1. Contribution to biomonitoring of a non-phthalate plasticizer: analysis of biomarkers of genotoxic effects of DINCH in human cells
- Author
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Vasconcelos, Ana Luísa Teixeira Franco, Dias, Deodália Maria Antunes, Louro, Henriqueta, and Dias, Deodália Maria Antunes,1952
- Subjects
Risk Chararcterization ,Teses de mestrado - 2018 ,Biomarcadores de Genotoxicidade ,Ensaio do Micronúcleo ,Biomarkers of Genotoxic Effects ,Caracterização do Risco ,Micronucleus Assay ,Ciências Naturais::Ciências Biológicas [Domínio/Área Científica] ,Comet Assay ,DINCH ,Genotoxicidade Ambiental ,Ensaio do Cometa - Abstract
Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, entregue à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa em 2018 e discutida e oficialmente concluída em 2019. The human exposure to plasticizers is continuous, since their pervasiveness in a vast range of plastic consumer products (e.g. food packages, healthcare products and textiles). Their ability to migrate and leach to the environment or food was previously demonstrated, therefore, increasing the risk of exposure as well as the risk of potential adverse health outcomes, with a subsequent socioeconomical impact. During the last decades, the adverse health effects of phthalates (e.g. DEHP, DINP), which are the main group of plasticizers used by the industry, has been demonstrated namely the disruption of the male reproductive system development, and the onset of carcinogenesis in humans. So, their application in many consumer products was restricted or even prohibited, which lead to the development of greener alternative plasticizers; within this group, DINCH is the main alternant used to increase the flexibility and durability of polymeric matrices. Concomitantly, the detection of DINCH in human surroundings and in biological matrices has increased during the last decade. This prompt the establishment of biomonitoring guidance values for DINCH metabolites in urine, as a measure of precaution; however, the studies about potential adverse effects of DINCH in humans are still scarce. Given the broad applications and the increasing levels of human exposure, the aim of this study was to analyse the cytotoxicity and genotoxicity of DINCH in human liver (HepG2) and kidney (HK-2) cell lines. Accordingly, the assays used herein were the colorimetric MTT assay, to determine cell viabilities; the modified alkaline comet assay, to detect DNA damage and repair; and the micronucleus assay, to examine chromosomal permanent damages. The results showed that DINCH did not affect cell viabilities, however, was able to induce mild mitogenic effects in human renal cells. After a prolonged exposure, there were mild to moderate cytotoxic and cytostatic effects, in both cell lines. In human hepatic cells, the plasticizer caused transient oxidative DNA damaging effects, but did not cause primary DNA damage, in both cell lines, regardless the exposure periods. Concerning the chromosomal damage, DINCH and its metabolites did not increase the micronucleus levels in both cell lines, with and without metabolic activation. Other biomarkers of genotoxicity were significantly increased after exposure, without a dose-response effect. These results are in line with previous in vivo and in vitro studies, which concluded that DINCH is a non-genotoxic compound, but can induce cytotoxic effects after prolonged exposure. Furthermore, this work is a valuable contribute to the assessment risk of DINCH in humans, because it is the first genotoxic study, to the best of our knowledge, using human cell lines. Nonetheless, more studies are needed to confirm these results, as well as to further investigate the long-term effects of oxidative damage in human health, since the human exposure to DINCH is expected to increase in the future. A exposição humana a substâncias químicas presentes no ambiente ocorre constantemente, pois estas constituem a matéria prima para o fabrico de uma vasta gama de produtos, proporcionando o desenvolvimento tecnológico e a modernização do estilo de vida quotidiano, que é cada vez mais complexo tendo em conta o modo de vida das gerações passadas. A introdução dos plásticos, em larga escala, é coincidente com este movimento que culminou com o desenvolvimento de uma elevada diversidade, disponibilidade e acessibilidade de materiais consumíveis. A nível macromolecular, os materiais de plástico podem ser definidos como misturas complexas de várias substâncias químicas, que incluem por exemplo diversos aditivos (corantes e conservantes), agentes plastificantes (DEHP, DINP, DINCH e bisfenóis), assim como, antibióticos. A aplicação de agentes plastificantes, na