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La glicoproteína de membrana M6a se encuentra asociada a enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión, la esquizofrenia y fallas en el aprendizaje. Se ha descripto que contribuye positivamente en la extensión de neuritas, el crecimiento axonal la formación de filopodios/espinas y el mantenimiento de las sinapsis. M6a posee cuatro pasos de transmembrana, dos bucles extracelulares, uno mayor (EC2) y uno menor (EC1) y los extremos citoplasmáticos hacia el interior celular. Dos cisteínas presentes en su EC2, que forman un puente disulfuro, mostraron ser esenciales para el reconocimiento antigénico del anti-M6a-mAb. Este anticuerpo fue descripto como neutralizante porque ha sido capaz de bloquear la extensión de neuritas mediada por M6a. Por otro lado, se ha determinado, por coinmunoprecipitación, que M6a interactúa directa o indirectamente con clatrina. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cuál M6a se internaliza y se recicla aún no ha sido dilucidado. En este trabajo, utilizando ensayos in vitro controlados estudiamos la inmunointernalización de M6a mediada por el anti-M6a-mAb. Observamos que luego de una hora de tratamiento parte de M6a se endocita y disminuyen significativamente el número de sinapsis en neuronas de hipocampo. Cuando los niveles de M6a en la superficie celular se reestablecen, observamos que el número de sinapsis recobra sus valores normales. La internalización de M6a involucra a endosomas tempranos revestidos de clatrina. Probablemente ésta ocurra por la asociación entre la proteína adaptadora 2 y el “motivo basado en tirosina” 251YEDI254 ubicado en el extremo C-terminal de M6a. Luego de su endocitosis, M6a es dirigida hacia endosomas tempranos característicos, Rab5- y EEA1-positivos. Posteriormente es dirigida o bien hacia la membrana a través de endosomas Rab11 positivos o bien hacia la vía degradativa mediada por endosomas Rab7 y LAMP-1 positivos. Nuestros resultados muestran que los niveles de M6a en la superficie celular neuronal modifican la formación y mantenimiento de las sinapsis, sin alterar los niveles de proteicos de las proteínas sinápticas estudiadas (sinaptofisina y el receptor de alta afinidad por glutamato, N-metil-D-aspartato receptor tipo 1). Este mecanismo novedoso podría ser relevante durante el desarrollo neuronal, el podado sináptico y/o podría estar involucrado en diversos desórdenes neurológicos en donde la sinapsis se encuentra comprometida. The neuronal glycoprotein M6a has been associated with psychiatric disorders such as, depression, learning disabilities and schizophrenia. In cultured neurons, M6a positively contributes to neurite extension, axon guidance, filopodia/spine outgrowth, and synapse formation. The endocytic processes of neuronal membrane proteins are linked to the differentiation, growth, signalling and plasticity of neurons. However, the roles of M6a and the precise mechanisms through which M6a internalizes and recycles back to the neuronal membrane are unknown. Here, by using a controlled in vitro assay, we showed whether M6a is endocytosed, the number of synapses in hippocampal neurons decreases. When re-establishing the levels of M6a at the cell surface, the number of synapses returned to its normal values. M6a internalization involves clathrin-coated pits, probably by the association between the adaptor protein 2 and the 251YEDI254 “tyrosinebased” motif located within the C-tail of M6a. Upon endocytosis, M6a is sorted to early endosome antigen 1- and Rab5-positive endosomes and, then sorted back to the cell surface via Rab11-positive endosomes or to degradation via Rab7 and, finally LAMP-1- positive endosomes. Our results demonstrated that the levels of M6a at the cell surface modified the formation/maintenance of synapses, without altering the protein levels of synaptophysin or N-methyl-D-aspartate receptor type-1. This novel mechanism might be relevant during neuronal development, pruning and/or many of the mental disorders in which the number of synapses is affected. Fil: Garcia, Micaela Daiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentina

