Search

Els trastorns basats en l'estrès i la por són condicions habituals que afecten a les dones de manera desproporcionada, però s'han descrit pocs mecanismes biològics. Hi ha alteracions en el processament de la por, especialment alteracions en l'extinció de la por (FE), en aquests trastorns. La senyalització defectuosa a través del pèptid activador de l'adenilat ciclasa de la hipòfisi (PACAP) i el seu receptor (PAC1R), s'associa amb el trastorn d'estrès posttraumàtic (TEPT) exclusivament en dones. A més, les hormones sexuals i sexuals poden influir en la FE, però encara es desconeix si aquestes variacions hormonals estan associades amb una vulnerabilitat per al processament del trauma. Els objectius d'aquesta tesi eren, primer, provar si PACAP-PAC1R està implicat en l'FE patològic en dones i dones i, segon, aclarir la influència dels estats hormonals canviants sobre el processament de la memòria de l'estrès i la por. Per abordar-ho, vam realitzar estudis translacionals en dues cohorts de dones traumatitzades i rosegadores femenines exposades a l'estrès d'immobilització (IMO). Es va utilitzar un paradigma de condicionament de la por-FE que quantificava la resposta de sobresalt o congelació potenciada per la por. Amb els nostres resultats, vam confirmar que el sistema PACAP-PAC1R està implicat en FE patològic en dones i rosegadors femenins. A més, vam identificar un circuit que connectava l'amígdala medial (MeA) amb la part dorsomedial de l'hipotàlem ventromedial (VMHdm) que regulava PACAP-PAC1R després de l'IMO i va provocar l'aparició d'alteracions de FE. Pel que fa a les hormones, aquest treball mostra que els estats hormonals canviants tenen contribucions nul·les al processament del trauma, però són capaços de modular els records de FE alterant la funció de l'hipotàlem, l'escorça prefrontal i l'hipocamp. Estudis posteriors poden aprofundir en les conseqüències de la disfunció del circuit MeA al VMHdm i estendre les troballes a altres dominis del comportament, possiblement proporcionant objectius moleculars per a la modulació dels records d'estrès i por a les dones. Los trastornos basados en el estrés y el miedo son condiciones comunes que afectan a las mujeres de manera desproporcionada, pero se han descrito pocos mecanismos biológicos. Existen alteraciones en el procesamiento del miedo, especialmente deficiencias en la extinción del miedo (FE), en estos trastornos. La señalización defectuosa a través del péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP) y su receptor (PAC1R) se asocia exclusivamente con el trastorno de estrés postraumático (TEPT) en mujeres. Además, el sexo y las hormonas sexuales pueden influir en la FE, pero aún se desconoce si estas variaciones hormonales están asociadas con una vulnerabilidad para el procesamiento del trauma. Los objetivos de esta tesis fueron, en primer lugar, probar si PACAP-PAC1R está implicado en la FE patológica en mujeres y en segundo lugar, aclarar la influencia de los estados hormonales cambiantes sobre el estrés y el procesamiento de la memoria del miedo. Para abordar esto, realizamos estudios traslacionales en dos cohortes de mujeres traumatizadas y roedores expuestos a estrés por inmovilización (IMO). Se utilizó un paradigma FE de condicionamiento del miedo que cuantificó la respuesta de sobresalto o congelación potenciada por el miedo. Con nuestros resultados, confirmamos que el sistema PACAP-PAC1R está implicado en la FE patológica en mujeres y roedores hembra. Además, identificamos un circuito que conecta la amígdala medial (MeA) con la parte dorsomedial del hipotálamo ventromedial (VMHdm) que regula al alza PACAP-PAC1R después de IMO y desencadena la aparición de alteraciones de FE. Con respecto a las hormonas, este trabajo muestra que los estados hormonales cambiantes tienen una contribución nula al procesamiento del trauma, pero son capaces de modular los recuerdos de FE al alterar la función del hipotálamo, la corteza prefrontal y el hipocampo. Otros estudios pueden profundizar en las consecuencias de la disfunción del circuito MeA a VMHdm y extender los hallazgos a otros dominios del comportamiento, posiblemente proporcionando objetivos moleculares para la modulación del estrés y los recuerdos del miedo en las mujeres. Stress and fear-based disorders are common conditions that affect women disproportionately, but few biological mechanisms have been described. There are fear processing alterations, specially impairments in fear extinction (FE), in these disorders. Faulty signaling through the pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP), and its receptor (PAC1R), is associated with posttraumatic stress disorder (PTSD) in women exclusively. Moreover, sex and sex hormones can influence FE, but it is unknown yet whether these hormonal variations are associated with a vulnerability for trauma processing. The aims of this thesis were first, to test whether PACAP-PAC1R is implicated in pathological FE in females and women and second, to clarify the influence of the shifting hormonal states over stress and fear memory processing. To approach this, we performed translational studies in two cohorts of traumatized women and female rodents exposed to immobilization stress (IMO). A fear conditioning-FE paradigm that quantified either fear-potentiated startle or freezing response was used. With our results, we confirmed that the PACAP-PAC1R system is implicated in pathological FE in women and female rodents. Further, we identified a circuit connecting the medial amygdala (MeA) to the ventromedial hypothalamus dorsomedial part (VMHdm) that upregulated PACAP-PAC1R after IMO and triggered the appearance of FE alterations. Regarding hormones, this work shows that shifting hormonal states have null contributions to trauma processing, but they are able to modulate FE memories by altering the function of the hypothalamus, prefrontal cortex, and hippocampus. Further studies may delve deeper into the consequences of the dysfunction of MeA to VMHdm circuit and extend the findings to other behavioral domains, possibly providing molecular targets for the modulation of stress and fear memories in females.