maioria ftalatos e bisfenóis, é fundamental durante o processo de manufatura porque permitem otimizar determinadas propriedades físicas dos produtos de plástico como por exemplo, a flexibilidade e a durabilidade, encontrando-se, por conseguinte, numa vasta gama de artigos, incluindo materiais de construção, alimentos embalados, artigos e brinquedos infantis, assim como, em produtos de higiene (cosméticos e perfumes). O aumento da disponibilidade de artigos de plástico, que contêm os respetivos agentes plastificantes, assim como, o potencial risco de migração e contaminação química dos alimentos e do ambiente doméstico, aumentam o risco de exposição e efeitos adversos na saúde humana. O impacto nocivo dos agentes plastificantes, nomeadamente dos ftalatos e bisfenóis, tanto a nível da saúde quanto a nível socioeconómico já foi comprovado, através de vários estudos in vitro, estudos epidemiológicos e de monitorização biológica; de maneira geral, os efeitos adversos observados são mais severos durante as etapas mais vulneráveis do desenvolvimento humano, daí que as grávidas, crianças e idosos constituam subgrupos populacionais mais suscetíveis. Atualmente a aplicação de alguns ftalatos na produção de artigos e brinquedos infantis foi restrita ou até mesmo proibida, devido ao seu elevado risco para a saúde mais especificamente, devido à capacidade de disrupção endócrina e potencial cancerígeno. Devido às restrições implementadas, verificou-se uma necessidade de desenvolvimento de plastificantes alternativos aos ftalatos, com menor risco toxicológico, o que teve como consequência uma mudança no padrão de uso e aplicação de agentes plastificantes a nível industrial. Neste sentido, observou-se um aumento da adoção do plastificante Hexamoll®DINCH® (DINCH), que foi desenvolvido para substituir os ftalatos DEHP e DINP, que foram classificados como disruptores do desenvolvimento reprodutivo e carcinogénicos; em simultâneo este agente apresenta funções semelhantes (flexibilidade, durabilidade), o que permite manter a qualidade do produto final. O plastificante DINCH é aplicado maioritariamente em polímeros de PVC e de poliestireno, que são usados para produzir por exemplo, equipamentos médicos, embalagens de alimentos e artigos e brinquedos infantis. Na última década, observou-se um aumento significativo na deteção do plastificante DINCH em ambientes domésticos (amostras de pó) e em amostras biológicas (urina, unhas), através dos estudos de biomonitorização, realizados a nível europeu, constatando-se que os níveis de exposição da população geral são, ainda, muito baixos. No entanto, como medida de precaução, foram estabelecidos valores limite de exposição, para crianças e adultos, referentes ao somatório dos metabolitos secundários do DINCH na urina, de 3.0 mg/L e 4.5 mg/L, respetivamente. No mesmo sentido, o composto DINCH foi recentemente introduzido numa lista de substâncias prioritárias que devem ser monitorizadas. No entanto, os dados existentes acerca dos potenciais efeitos adversos do DINCH na saúde humana ainda são escassos. Os efeitos deste agente plastificante foram, em contrapartida, extensamente analisados em modelos animais, de acordo com as regras internacionais para testar os efeitos de substâncias químicas, e autorização da sua aplicação em produtos destinados ao consumo humano. Em estudos in vivo, em ratinhos, observou-se a ocorrência de efeitos de toxicidade renal, após uma ingestão crónica de concentrações elevadas de DINCH, nomeadamente efeitos de morte celular, vacuolização do citoplasma e presença de sangue na urina. Por conseguinte, a EFSA estabeleceu uma dose diária tolerável para a população geral de 1 mg/Kg de peso corporal por dia; porém, alguns autores sugeriram um valor de referência oral mais baixo, como forma de prevenção, de 0.7 mg/Kg de peso corporal por dia. Foi ainda demonstrado, em ratinhos cronicamente expostos, a ausência de efeitos de toxicidade reprodutiva, de toxicidade genética e carcinogénicos. No entanto, verificou-se um aumento da proliferação celular e peso de alguns órgãos animais como por exemplo, do fígado, rins e tiroide após ingestão de doses elevadas de DINCH. Relativamente aos poucos estudos in vitro, observou-se após uma exposição prolongada ao DINCH, de pelo menos 48h até 7 dias, uma redução significativa da viabilidade e proliferação celular em células de ratinho. Da mesma forma, foi demonstrado que o seu metabolito primário (MINCH) causou uma redução da viabilidade celular, e na expressão de determinados recetores nucleares, sugerindo que o composto parental (DINCH), após ativação metabólica, potencialmente origina subprodutos eletrofílicos. Assim sendo, com o aumento da aplicação do