fournit au puceron certains acides aminés essentiels peu présents dans son alimentation. Une étude transcriptomique, récemment conduite dans notre laboratoire, nous a permis de dégager une voie métabolique clé dans le développement parthénogénétique du puceron du pois: la voie de la tyrosine. Afin de mieux caractériser l’importance de cette voie, nous avons étudié l’effet de l’inactivation fonctionnelle par RNAi du gène codant la phénylalanine hydroxylase, enzyme qui transforme la phénylalanine en tyrosine, sur la reproduction parthénogénétique du puceron du pois. L’injection d’ARN doubles-brins dirigés contre ce gène cible de manière privilégiée les compartiments symbiotiques (embryons vivipares et bactériocytes), où nous avons observé une diminution significative de l’expression du gène 1 et 3 jours après l’injection. Les pucerons traités montrent une fécondité réduite (-37 %) et une augmentation (dix fois supérieure) de la mortalité larvaire et de l’apparition de défauts de développement par rapport aux contrôles. Des analyses HPLC sont en cours pour vérifier si les phénotypes observés sont liés à une diminution de la production de tyrosine dans les pucerons traités.

International audience; The pea aphid genome includes 66 genes contributing to amino acid biosynthesis and 93 genes to amino acid degradation. In several respects, the pea aphid gene inventory complements that of its symbiotic bacterium, Buchnera aphidicola (Buchnera APS). Unlike other insects with completely sequenced genomes, the pea aphid lacks the capacity to synthesize arginine, which is produced by Buchnera APS. However, consistent with other insects, it has genes coding for individual reactions in essential amino acid biosynthesis, including threonine dehydratase and branched-chain amino acid aminotransferase, which are not coded in the Buchnera APS genome. Overall the genome data suggest that the biosynthesis of certain essential amino acids is shared between the pea aphid and Buchnera APS, providing the opportunity for precise aphid control over Buchnera metabolism.

International audience; Most bacterial chromosomes consist of a single closed-circular DNA molecule folded into a compact and dynamic structure called the nucleoid. Variations of chromosome 3D-structure act as a global regulatory factor of gene expression. More particularly, the modulation of genome architecture is admitted to belong to the class of mechanisms allowing genome-wide transcriptional profile variation in response to environmental changes [1, 2].We searched for evidences of spatial organization of the chromosome in an extremely intriguing bacterial model: Buchnera aphidicola. Associated with most agricultural pest aphids and being partly responsible for their harmfulness, Buchnera are one of the most studied intracellular symbiotic bacteria of insects. Their genomes present all the characteristics of intracellular bacteria: (1) small size of 400 - 600 kb depending on aphid species, (2) highly biased base composition towards A and T and (3) high evolutionary rate due to the isolation of Buchnera populations within the host cells combined with the drastic bottlenecks that occur in the population dynamics of the bacteria during their transmission to the aphid progeny.A crucial stage for the symbiosis comprehension passes through the understanding of symbiont gene expression regulation, and yet little is known about the transcriptional regulation capabilities of the bacteria. Given the “poor” catalogue of transcriptional factors it was suggested that the bacteria are no longer able to regulate their gene expression. Also, Buchnera conserved target genes for regulatory proteins absent in their genome. Nevertheless, recent works using a dedicated microarray showed that Buchnera respond specifically to somenutritional stresses imposed to their host [3].The aim of this work was to study potential structural units of the Buchnera chromosome and the impact they could have on the gene expression regulation. For this purpose, we analysed the potential structural domains of the chromosome at different scales and the main contributor proteins for the organization and maintenance of these domains. Our study brings evidences for (1) the existence of structural chromosomal units at several scales, (2) a functionally complete set of proteins essential for nucleoid organization and (3) the tight interdependence between these proteins, the chromosome architecture and the gene expression profile.Basic genomic structural elements in bacteria participating to the chromosome organization are transcription units (operons). A transcription unit contains one or several adjacent genes transcribed as a single mRNA. Thus, genes belonging to the same transcriptional unit display strong correlated transcription levels. A first annotation of Buchnera transcription units was available in BioCyc (http://biocyc.org/). We found that some of these transcriptional units were not consistent with the analysis of the gene expression profile. Thus, we decided to re-annotate the transcription units of Buchnera taking into account gene expression levels, gene order conservation, sequence features of Buchnera, like Rho-independent terminators inferred by the bioinformatics tool (TransTermHP, [4]) and specific intergenic distances. We tested this new annotation with microarray gene expression data.A higher level of structural units in bacterial genomes is represented by the organization in topological domains (~10kbp in E. coli [5]). These structures are mainly organized and maintained by Nucleoid Associated Proteins (NAPs). Analysis of the NAP set of Buchnera pointed out that, despite genome reduction, the bacteria retains the most important members of the group (IHF, H-NS, Fis, DnaA and HU). Our bioinformatics analysis of these proteins confirms a strong conservation of structural domains and 3D structure. Moreover, key amino acids (their mutation compromises NAPs function in E. coli) are also well conserved. As NAPs must frequently bind DNA (every 10 kbp) to form dynamic inter-domains barriers, they rather recognize specific topologic structures (i.e., bend DNA) than specific motive binding sites. By using Curvature program [6]), we showed that Buchnera have a more curved DNA than E. coli (this result may be partially explained by the strong A-T bias) , that might influence the size and shape of their topological domains.Combination of topological domains and DNA fold are at the origin of a third class of larger structural units in bacterial chromosomes. Previous results of our team pointed out a periodic transcriptional pattern that supports the existence of these kinds of structures in Buchnera [7]. We completed this work by using a more realistic distance on the chromosome (i.e., physical distance (bp), instead of the “gene number” distance).Our work brings several evidences that Buchnera chromosome is a functional structure probably playing an active role in gene expression regulation. This kind of regulation was often neglected in free-living bacteria but might be central in shrunken genomes of endosymbionts. A short-term perspective of our work will be to inactivate in vivo specific NAP proteins of Buchnera and analyse the induced modifications within the gene expression profile of the symbiotic bacteria.