La present tesi explora l’heterogeneïtat cognitiva dels pacients depressius en diferents etapes de la malaltia i mostra la presència de diferents perfils cognitius, tant en un primer episodi depressiu com en la fase activa de la depressió. El fet d’observar diferents perfils cognitius ja des de l’inici i en les diferents etapes de la malaltia, obre una gran ventall de possibilitats quant a possibles trajectòries dels símptomes cognitius, i conseqüentment, possibles cursos de la malaltia. Considerar el rendiment cognitiu dels pacients depressius en els entorns clínics de forma rutinària podria ajudar a detectar aquells pacients amb majors dificultats cognitives i funcionals, i portar a terme estratègies d’intervenció més adequades per tal d’aconseguir un curs menys tòrpid de la malaltia. La remediació cognitiva (RC) és un estratègia d’intervenció procognitiva que ha mostrat resultats positius en la millora de la cognició, i en cert punt del funcionament, però fins el moment les diferències metodològiques entre estudis han fet difícil la seva transferència a la pràctica clínica. Mitjançant aquesta tesi, s’ha desenvolupat i aplicat una intervenció cognitiva integral anomenada INCREM, la qual unifica dos enfocs de RC (restauració i compensasió) que donen lloc a no només una millora en el rendiment cognitiu, sinó sobretot, una millora del funcionament psicosocial dels pacients depressius a llarg termini. El fet d’entendre la disfunció cognitiva i aprendre eines que poden ajudar a millorar la cognició en el nostre dia a dia, conjuntament amb un entrenament cognitiu continuat, permet millorar la qualitat de vida i mantenir una salut mental positiva en els pacients depressius. La presente tesis explora la heterogeneidad cognitiva de los pacientes depresivos en diferentes etapas de la enfermedad y muestra la presencia de diferentes perfiles cognitivos, tanto en un primer episodio depresivo como en la fase activa de la depresión. El hecho de observar diferentes perfiles cognitivos ya desde el inicio y en las diferentes etapas de la enfermedad, abre una gran abanico de posibilidades en cuanto a posibles trayectorias de los síntomas cognitivos, y consecuentemente, posibles cursos de la enfermedad. Considerar el rendimiento cognitivo de los pacientes depresivos en los entornos clínicos de forma rutinaria podría ayudar a detectar aquellos pacientes con mayores dificultades cognitivas y funcionales, y llevar a cabo estrategias de intervención más adecuadas para conseguir un curso menos tórpido de la enfermedad. La remediación cognitiva (RC) es un estrategia de intervención procognitiva que ha mostrado resultados positivos en la mejora de la cognición, y en cierto punto del funcionamiento, pero hasta el momento las diferencias metodológicas entre estudios han hecho difícil su transferencia a la práctica clínica. Mediante esta tesis, se ha desarrollado y aplicado una intervención cognitiva integral llamada INCREM, que unifica dos enfoques de RC (restauración y compensación) que dan lugar a no sólo una mejora en el rendimiento cognitivo, sino sobre todo, una mejora del funcionamiento psicosocial los pacientes depresivos a largo plazo. El hecho de entender la disfunción cognitiva y aprender herramientas que pueden ayudar a mejorar la cognición en nuestro día a día, conjuntamente con un entrenamiento cognitivo continuado, permite mejorar la calidad de vida y mantener una salud mental positiva en los pacientes depresivos. The present thesis explores the cognitive heterogeneity of depressive patients at different stages of the illness and shows the presence of different cognitive profiles, both in a first depressive episode and in the active phase of depression. The fact that different cognitive profiles are observed already at the onset and at different stages of the illness opens up a wide range of possibilities regarding possible trajectories of cognitive symptoms and, consequently, possible courses of the illness. Considering the cognitive performance of depressive patients in clinical settings on a routine basis could help to detect those patients with greater cognitive and functional difficulties, and to implement more appropriate intervention strategies to achieve a less torpid course of the illness. Cognitive remediation (CR) is a procognitive intervention strategy that has shown positive results in terms of improving cognition, and to some extent functioning, but to date methodological differences among studies have made difficult the transfer to clinical practice. Through this thesis, a comprehensive cognitive intervention called INCREM has been developed and applied, which combines two CR approaches (restoration and compensation) that result not only in improved cognitive performance, but above all, in improved psychosocial functioning in long-term depressive patients. Understanding cognitive dysfunction and learning tools that can help improve cognition in our daily lives, in conjunction with ongoing cognitive training, can improve quality of life and maintain positive mental health in depressive patients. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