DINCH em diversos artigos, com os quais lidamos diariamente, tem havido também um aumento da sua deteção e dos níveis de exposição da população, porém, desconhecem-se os efeitos que provocam na saúde humana. Como tal, o presente estudo teve como objetivo analisar a citotoxicidade e genotoxicidade do DINCH, em linhas celulares humanas. Escolhe-se uma linha celular de hepatócitos (HepG2), representativa do fígado, e uma linha celular do epitélio renal (HK-2), representativa dos rins, pois estes órgãos humanos são responsáveis pelos processos de biotransformação e excreção dos compostos químicos exógenos no organismo, estando por isso, continuamente expostos a potenciais substâncias carcinogénicas. Outro motivo desta escolha deveu-se à elevada suscetibilidade a efeitos tóxicos nestes órgãos, apresentados em estudos in vivo em ratinhos, de exposição crónica ao DINCH. Seguindo as recomendações internacionais para avaliar a genotoxicidade de potenciais compostos carcinogénicos, utilizou-se uma gama de concentrações finais de DINCH situadas entre 1 e 500 μg/mL; desta forma, analisou-se dois efeitos genotóxicos: o dano no DNA e os danos cromossómicos. O dano no DNA foi avaliado com recurso ao ensaio do cometa em meio alcalino e cometa em meio alcalino modificado com a enzima FPG (formamidopirimidina DNA N-glicosilase), após 3h e 24h de exposição permitindo, deste modo, a deteção de dano e reparação do DNA. Os danos cromossómicos foram avaliados com recurso ao ensaio do micronúcleo, após 6h de exposição com e sem ativação metabólica e após 48h de exposição sem ativação metabólica. Os efeitos citotóxicos, por sua vez, foram determinados através da análise da viabilidade celular, com o ensaio colorimétrico do MTT, após 24h de exposição. Relativamente à genotoxicidade com o ensaio do cometa, nas células hepáticas, observou-se que após 3h de exposição o DINCH não induziu dano primário no DNA, porém quando a enzima FPG foi adicionada, houve um aumento significativo da % de DNA na cauda em todos os tratamentos; que correspondem ao aumento de lesões alquilantes no DNA, que por sua vez, reflete a conversão de purinas oxidadas em quebras de cadeia no DNA. Com o aumento do tempo de exposição para 24h, observou-se que o DINCH também não induziu dano primário no DNA e de maneira geral, houve uma diminuição das lesões alquilantes em todos os tratamentos, com exceção da concentração 100 μg/mL de DINCH. Nas células renais, o DINCH não causou a indução de dano primário ou lesões alquilantes no DNA, independentemente do tempo de exposição. Portanto, com este ensaio verificou-se uma indução transiente de dano oxidativo nas células hepáticas, que pode ser explicado pela formação endógena de espécies reativas de oxigénio, durante o processo de biotransformação. Esta hipótese parece estar de acordo com os resultados dos estudos in vivo, em que o DINCH ativou as enzimas da fase I e II, e constituiu substrato enzimático. Relativamente à genotoxicidade com o ensaio do micronúcleo, observou-se que o composto parental e os seus metabolitos (primários e secundários) não aumentaram a frequência de micronúcleos induzidos, em ambas as linhas celulares e independentemente do tempo de exposição, logo, não causaram dano cromossómico estável em células binucleadas. Adicionalmente, verificou-se uma indução significativa de outros biomarcadores de dano cromossómico (NBUDs e NPB), todavia não houve um efeito de dose-resposta. Relativamente à citotoxicidade, o DINCH não reduziu a viabilidade celular em ambas as linhas celulares humanas, no entanto induziu efeitos mitogénicos em elevadas concentrações, nas células renais. Após uma exposição prolongada sem ativação metabólica, o DINCH causou efeitos citotóxicos e citostáticos, ligeiros a moderados, em ambas as linhas celulares, o que vai de encontro com os resultados existentes dos poucos estudos in vitro em linhas celulares animais, bem como, dos estudos in vivo em ratinhos. Em conclusão, este trabalho constitui um contributo valioso para a avaliação do risco toxicológico do composto DINCH no homem, pois até à não existem estudos de citotoxicidade e genotoxicidade em linhas celulares humanas. Todavia, é fundamental que no futuro se realizem mais estudos sobre os efeitos do DINCH, não só para confirmar estas conclusões, mas também para compreender-se os possíveis efeitos do dano oxidativo a longo prazo na saúde humana, pois, é esperado que a exposição humana aumente drasticamente nos próximos anos. Tudo isto, de forma a minimizar possíveis efeitos prejudiciais na saúde, principalmente nos subgrupos populacionais mais vulneráveis, como é o caso das crianças e dos trabalhadores da produção deste agente plastificante. N/A
- Published
- 2019