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Resumen: La sialidasa asociada a membranas Neu3 está involucrada en el catabolismo de glicoconjugados, especialmente de gangliósidos, e interviene en numerosos procesos biológicos tales como diferenciación, proliferación, migración y adhesión celular, regulando principalmente vías de transducción de señales. Dado que el mecanismo de asociación de Neu3 con membranas biológicas no se conoce, uno de los objetivos de este trabajo fue proveer más información sobre ese aspecto. Se encontró que Neu3 localiza principalmente en membrana plasmática, y también en endomembranas de compartimientos endosomales. Utilizando diferentes metodologías se demostró que el extremo C-terminal de la proteína está expuesto hacia el lado citosólico, y que otra porción de Neu3 está expuesta hacia el espacio extracelular, sugiriendo que la sialidasa posee las características de una proteína transmembrana. Sin embargo, análisis in silico y modelado molecular predijeron que la sialidasa no contiene segmentos α-hélices transmembrana en su secuencia, y que comparte la estructura de β-propeller, típica de las sialidasas virales y bacterianas. En la búsqueda de modificaciones post-traduccionales de Neu3, se encontró que la misma está S-acilada, y dado que la S-acilación está restringida al lado citosólico de las membranas, este descubrimiento apoya la idea de que la sialidasa contiene un dominio expuesto al citosol. Aunque aún queda por determinar exactamente cómo esta enzima atraviesa la bicapa lipídica, la primera parte de este estudio provee una nueva visión sobre la topología de Neu3 y se discuten algunas posibles configuraciones. Por otro lado, se estudiaron aspectos funcionales de la enzima no descriptos con anterioridad, como ser su participación en eventos endocíticos. Se observó que células que sobreexpresan Neu3 endocitan menos transferrina (Tf), un típico ejemplo de molécula que ingresa a la célula por endocitosis mediada por clatrina (CME). Dicha disminución en la endocitosis de Tf se observó también en células con reducido nivel de expresión de glicoesfingolípidos, sugiriendo que el efecto observado es independiente de la acción de Neu3 sobre gangliósidos. La disminución en la internalización de Tf, como así también de otras moléculas que ingresan por CME, pudo ser explicada debido a una distribución subcelular alterada del adaptador de clatrina AP-2, el cual se observó formando agregados en células que sobreexpresan Neu3. Por el contrario, clatrina, el fosfoinosítido PIP2 y caveolina mostraron una distribución normal. En conjunto estos resultados sugieren un rol específico de Neu3 en CME. Abstract: Membrane-bound sialidase Neu3 is involved in the catabolism of glycoconjugates, especially gangliosides, and plays crucial roles in numerous biological processes, such as differentiation, proliferation, migration and cell adhesion, regulating transmembrane signaling. Since the mechanism of its association with membranes is still not completely understood, the aim of this work was to provide further information regarding this aspect. Human Neu3 was found to be associated with the plasma membrane and endomembranes from endosomal compartments, and it was not released from the lipid bilayer under conditions that typically release peripheral membrane proteins. By different experimental approaches, it was demonstrated that its C-terminus is exposed to the cytosol while another portion of the protein is exposed to the extracellular space, suggesting that Neu3 possesses the features of a transmembrane protein. However, in silico analysis and homology modeling predicted that the sialidase does not contain any α-helical transmembrane segment and shares the same β-propeller fold typical of viral and bacterial sialidases. Additionally, it was found that Neu3 is S-acylated, and since this post-translational modification is restricted to the cytosolic side of membranes, this finding strongly supports the idea that Neu3 may contain a cytosolic-exposed domain. Although it remains to be determined exactly how this sialidase crosses the lipid bilayer, the first part of this study provides new insights about membrane association and topology of Neu3. On the other hand, some previously unknown functional aspects of the enzyme, such as its involvement in endocytic events, were studied in this work. The ectopic expression of Neu3 led to a drastic decrease in the internalization of transferrin (Tf), the archetypical cargo for clathrin-mediated endocytosis (CME). This reduction was still observed in cells with reduced expression of glycosphingolipids, suggesting that the observed effect is independent of Neu3 activity toward gangliosides. This decrease in the internalization of Tf and also of other molecules entering by CME could be explained by an altered subcellular distribution of the clathrin adaptor AP-2, which was observed to be aggregated in cells overexpressing Neu3. In contrast, clathrin, the phosphoinositide PIP2 and caveolin showed a normal distribution. Together these results suggest a specific and novel role of Neu3 in CME. Fil: Rodríguez Walker, Macarena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina Fil: Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: González-Baró, María del Rosario. Universidad Nacional de La Plata; Argentina. Fil: González-Baró, María del Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentina.

Single point mutations or variations in the expression of the gene encoding theneuronal glycoprotein M6a have been associated with psychiatric disorders such as Alzheimer, depression and schizophrenia. In cultured neurons, M6a positivelycontributes to neurite extension, axon guidance, filopodia/spines outgrowth andsynapses formation. Endocytic processes of the neuronal membrane proteins arelinked to differentiation, growth, signalling and neuronal plasticity. However, the precise mechanism in which M6a internalize and recycle back to the neuronal membrane and its roles are unknown. Here we show, by using controlled in vitro assay, that if 40 % of M6a is endocytosed drastically decreased the number of synapses in hippocampal neurons at 15 days in culture. By re-establishing the levels of M6a at cell surface, up to more than 80 %, the number of synapses returned to its normal values. Furthermore, M6a internalization involves cathrin-coated pits probably by the association between the adaptor protein 2, AP-2, with the 251YEDI254 ?tyrosine based? motif located within M6a C-tail. Upon endocytosis, M6a sorted to EEA1 and Rab5 positive endosomes and afterwards can be sorted back to cell surface via Rab11 positive endosomes or conducted to degradation via Rab7 and finally LAMP-1 positive endosomes. Our results demonstrated that the levels of M6a at the cell surface modified the formation/maintenance of the synapses without altering the protein levels ofsynaptophysin and N-methyl-D-aspartate receptor type-1 (NMDA-R1). This novelmechanism might be relevant during the neuronal development, pruning and/or in many mental disorders in which the number of synapses are affected Fil: García, Micaela Diana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Formoso, Karina. Universidad Catolica Argentina; Argentina Fil: Aparicio, Gabriela Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Frasch, Alberto Carlos C.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina Fil: Scorticati, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina

Fil: Carro, Ana C. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Carro, Ana C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT/PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin, and dynamin, mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV 2 strain NGC and DENV 1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV 2 in the presence of nonneutralizing anti DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV 2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies. Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV 1 cepa Hawaii y DENV 2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, yK562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV 2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor Fc R involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV 2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección conDENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.