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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A tripsina bovina possui seis isoformas, sendo a α-tripsina e a β-tripsina bem caracterizadas em meio aquoso. Algumas diferenças estão bem estabelecidas como a massa molecular, o número de cadeias peptídicas e o perfil de atividade enzimática. Neste trabalho, as isoformas α- e β-tripsina foram comparadas com relação às suas atividades, estrutura e propriedades termodinâmicas no sistema orgânico-aquoso. Os solventes orgânicos polares testados foram metanol, etanol e n-propanol. A atividade enzimática, as mudanças conformacionais e estruturais, a organização supramolecular e a estabilidade termodinâmica foram avaliadas por diferentes técnicas espectroscópicas (UV, CD e DLS) e calorimétricas. Os resultados comparativos mostraram que as alterações induzidas por cada solvente na estrutura e atividade da mesma isoforma de tripsina ocorrem em diferentes concentrações. A isoforma β-tripsina apresentou atividade amidásica superior na presença dos solventes orgânicos testados, sendo os melhores resultados encontrados no etanol. Não foi encontrada redução do conteúdo das estruturas secundárias estruturadas em ambas as isoformas, mas a isoforma β-tripsina sofreu maior grau de rearranjo. A adição de concentração crescente de solvente orgânico causa redistribuição no arranjo supramolecular de ambas as isoformas, com a formação de aglomerados até 60% (v/v). Já em 80% (v/v) de etanol foram observados comportamentos distintos entre as isoformas: enquanto a β-tripsina forma aglomerados reversíveis, a ɑ-tripsina forma agregados insolúveis. O uso de diferentes concentrações de solventes orgânicos revelou um processo de desnaturação mais cooperativo para β-tripsina e um estado nativo menos estável para ɑ-tripsina. Os estudos termodinâmicos comprovaram as previsões feitas com os resultados espectroscópicos e mostraram que a conformação da β-tripsina foi mais resistente às diferentes concentrações de etanol, porém apresentou diferenças conformacionais mais acentuadas quando comparados os resultados entre meio aquoso e meio aquo-orgânico. Já a ɑ-tripsina apresentou menor estabilidade conformacional, representada por reduções gradativas dos parâmetros termodinâmicos até 60% (v/v). Bovine trypsin has six isoforms, being the α-trypsin and β-trypsin isoforms well characterized in aqueous media. Some differences are well established as the molecular weight, the number of peptide chains and enzyme activity profile. In this work, the α- and β-trypsin isoforms were compared concerning their activities, structure, and thermodynamics properties in the aqueous-organic system. The organic polar solvents tested were methanol, ethanol, and n-propanol. Enzyme activity, conformational change, secondary structure, supramolecular organization, and thermodynamics were evaluated by different spectroscopic (UV, CD, and DLS) and calorimetric techniques. The comparative results showed that the changes induced by each solvent on the structure and activity of the same trypsin isoform occur at different concentrations. The β-trypsin isoform showed superior amidase activity in the presence of the tested organic solvents. Better results for enzyme activity are found in ethanol. No statistically significant losses were found in the content of defined secondary structures for both isoforms, but the β-trypsin isoform suffered more rearrangement. The addition of increasing concentration of organic solvent causes redistribution in the supramolecular arrangement of both isoforms, with the formation of agglomerates in 60% (v/v). In 80% (v/v) of ethanol were observed distinct behavior between the isoforms: the β-trypsin formed reversible agglomerates while the ɑ-trypsin formed insoluble aggregates. The use of different organic solvent concentrations revealed a more cooperative denaturation process for β-trypsin and a less stable native state for ɑ-trypsin. The thermodynamic studies have proved all the predictions done with the spectroscopic data and showed that the β-trypsin conformation was more resistant to the different ethanol concentrations. However, it presented more accentuated conformational differences when compared the results between aqueous and aqueous-organic media. On the other hand, the ɑ-trypsin had lower conformational stability, represented by gradual reductions in thermodynamic parameters up to 60% (v/v).

