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Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A manutenção da proteostase é realizada por um sistema de controle de qualidade de proteínas, composto pelas chaperonas moleculares e pelo proteossoma. Entre essas chaperonas, Hsp90 é essencial para a proliferação celular, participando de processos como o enovelamento de proteínas-cliente e a regulação de proteínas envolvidas em sinalização celular. A atividade da Hsp90 é modulada pelas co-chaperonas, que influenciam no ciclo de ATPase e garantem especificidade. Um conjunto de co-chaperonas da Hsp90 possuem um ou mais domínios TPR (tetratricopeptide repeat), os quais interagem com o motivo MEEVD no C-terminal da Hsp90. Entre as interatoras de Hsp90, neste trabalho foram caracterizadas estrutural e funcionalmente a SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), que participa da translocação de proteínas ancoradas em membranas, e o complexo R2TP (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), o qual está envolvido na montagem e estabilização de complexos que participam de vários processos biológicos essenciais para a célula e interage com a Hsp90 através da subunidade Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – ambos de Aedes aegypti. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas com alto grau de pureza. Foram avaliados a estrutura secundária, estabilidade térmica e os parâmetros hidrodinâmicos das proteínas. Hsp90, SGT e Rvb1/Rvb2 foram também analisadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Finalmente, foram realizados experimentos de caracterização funcional e de interação entre as proteínas. A Hsp90 de Aedes aegypti apresentou atividade ATPásica com eficiência catalítica de 5,51 x 10-4 min-1 µM-1, condizente com suas ortólogas. Além disso, manteve um estado conformacional aberto durante todo o ciclo de ATPase, semelhante à Hsp90 humana e diferindo das Hsp90 de E. coli e levedura. Ainda, mostramos pela primeira vez que Hsp90 tem sua expressão aumentada em células de Aedes albopictus expostas a choque térmico, condizente com uma proteína requerida em situações de estresse. A SGT de Aedes aegypti mostrou ser uma proteína dimérica, não esférica e semelhante à SGT humana, mas diferente das SGTs de Leishmania braziliensis e de levedura. Interessantemente, demonstramos que mesmo na ausência da região C-terminal, a SGT de Aedes aegypti mantém uma estrutura globular, diferentemente do sugerido para a SGT humana. Finalmente, para as proteínas componentes do complexo R2TP, observamos que as Rvbs compõem um heterododecâmero; RPAP3 mostrou-se majoritariamente monomérica, e Pih1D1 mostrou equilíbrio concentração-dependente entre monômero e dímero. Interessantemente, Pih1D1 apresentou-se estável, diferindo de suas ortólogas. Ainda, avançamos na reconstituição do complexo R2TP in vitro. A caracterização dessas proteínas (Hsp90, SGT e complexo R2TP) de Aedes aegypti é importante pois pode contribuir para o entendimento do sistema de controle de qualidade de proteínas neste organismo, vetor de doenças tão importantes no contexto nacional Abstract: Proteostasis is maintained by the protein quality control system, constituted by molecular chaperones and the proteasome. Among these chaperones, Hsp90 is essential for cell growth, having a role in protein folding and regulation of signaling proteins. Hsp90’s activity is modulated by its co-chaperones, which influences its ATPase cycle and gives specificity. A group of Hsp90’s co-chaperone involves TPR-containing proteins, that interact with the MEEVD motif localized in the C-terminus of Hsp90. In this work, Hsp90’s interactors were structurally and functionally characterized: SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), that participates of the translocation of tail-anchored proteins, and R2TP complex (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), which is involved in the assembly and stabilization of complexes associated with several essential processes and interacts with Hsp90 via Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – both from Aedes aegypti. Proteins were expressed in E. coli and purified with high purity and their secondary structure, thermal stability and hydrodynamic parameters were determined. Hsp90, SGT and Rvb1/Rvb2 were also studied by small angle X-ray scattering. Finally, functional and interaction experiments were conducted. Aedes aegypti Hsp90 showed low ATPase activity, which is in good agreement with that of its orthologues. Furthermore, it maintained an open conformational state during the entire ATPase cycle, similar to human Hsp90 but different from E. coli and yeast Hsp90. Moreover, it was observed an increase in Hsp90 expression upon heat-treatment, which is in good agreement with a protein that is required for this type of stress. Aedes aegypti SGT was a dimer with a non-spherical shape and similar to the human SGT, but different from Leishmania braziliensis and yeast