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International audience; Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la plupart des pucerons d'importance économique. Cette bactérie incultivable est obligatoire pour le puceron qui se nourrit exclusivement de sève phloémienne. Buchnera est caractérisée par la taille extrêmement réduite de son génome (400 à 600 kb) séquencé entièrement chez trois espèces. Une des particularités fonctionnelles tout à fait originale de cette bactérie est la conservation des voies de biosynthèse des acides aminés essentiels, alors que les gènes des voies de synthèse des acides aminés non essentiels (ceux que l'hôte est capable de synthétiser) sont perdus. Jusqu'à présent l'analyse expérimentale des réponses métaboliques et moléculaires ne pouvait s'effectuer que "voie par voie". Le développement de la technique des puces à ADN permet maintenant d'envisager une approche globale. Dans l'UMR BF2I, nous avons développé une puce à ADN dédiée à l'analyse du transcriptome de Buchnera APS (associée au puceron Acyrthosiphon pisum). Cette puce devrait nous permettre d’étudier les mécanismes de régulation de l’expression des gènes de cette bactérie symbiotique en condition de stress trophique de son hôte (pucerons élevés sur des milieux déprimés en acides aminés essentiels par exemple).Ce travail correspond à l'émergence d'une thématique de recherche en bioinformatique à l'INSA associée au développement de la plate-forme transcriptome de la Génopole Rhône-Alpes sur le campus de la Doua. Notre approche s'est voulue verticale, impliquant la création d'outils bioinformatiques lorsqu'ils faisaient défaut. Quatre points seront présentés ici : Le développement d'un Système d'Information pour l'Analyse du Transcriptome (SI-Trans) Le développement d'un logiciel de choix d'oligonucléotides (ROSO) La validation d’un protocole expérimental grâce au développement d’une « minipuce » Buchnera L’intégration des résultats d'expression dans une base de connaissance (Genome Expert Bacteria) pour la représentation des réseaux de régulation