La pèrdua funcional produïda després d’una lesió medul·lar disminueix en major o menor grau l’autonomia dels pacients per desenvolupar tasques de la vida diària. La recerca i desenvolupament de teràpies restauradores de la funció nerviosa estan dirigides a la reconectivitat i reparació de la funció cortico- medul·lar que permetin al pacient recuperar el control de la mobilitat i de la sensibilitat. En els últims anys s’han presentat avenços en noves estratègies neuromoduladores que han permès en gran mesura la recuperació de la funció locomotora en pacients paraplègics. No obstant això, la implementació i eficàcia d’aquestes tecnologies en les extremitats superiors encara no està garantida i està començant a ser estudiada. La present tesi està organitzada en dos blocs; En primer lloc, es presenten els resultats de dos estudis en què s’ha avaluat els efectes funcionals i neurofisiològics després de l’estimulació transcutània de la medul·la espinal cervical en subjectes sans. Els resultats constaten la neuromodulació de la circuiteria cortico-medul·lar després de l’aplicació de l’estimulació, i la necessitat de definir els paràmetres d’estimulació i de la concomitant activitat física de les extremitats superiors per optimitzar els efectes neuromoduladors. En segon lloc, s’ha realitzat un estudi neurofisiològic en rosegadors sans per avaluar el reclutament dels músculs de les extremitats davanteres durant la realització d’abast i agafada d’objectes. Per això s’han desenvolupat eines per a l’anàlisi i processament de l’activitat elèctrica muscular. Els resultats evidencien una seqüenciació temporal i un alt grau de correlació de l’activitat muscular entre animals, el que suggereix la presència de circuits medul·lars responsables del control d’aquests moviments. La seva caracterització augmenta el coneixement de la fisiologia d’aquests circuits per desenvolupar en el futur protocols neuromoduladors que permetin la restitució funcional dels braços i mans en persones amb lesió de la medul·la espinal cervical. La pérdida funcional producida tras una lesión medular disminuye en mayor o menor grado la autonomía de los pacientes para desarrollar tareas de la vida diaria. La búsqueda y desarrollo de terapias restauradoras de la función nerviosa están dirigidas a la reconectividad y reparación de la función cortico-medular que permitan al paciente recuperar el control de la movilidad y de la sensibilidad. En los últimos años se han presentado avances en nuevas estrategias neuromoduladoras que han permitido en gran medida la recuperación de la función locomotora en pacientes parapléjicos. No obstante, la implementación y eficacia de estas tecnologías en las extremidades superiores aún no está garantizada y está comenzando a ser estudiada. La presente tesis está organizada en dos bloques. En primer lugar, se presentan los resultados de dos estudios en los que se ha evaluado los efectos funcionales y neurofisiológicos tras la estimulación transcutánea de la médula espinal cervical en sujetos sanos. Los resultados constatan la neuromodulación de la circuitería cortico-medular tras la aplicación de la estimulación, y la necesidad de definir los parámetros de estimulación y de la concomitante actividad física de las extremidades superiores para optimizar los efectos neuromoduladores. En segundo lugar, se ha realizado un estudio neurofisiológico en roedores sanos para evaluar el reclutamiento de los músculos de las extremidades delanteras durante la realización de alcance y agarre de objetos. Para ello se han desarrollado herramientas para el análisis y procesado de la actividad eléctrica muscular. Los resultados evidencian una secuenciación temporal y un alto grado de correlación de la actividad muscular entre animales, lo que sugiere la presencia de circuitos medulares responsables del control de estos movimientos. Su caracterización aumenta el conocimiento de la fisiología de estos circuitos para desarrollar en el futuro protocolos neuromoduladores que permitan la restitución funcional de los brazos y manos en personas con lesión de la médula espinal cervical. The functional loss produced after a spinal cord injury decreases to a greater or lesser degree the autonomy of patients to carry out tasks of daily living. The search and development of restorative therapies for nerve function are aimed at the reconnectivity and repair of the cortico-medullary function that allow the patient to regain control of mobility and sensitivity. In recent years, advances have been made in new neuromodulatory strategies that have largely allowed the recovery of locomotor function in paraplegic patients. However, the implementation and efficacy of these technologies in the upper extremities is not yet guaranteed and is beginning to be studied. This thesis is organized in two blocks; First, the results of two studies are presented in which the functional and neurophysiological effects have been evaluated after transcutaneous stimulation of the cervical spinal cord in healthy subjects. The results confirm the neuromodulation of the cortico-medullary circuitry after the application of stimulation, and the need to define the stimulation parameters and the concomitant physical activity of the upper extremities to optimize the neuromodulatory effects. Second, a neurophysiological study has been carried out in healthy rodents to assess the recruitment of the muscles of the forelimbs during reaching and grasping objects. For this, it has been developed for the analysis and processing of muscular electrical activity. The results show a temporal sequencing and a high degree of correlation of muscle activity between animals, which suggests the presence of spinal circuits responsible for the control of these movements. Their characterization increases the knowledge of the physiology of these circuits in order to develop neuromodulatory protocols in the future that allow the functional restoration of the arms and hands in people with cervical spinal cord injury . Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