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer de mama é a principal causa de morte em mulheres no mundo e sua incidência aumenta a cada ano. Condições genéticas e ambientais dão suporte para o surgimento de carcinomas com graus de agressividade e processos tumorogênicos distintos. Apesar de ser o câncer mais estudado no mundo, protocolos terapêuticos ainda não são eficientes para conter o número de mortes atuais. A heterogeneidade de tumores sólidos e o estudo in vitro entre linhagens normais e metastáticas dificultam a compreensão do processo carcinogênico e tumorigênico por não conseguirem responder por completo os circuitos celulares que sustem o surgimento e a evolução tumorigênicas das células tumorais. A avaliação de contextos comuns e distintos entre as várias fase da evolução do tumor pode trazer luz a esse processo e subsidiar a construção de medidas diagnósticas e terapêuticas mais eficientes. Utilizando o estudo de linhagens celulares em diferentes estágios tumorigênicos (MCF-10A: origem não tumoral; MGSO-3 e MACL-1: origem de tumor primário; MDA-231-MD: origem metastática), o objetivo desse trabalho foi caracterizar condições que demonstrassem diferenças e semelhanças nos estágios de evolução tumoral através da análise proteômica. Foram identificadas e quantificadas 3.008 proteínas, das quais, após análise estatística com P < 0,05 e fold-change de 1,3, caracterizamos 1.709 proteínas em todas as linhagens celulares. As análises dos gráficos de PCA e do heat map evidenciaram a distinção das linhagens com relação ao seu estágio tumorigênico. Na análise de ontologia gênica, várias vias de sinalização se mostraram alteradas, com enfoque, nesse trabalho, para vias de metabolismo energético, alterações do citoesqueleto e do ciclo celular. Com relação ao metabolismo celular, linhagens tumorais de sítios primários e metastático possuem perfil de regulação distinto, com o catabolismo aeróbico ativo nas células MGSO-3 e MACL-1 e anaeróbico na célula MDA-231-MD. Em conjunto, células tumorais não possuem vias lipolíticas para produção energética, principalmente via β oxidação. Além da via anaeróbica, a linhagem metastática utiliza vias não canônicas para obtenção de energia, como turnover do citoesqueleto de actina. Vias metabólicas correlacionam-se com vias apoptóticas dependentes de mitocôndrias, com vias de BAX e BcL ativas nas linhagens tumorais de origem primária e inativadas pela ação da proteína 14-3-3ε nas linhagens tumorais de origem metastática. Além disso, a densidade de mitocôndrias também está diminuída nas células MGSO-3 e MACL-1 e aumentada na célula MDA-231-MD em comparação a célula MCF-10A. Com relação ao ciclo celular, as linhagens de sítio primário tem suas vias controladas ação do proteassoma 26s, o que não ocorre com a linhagem de sítio metastático. Já a arquitetura do citoesqueleto nas células MGSO-3 e MACL-1 apresentam uma desregulação das suas vias de controle, o que não acontece na célula MDA-231-MD, com processos biológicos de regulação semelhante à célula MCF-10A. Todos os resultados apresentados corroboram para a importância da questão tumorogênica como base da compreensão dos circuitos proteicos que determinam o estabelecimento, sobrevida e maturação de células tumorais e podem subsidiar estudos sobre alvos diagnósticos e terapêuticos mais eficientes. Breast cancer is the leading cause of deaths in women worldwide. Genetic and environmental conditions support the outbreak of carcinomas with varying degrees of aggressiveness and tumorogenesis, leading to the cell transformation to primary cancer cells. Such factors can also give rise to metastasis. Even though breast cancer is one of the most studied type of cancer, yet pharmacological and therapeutic treatments are not efficient to reduce death rate. The ways to study breast cancer are through fragments of solid tumors removed in surgical procedures or in vitro studies using cell lines, though both strategies have limitations. For example, fragment of solid tumor is composed by several cell populations, which leads to high heterogeneity. On the other hand, in vitro studies usually are based on metastatic tumor lines, reflecting only the end of the tumor development process. The main objective of this work was to evaluate the proteome profile of breast cancer cell lines at different tumorigenic stages to better understand the molecular mechanisms underlying the tumorigenic process. Through the comparative analysis of the proteomes of MCF-10A (non-tumor origin), MGSO-3 and MACL-1 (primary tumor origin), and MDA-231-MD (metastatic origin) cell lines, we evaluated the functional state of each cell profile. In total, we identified and quantified 3,008 proteins and 1,709 regulated proteins (P < 0.05 and fold-change = 1.3). The PCA analysis and heat map showed a correlation between tumorigenic profile and proteome profile. Besides, the Venn diagrams demonstrated that similar tumorigenic profiles also shared higher number of proteins. Through gene ontology analysis, several positive and negative regulated biological processes were found across the cell lines. Similar biological processes were grouped into large clusters. In this work, we focused our analyses in terms related to energy metabolism, alterations in the cell cycle, and alterations in the cytoskeleton. Concerning energy metabolism, the tumor cell lines showed downregulation of lipid biosynthesis and the metastatic cell (MDA-231-MD) was the only one showing upregulation of β-oxidation. On the other hand, proteins related with the carbohydrate metabolism were mainly upregulated in the primary cells (MGSO-3 and MACL-1) and downregulated in the metastatic cell, mainly the proteins associated with the aerobic phase. These results are in line with an aerobic metabolism for the primary tumor lines and anaerobic metabolism for the metastatic one. This metabolic dichotomy seems to reflect on mitochondrial activity, as the primary tumor cells had lower mitochondrial density compared with the normal and metastatic cell lines. Furthermore, regulation profile of proteins associated with the mitochondrial BAX-dependent apoptotic pathways suggest that the primary cells are more prone for apoptosis compared with metastatic and normal cells. Regarding the cell cycle, the tumor cell lines have the highest number of upregulated processes. Besides, primary tumor cells seem to have upregulated biological processes related to the 26s proteasome, which is responsible for controlling oxidative processes and signaling pathways, mainly on the MACL-1. Regarding the cytoskeleton, the MDA-231-MD was the only tumor cell line to show upregulated biological processes, mainly related to cell adhesion mechanisms. Moreover, some upregulated proteins associated with cytoskeleton were also related with the glycolytic pathway, demonstrating that the role of cytoskeleton proteins are not only structural and for defense, but also for the survival of the metastatic tumor cell. All the results presented here are important for the better understanding of the molecular grounds of breast cancer tumorigenesis.