International audience; Les pucerons d’importance économique appartiennent presque tous à la famille des Aphididae (Hemiptera: Aphidoidea: Aphididae). Ils vivent en symbiose avec une bactérie intracellulaire, du genre Buchnera, proche d’Escherichia coli et qui est transmise par voie maternelle. L’association Buchnera / puceron est très ancienne (environ 200 - 250 M d’années) et elle est devenue obligatoire pour les deux partenaires. Les pucerons rendus expérimentalement aposymbiotiques montrent une fécondité nulle et Buchnera ne semble pas cultivable in vitro. L’intervention de Buchnera dans la physiologie de son hôte a été très étudiée au laboratoire notamment pour ce qui concerne le métabolisme des acides aminés. Il a été montré que la bactérie est capable de fournir la totalité des acides aminés essentiels nécessaires au puceron lorsque ceux-ci sont absents de son alimentation. Cette synthèse est réalisée à partir de quelques précurseurs glucidiques ou de quelques acides aminés.Jusqu’au séquençage complet de Buchnera, l’analyse expérimentale des réponses métaboliques et moléculaires ne pouvait s'effectuer que “ voie par voie ”. Le développement de nouveaux outils d’analyse moléculaire (notamment les puces à ADN) et la taille réduite du génome de Buchnera (583 ORF) adaptée à la mise en œuvre de puces de moyenne densité, offrent la possibilité d’explorer globalement l'ensemble des réponses métaboliques de cet organisme.Le but de ce travail est d’explorer par la technologie des puces à ADN le fonctionnement global du génome de Buchnera, et plus particulièrement la régulation du métabolisme des acides aminés jouant un rôle clé dans la relation symbiotique Buchnera / puceron.

International audience; Endosymbiotic associations constitute a driving force in the ecological and evolutionary diversification of metazoan organisms. Little is known about whether and how symbiotic cells are coordinated according to host physiology. Here, we use the nutritional symbiosis between the insect pest, Acyrthosiphon pisum, and its obligate symbiont, Buchnera aphidicola, as a model system. We have developed a novel approach for unculturable bacteria, based on flow cytometry, and used this method to estimate the absolute numbers of symbionts at key stages of aphid life. The endosymbiont population increases exponentially throughout nymphal development, showing a growing rate which has never been characterized by indirect molecular techniques. Using histology and imaging techniques, we have shown that the endosymbiont-bearing cells (bacteriocytes) increase significantly in number and size during the nymphal development, and clustering in the insect abdomen. Once adulthood is reached and the laying period has begun, the dynamics of symbiont and host cells is reversed: the number of endosymbionts decreases progressively and the bacteriocyte structure degenerates during insect aging. In summary, these results show a coordination of the cellular dynamics between bacteriocytes and primary symbionts and reveal a fine-tuning of aphid symbiotic cells to the nutritional demand imposed by the host physiology throughout development. Intracellular symbioses (endosymbioses) between prokaryotic and metazoan organisms play a central role in multicellular life, significantly impacting the evolution and shaping the ecology of countless species 1. In insects, which account for a great proportion of planet biodiversity, the exploitation of the metabolic capabilities of intra-cellular symbiotic bacteria (endosymbionts) enables the hosts to thrive on nutritionally unbalanced diets such as plant sap, grains, wood or vertebrate blood 2–4. The sustainability of these endosymbiotic relationships largely relies on the compartmentalization of bacterial endosymbionts into specialized host cells (or organs), called bac-teriocytes (or bacteriomes), whose functions are adapted to the tolerance and regulation of symbiotic populations 5,6. A detailed description of the interplay between bacteriocytes and endosymbionts across the host life cycle, and in response to an ever-changing environment, is expected to provide a better understanding of how microorganisms interact with eukaryotic cells, and, in turn, to contribute to the development of novel strategies for controlling pest and disease-vector insects. The relationship between aphids (Hemiptera: Aphididae) and the gamma-3-proteobacterium Buchnera aphidicola, represents the best-studied model among endosymbiotic associations. In the A. pisum/B. aphidicola