[eng] Current therapy against colorectal cancer (CRC) is based on DNA-damaging agents that eradicate highly proliferative malignant cells. Whether sublethal chemotherapy affects tumour cell behaviour and impacts on patient outcome is primarily unstudied. We now show that sublethal chemotherapy imposes a non-senescent quiescent-like phenotype (TQL phenotype) to TP53 wildtype human CRC patient derived organoids (PDOs) and cell lines. CRC cells displaying this phenotype exhibit tumour-initiating activity comparable to untreated cells but superior metastatic capacity. Thus, re-entry of TQL cells into the cell cycle could be partially responsible of CRC patients’ relapse and metastasis. The TQL phenotype is linked to the acquisition of foetal traits downstream of YAP1, similar to that observed in intestinal regeneration after damage. Importantly, we have uncovered from TQL cells a foetal intestinal stem cell signature (feISC signature) that is also found in untreated human CRC tumours. Notably, nuclear YAP1 accumulation or detection of this signature predict poor prognosis in untreated CRC patients carrying TP53 wildtype tumours. Collectively, our results uncover a potential deleterious effect of chemotherapy and show that detection of nuclear YAP1 or foetal ISC signatures in tumours could be implemented in the clinical practice to inform about patient candidates for closer follow-up or specific pathway-based therapies, such as inhibition of YAP1., [cat] La teràpia actual contra el càncer colorectal (CRC) està basada en l’ús d’agents que danyen el DNA, els quals eradiquen específicament les cèl·lules malignes molt proliferants. Actualment es disposa de molt poca informació sobre si el tractament amb quimioteràpia subletal afecta el comportament de les cèl·lules tumorals i si té un impacte en l’evolució del pacient. En el present estudi mostrem que la quimioteràpia subletal imposa un fenotip quiescent no senescent (fenotip TQL) en organoids derivats de pacients (PDOs) amb CRC i en línies cel·lulars amb p53 funcional. Les cèl·lules de CRC que mostren aquest fenotip presenten una capacitat d’iniciació de nous tumors comparable a la de les cèl·lules no tractades i una capacitat metastàtica superior. Per tant, la reentrada de les cèl·lules TQL al cicle cel·lular podria parcialment ser responsable de la recaiguda i la metàstasi dels pacients amb CRC. El fenotip TQL està associat amb l’adquisició de trets fetals depenent de YAP1, similar a l’observat en la regeneració de l’intestí danyat. És important destacar que hem descrit a partir de les cèl·lules TQL una signatura de cèl·lules mare intestinals fetals (signatura feISC) que també es troba en tumors CRC humans no tractats. A més, l’acumulació de YAP1 al nucli o la detecció d’aquesta signatura prediu mal pronòstic en tumors amb p53 funcional de pacients amb CRC no tractats. Col·lectivament, els nostres resultats revelen un nou potencial efecte perjudicial de la quimioteràpia i mostren que la detecció de YAP1 nuclear o de signatures feISC en tumors es podria implementar a la pràctica clínica per informar sobre els pacients candidats a un seguiment més proper o a teràpies dirigides específiques, com la inhibició de YAP1., [spa] La terapia actual contra el cáncer colorectal (CRC) está basada en el uso de agentes que dañan el DNA, los cuales erradican específicamente las células malignas muy proliferantes. Actualmente se dispone de muy poca información sobre si el tratamiento con quimioterapia subletal afecta el comportamiento de las células tumorales y si tiene un impacto en la evolución del paciente. En el presente estudio mostramos que la quimioterapia subletal impone un fenotipo quiescente no senescente (fenotipo TQL) en organoides derivados de pacientes (PDOs) con CRC y en líneas celulares con p53 funcional. Las células de CRC que muestran este fenotipo presentan una capacidad de iniciación de nuevos tumores comparable a la de las células no tratadas y una capacidad metastática superior. Por lo tanto, la reentrada de las células TQL al ciclo celular podría parcialmente ser responsable de la recaída y la metástasis de los pacientes con CRC. El fenotipo TQL está asociado con la adquisición de rasgos fetales dependiente de YAP1, similar a lo observado en la regeneración del intestino dañado. Es importante destacar que hemos descrito a partir de las células TQL una signatura de células madre intestinales fetales (signatura feISC) que también se encuentra en tumores CRC humanos no tratados. Además, la acumulación de YAP1 al núcleo o la detección de esta signatura predice mal pronóstico en tumores con p53 funcional de pacientes con CRC no tratados. Colectivamente, nuestros resultados revelan un nuevo potencial efecto perjudicial de la quimioterapia y muestran que la detección de YAP1 nuclear o de signaturas feISC en tumores se podría implementar en la práctica clínica para informar sobre los pacientes candidatos a un seguimiento más cercano o a terapias dirigidas específicas, como la inhibición de YAP1.