SGTs. Surprisingly, even deleted from its C-terminus, SGT maintained its globular structure, which is different from the suggested for human SGT. Finally, Rvbs were shown as a heterododecamer, RPAP3 was mainly a monomer and Pih1D1 was in a concentration-dependent equilibrium among monomer and dimer. Unexpectedly, Pih1D1 was found to be stable, different from its orthologues. Additionally, we showed evidence of the in vitro assemble of the Aedes aegypti R2TP complex. The characterization of these proteins (Hsp90, SGT and R2TP) is important because it may contribute to the comprehension of the protein quality control system in Aedes aegypti, which is a vector of many diseases Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2014/25967-4 CAPES 88887.137523/2017-00

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) ¿ Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: As chaperonas moleculares constituem uma família de proteínas que auxiliam na formação da estrutura nativa de polipeptídeos clientes e são capazes de prevenir o enovelamento incorreto e a agregação, sendo, portanto, essenciais na manutenção da homeostase proteica. As chaperonas da família `small heat shock proteins¿ (sHsps) são expressas em diversos organismos, como bactérias, fungos, vegetais e animais, principalmente em condições de estresse térmico, contribuindo para termotolerância ao proteger proteínas da agregação. Nas plantas, as sHSPs estão presentes em todos os compartimentos celulares, o que demonstra sua importância para a célula. Devido a grande relevância biotecnológica da cana-de-açúcar caracterizamos estrutural e funcionalmente duas sHSPs desta planta: a SsHSP21.5-mt de mitocôndria e a SsHSP22.3-cp de cloroplasto. Os genes dessas proteínas foram expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes foram isoladas e purificadas, em apenas duas etapas cromatográficas, com alto teor de pureza (>95%) e em um único estado oligomérico. A análise de dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência mostraram que ambas foram purificadas enoveladas, com estrutura secundária predominante do tipo folha-?. A caracterização hidrodinâmica determinou a massa molecular, coeficiente de difusão e o raio de Stokes das proteínas em solução, revelando que ambas formam grandes oligômeros globulares em solução. No entanto, a atividade chaperona não foi equivalente entre elas, pois SsHSP22.3-cp foi mais eficiente em proteger todos os substratos modelos testados (malato desidrogenase, citrato sintase, insulina, lisozima e extrato de E. coli) quando comparada com a SsHSP21.5-mt. Estes resultados mostram que as duas sHSP estudadas neste trabalho são estruturalmente semelhantes, mas diferem na atividade chaperona testada, provavelmente devido à baixa similaridade no domínios N-terminal, responsável pela função das sHSP. Estes resultados corroboram a importância da grande diversidade de genes de chaperonas desta família em plantas para manter a homeostase proteica Abstract: Molecular chaperones belong to a family of proteins that are essential to maintain homeostasis since they are able to assist the formation of native structure of polypeptides and also to prevent incorrect folding and aggregation. The chaperones of the family `small heat shock proteins¿ (sHSPs) are expressed in several organisms such as bacteria, fungi, plants and animals, significantly under conditions of thermal stress, contributing to thermotolerance while protecting from aggregation. In plants, sHSPs are present in all cellular compartments, highlighting its importance. Due to the biotechnological relevance of sugarcane, we took to characterize structurally and functionally two os its sHSPs: the SsHSP21.5-mt from mitochondria and the SsHSP22.3-cp from chloroplast. The genes of these proteins were expressed in Escherichia coli and the recombinant proteins were isolated and purified, by two chromatographic steps, with high purity (> 95%) and in a single oligomeric state. Circular dichroism and fluorescence spectroscopy analyses showed that both proteins were folded, presenting predominantly ?-sheet secondary structure. The hydrodynamic characterization determined the molecular weight, the diffusion coefficient and the Stokes radius of the proteins in solution, revealing that both chaperones form similar large oligomers in solution with spherical shapes. However, the chaperone activity was not equivalent, since SsHSP22.3-cp was most effective in protecting all substrate models (malate dehydrogenase, citrate synthase, insulin, lysozyme and extract of E. coli) when compared to SsHSP21. 5-mt. These results showed that the two sHSPs were structurally similar, but had distinct chaperone activity, probably due to the low identity among the N-terminal domains, which are known to be involved with substrate affinity. These results confirm the importance of having great diversity of sHSP chaperones in plants for homeostasis maintenance Doutorado Química Orgânica Doutora em Ciências FAPESP 2011 / 05115-5