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Objetivo: Este estudio tiene como objetivo identificar el clima y la cultura organizacional de los enfermeros que trabajan en Ambulancias de Soporte Vital Inmediato (ASVI). Métodos: Se realizó un estudio descriptivo, cuantitativo y transversal con 81 enfermeros portugueses que trabajan en Ambulancias de Soporte Vital Inmediato del Instituto Nacional de Emergencias Médicas (INEM). Los datos se analizaron mediante el método de análisis de componentes principales (ACP), seguido de rotación Varimax, y los modelos se validaron mediante las pruebas de esfericidad de Kaiser-Meyer-Olkin y Bartlett. Resultados: El análisis factorial arrojó cuatro factores, a saber: Apoyo (24,5%), Objetivos (13,6%), Reglas (9,7%) e Innovación (8,01%), asociados al clima y la cultura organizacional. Los enfermeros con un título de grado notaron que recibían bastante más apoyo que quienes tenían calificaciones más altas. El apoyo también varió según el estado civil, dado que los enfermeros casados tenían una percepción mayor del mismo que los que estaban en unión de hecho. Conclusión: El clima y la cultura organizacional contribuyen inequívocamente al desarrollo de un ambiente de trabajo saludable y seguro y son decisivos para la calidad de la atención de enfermería.