[cat] Les proteïnes de la família de les CaM quinases (CAMK en anglès), l’activitat de les quals és dependent del complex calci-calmodulina, estan implicada en funcions cel·lulars com la regulació de l’expressió gènica, la contracció, l’apoptosi i en la neurotransmissió. A S. pombe, s’ha descrit una proteïna homòloga a CaMKI de mamífers, Cmk1, que és fosforilada per una quinasa upstream, Ckk2, que és homòloga a la CaMKK de mamífers. Es va observar que l’expressió de Ckk2 en condicions de deprivació nutricional com absència de nitrogen o glucosa s’incrementava. El tractament amb drogues com latrunculina B, que causa alteracions dels microfilaments d’actina, compromet la viabilitat de la soca sense ckk2 (Δckk2). Es van identificar possibles substrats en un assaig de fosfo-proteòmica com Cgs1, subunitat reguladora del complex PKA a S. pombe; Int6, homòloga a la subunitat E del complex eIF3, implicat en la traducció; i Gad8, substrat del TORC2 (TOR complex 2). En aquest treball, s’ha identificat que la funció de Ckk2 és diferent segons el tipus d’estrès, en la deprivació de nitrogen no és important per mantenir la viabilitat però si participa en la re-entrada al cicle cel·lular des de la fase G0. En el cas de la deprivació nutricional de glucosa, la soca Δckk2 mostra una reducció de viabilitat en créixer en condicions de deprivació de glucosa, indicant que podria estar participant en la supervivència en aquestes condicions o que podria ser important per activar mecanismes de restricció calòrica. S’ha observat també que l’increment de l’expressió causat per la deprivació nutricional, retorna a nivells basals en reintroduir els nutrients en el medi, indicant que estava restringit a les condicions de deprivació. L’increment de l’expressió en condicions de deprivació es devia a que en aquestes condicions TORC1 es troba deprivat, i s’ha observat que la inhibició de TORC1 amb rapamicina causa un increment en els nivells de Ckk2. L’augment de l’expressió de Ckk2 en deprivació de nitrogen, es produeix gràcies a la acció de Gaf1, un factor de transcripció que es torna actiu en aquestes mateixes condicions, ja que en absència de Gaf1, l’expressió de Ckk2 no s’indueix amb la mateixa intensitat. No es va detectar la fosforilació dels substrats Cgs1, Int6 i Gad8, però si que es van identificar fosforilacions en proteïnes que co-precipiten amb elles. En analitzar les interaccions genètiques entre Ckk2 i aquests possibles substrats, s’ha observat que el doble mutant Δckk2 Δpka1 presenta un fenotip de letalitat sintètica en condicions de deprivació de glucosa, el que ens indica que la funció de les dos proteïnes és necessària per sobreviure en aquestes condicions i potser convergeixen en una tercera que encara desconeixem. També s’ha observat que l’activitat proteosòmica de Int6 podria estar controlant els nivells de Ckk2 en condicions normals. L’anàlisi de la viabilitat en resposta a latrunculina va demostrar que la funció de Ckk2 no està relacionada amb la de Cmk1, i que podria presentar altres substrats. La composició d’actina en cèl·lules Δckk2 es veu alterada en deprivació de nitrogen, formant nòduls corticals més petits i dispersos. La formació d’aquests nòduls es veu alterada en mutants endocítics i la latrunculina B és capaç d’inhibir l’endocitosi. L’addició de sorbitol, que facilita l’endocitosi, és capaç de revertir la sensibilitat de la soca Δckk2 a la latrunculina B, indicant que Ckk2 podria estar participant en l’endocitosi., [eng] TCaMK are proteins whose activity depends on the calcium-calmodulin complex, who are implicated in different cellular functions like contraction, apoptosis, neurotransmission and gene expression. In S. pombe, it has been described a homologue of the mammal CaMKI, Cmk1, which is phosphorylated by an upstream kinase Ckk2 (which is a homologue for CaMKK). It has been observed that under nutrient deprivation caused by depletion of nitrogen or glucose, Ckk2 expression is increased. Treatment with cytoskeleton altering drugs like latrunculin B (LatB) compromises viability of strains without Ckk2 (Δckk2). Possible substrates of Ckk2 have been identified in a phosphoproteomic assay, like Cgs1, Int6 and Gad8. In this thesis, it has been determined that Ckk2 function depends on the stress; for example, Ckk2 is not important to maintain viability in G0 phase, but it is important in the re-entry of cell cycle from G0. Ckk2 could be participating in the response to glucose starvation, as Δckk2 strains show sensitivity in low glucose concentration. Changes in the expression of Ckk2 are restricted to starvation conditions, as the protein level rapidly decreases when nutrients are re-introduced in the media. Ckk2 increase under nutrient starvation is caused by TORC1 inhibition, and is also observed when treating cells with rapamycin, a TORC1 inhibitor. It has been identified that Ckk2 expression is caused by Gaf1, a transcription factor that is active during the first hours of nitrogen deprivation. No phosphorylations were caused by Ckk2 in vitro in Cgs1, Int6 or Gad8, but some were observed in co-precipitated proteins. Ckk2 and Pka1 could be participating together in the response to glucose starvation, as the double deletion show a phenotype of synthetic lethality under these conditions. Steady state levels of Ckk2 might be controlled by proteosomic activity of Int6. Genetic interaction analysis of deletions of CAMK pathway in the response to LatB revealed that targets other than Cmk1 might be involved in the response. Lack of Ckk2 causes alterations in the formation of actin cortical patches under nitrogen starvation and sorbitol treatment is able to rescue Δckk2 mutants from sensitivity to LatB, indicating a possible role for Ckk2 in endocytosis.

Les atàxies espinocerebel·loses (SCAs) consisteixen en un grup heterogeni de trastorns del moviment hereditaris caracteritzats clínicament per atàxia progressiva associada de forma variable amb altres signes neurològics addicionals com són signes piramidals o extrapiramidals, oftalmoplegia, retinosi pigmentària, demència o convulsions. Aquesta heterogeneïtat clínica s’explica per l’heterogeneïtat genètica, amb més de 53 loci i 40 gens identificats i associats fins a dia d’avui. En aquesta tesi s’ha estudiat una cohort de 308 pacients amb atàxia, identificant variants genètiques causatives en 82 casos índex (26,6%), 45 d’elles no descrites prèviament. Durant el curs d’aquesta tesi, el nostre grup va identificar un nou subtipus d’atàxia, la SCA37, i va localitzar el seu defecte genètic en el cromosoma 1p32. En el present estudi s’ha identificat la mutació intrònica repetitiva i inestable ATTTC dins de la regió reguladora 5 ‘no codificant de el gen Disabled 1 (DAB1) com el defecte genètic causant de la SCA37. A més, es descriu la correlació clínica i genètica i les primeres troballes neuropatològiques en SCA37 que indiquen que la malaltia està causada per la desregulació de l’expressió del DAB1 en el cerebel amb pèrdua severa de cèl·lules de Purkinje en l’escorça cerebel·losa i la presència de grànuls perisomàtics ubiquitinats i immunotenyits per DAB1. És important destacar que la repetició ATTTC desregula l’expressió de l’ARN de DAB1 resultant en la sobreexpressió de la ruta de senyalització de la reelina-DAB1 i PI3K/AKT en el cerebel SCA37. Finalment, però no menys important, s’han realitzat estudis de lligament de el genoma complet i seqüenciació de l’exoma en una família de Menorca amb set individus afectes que presentaven atàxia, nistagme, disàrtria, polineuropatia i signes piramidals de forma variable amb una herència autosòmica dominant. L’edat d’inici de la malaltia oscil·la entre els 15 i 50 anys. Les ressonàncies magnètiques van revelar atròfia cerebel·losa amb desmielinització cerebral, i els estudis neurofisiològics van mostrar polineuropatia sensitiva axonal moderada amb resposta cutània simpàtica anormal predominantment en les extremitats inferiors. Es va identificar la variant c.1877C> T (p.Ser626Leu) en el gen SAMD9L com el defecte genètic causant de la malaltia. L’estudi també demostrà la localització mitocondrial de la proteïna SAMD9L humana, amb nivells disminuïts en els fibroblasts dels pacients i deficiències mitocondrials i lisosomals en aquest nou subtipus d’atàxia. A més, la sobreexpressió de l’ARNm de SAMD9L mutat humà demostrà deteriorament de la mobilitat i afectació vestibular/sensorial en els embrions del peix zebra. En conclusió, aquest estudi ha identificat els dèficits genètics en el 26,6% dels nostres casos d’atàxia, es demostra la mutació intrònica repetitiva i inestable ATTTC dins el gen DAB1 com la causa genètica subjacent proporcionant evidència de desregulació de la senyalització de reelina- DAB1 en l’atàxia espinocerebel·losa tipus 37, i identifica un nou subtipus d’atàxia espinocerebel·losa causada per la mutació a SAMD9L, que desencadena una desregulació mitocondrial i lisosomal, apuntant al paper de la proteïna SAMD9L en les funcions neurològiques motores i sensorials. Com a resultat d’aquesta tesi, s’aporten nous coneixements sobre els mecanismes clínics, genètics i fisiopatològics subjacents a la neurodegeneració en les atàxies espinocerebel·loses, identificant noves dianes terapèutiques candidates per al tractament. Las ataxias espinocerebelosas (SCAs) consisten en un grupo heterogéneo de trastornos del movimiento hereditarios caracterizados clínicamente por ataxia progresiva asociada de forma variable con otros signos neurológicos adicionales como signos piramidales o extrapiramidales, oftalmoplejía, retinosis pigmentaria, demencia o convulsiones. La heterogeneidad clínica se explica por la heterogeneidad genética, con más de 53 loci y 40 genes identificados asociados hasta la fecha. En esta tesis se ha estudiado una cohorte de 308 pacientes con ataxia, identificando variantes genéticas causativas en 82 casos índice (26,6%), 45 de ellas no descritas previamente. Durante el curso de esta tesis, nuestro grupo identificó un nuevo subtipo de ataxia, SCA37, y localizó su defecto genético en el cromosoma 1p32. En el presente estudio se ha identificado la mutación intrónica repetitiva e inestable ATTTC dentro de la región reguladora 5’ no codificante del gen Disabled 1 (DAB1) como el defecto genético causante de SCA37. Además, se describe la correlación clínico-genética y los primeros hallazgos neuropatológicos en SCA37 que indican que la enfermedad está causada por la desregulación de la expresión de DAB1 en el cerebelo con pérdida severa de células de Purkinje en la corteza cerebelosa y la presencia de gránulos perisomáticos ubiquitinados e inmunoteñidos para DAB1. Es importante destacar que la repetición ATTTC desregula la expresión del ARN de DAB1 resultando en la sobreexpresión de la ruta de señalización mediada por reelina-DAB1 y PI3K/AKT en el cerebelo SCA37. Por último, pero no menos importante, se han realizado estudios de ligamiento del genoma completo y secuenciación del exoma en una familia de Menorca con siete individuos afectos que presentaban ataxia, nistagmo, disartria, polineuropatía y signos piramidales de forma variable y con una herencia autosómica dominante. La edad de inicio de la enfermedad oscila entre los 15 y 50 años. Las resonancias magnéticas revelaron atrofia cerebelosa con desmielinización cerebral, y los estudios neurofisiológicos mostraron polineuropatía sensitiva axonal moderada con respuesta cutánea simpática anormal predominantemente en las extremidades inferiores. Se identificó la variante c.1877C> T (p.Ser626Leu) en el gen SAMD9L como el defecto genético causante de la enfermedad. El estudio también demuestra la localización mitocondrial de la proteína SAMD9L humana, con niveles disminuidos en fibroblastos de los pacientes, así como deficiencias mitocondriales y lisosomales en este nuevo subtipo de ataxia. Además, la sobreexpresión del ARNm de SAMD9L mutado humano demuestra deterioro de la movilidad y afectación vestibular/sensorial en los embriones del pez cebra. En conclusión, este estudio ha identificado los déficits genéticos en el 26,6% de nuestros casos de ataxia, demuestra la mutación intrónica repetitiva e inestable ATTTC dentro del gen DAB1 como la causa genética subyacente proporcionando evidencia de la desregulación de la señalización mediada por reelina-DAB1 en la ataxia espinocerebelosa tipo 37, y describe un nuevo subtipo de ataxia espinocerebelosa causada por la mutación SAMD9L, que desencadena una desregulación mitocondrial y lisosomal, apuntando al papel de SAMD9L en las funciones neurológicas motoras y sensoriales. Como resultado de esta tesis, se aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos clínicos, genéticos y fisiopatológicos subyacentes a la neurodegeneración en las ataxias espinocerebelosas, y se identifican nuevas dianas terapéuticas candidatas para el tratamiento. Spinocerebellar ataxias (SCAs) consist of a heterogeneous group of inherited movement disorders clinically characterised by progressive ataxia variably associated with additional neurological signs such as pyramidal or extrapyramidal signs, ophthalmoplegia, pigmentary retinopathy, dementia or seizures. This clinical heterogeneity is explained by its genetic heterogeneity, with more than 53 loci and 40 genes identified and associated to date. In this thesis, a cohort of 308 ataxia patients were studied, finding causative genetic variants in 82 index cases (26.6%), 45 of them previously not described. During the course of this thesis our group identified a novel SCA37 ataxia subtype and localised its genetic defect to chromosome 1p32. The present study identifies the unstable intronic ATTTC repeat mutation within the 5′-non-coding regulatory region of the Disabled 1 gene (DAB1), as the causative genetic defect of SCA37. Moreover, it describes the clinical-genetic correlation and the first neuropathological findings in SCA37 which reveal that the disease is caused by dysregulation of cerebellar DAB1 expression with severe loss of Purkinje cells in the cerebellar cortex, and the presence of ubiquitinated perisomatic granules immunostained for DAB1. Importantly, the ATTTC repeat induced DAB1 RNA switch resulting in the upregulation of reelin-DAB1 and PI3K/AKT signalling in the SCA37 cerebellum. Last but not least, whole-genome linkage and exome studies were performed in a family from Menorca with seven affected individuals variably presenting with ataxia, nystagmus, dysarthria, polyneuropathy and pyramidal signs with an autosomal dominant inheritance. Variable age at onset ranged from 15 to 50 years. MRI revealed cerebellar atrophy with cerebral demyelination, and neurophysiological studies showed moderate axonal sensory polyneuropathy with abnormal sympathetic skin response predominantly in the lower limbs. The c.1877C>T (p.Ser626Leu) variant in the SAMD9L gene was identified as the disease causative genetic defect. The study also demonstrated the mitochondrial location of human SAMD9L protein, with its levels decreased in patients’ fibroblasts and evidenced mitochondrial and lysosomal deficits in this novel ataxia subtype. In addition, overexpression of the human mutated SAMD9L mRNA revealed impaired mobility and vestibular/sensory functions in zebrafish embryos. In conclusion, this study identifies the genetic deficits in 26.6% of our ataxia cases, demonstrates the unstable ATTTC repeat mutation within the DAB1 gene as the underlying genetic cause providing evidence of reelin-DAB1 signalling dysregulation in the spinocerebellar ataxia type 37, and describes a novel spinocerebellar ataxia subtype caused by SAMD9L mutation, which triggers mitochondrial and lysosomal dysregulation, pointing to the role of SAMD9L in neurological motor and sensory functions. As a result of this thesis novel insights into the clinical, genetic and physiopathological mechanisms underlying neurodegeneration in spinocerebellar ataxias are identified providing new candidate targets for treatment. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

[cat] A Schizosaccharomyces pombe, la citocinesi està mediada per l’assemblatge i la constricció de l’anell contràctil d’actomiosiona. Pertorbacions petites en aquesta estructura activen un conjunt de mecanismes de control que tenen com a objectiu tant endarrerir el progrés de la fase G2/M com l’estabilització de l’anell en sí mateix. Els components crítics encarregats de monitoritzar aquest sistema inclouen la septation initiation network (SIN), el membre de la família de les fosfatases Cdc14 Clp1 i el domini carboxi-terminal de la quinasa Lsk1. El checkpoint de citocinesi s’activa en mutants que afecten a diversos components de l’anell d’actomiosina, així com pel tractament amb drogues com la latrunculina B (LatB), la qual interromp la polimerització del citoesquelet d’actina. El checkpoint d’endarreriment de la G2 s’associa amb l’activació de Wee1 de manera dependent de Clp1 i la desestabilització de Cdc25. Alhora, el mecanisme molecular que porta al manteniment de l’anell contràctil s’associa amb l’activitat quinasa Lsk1. En aquest estudi es demostra que la deleció de la MAPKAP quinasa Srk1 provoca la hipersensibilitat a LatB en concentracions que no afecten a la viabilitat de les cèl·lules wild-type. Tant Srk1 com la MAPK upstream Sty1 s’activen en exposar les cèl·lules a LatB. Hem observat que Srk1 és necessària per mantenir l’estabilitat de l’anell contràctil i completar la citocinesi, com es dedueix de l’exposició de soques amb srk1 delecionat exposades a LatB. En una aproximació per identificar el mecanisme pel que Srk1 regula la citocinesi, es va realitzar un screening de les proteïnes d’unió a la nostra quinasa. Aquesta va identificar la quinasa Lsk1 com a possible substat de Srk1. Aquest treball confirma la unió d’aquestes dues proteïnes, així com la capacitat de Srk1 de fosforilar Lsk1 en el seu domini amino-terminal. Finalment, hem estudiat el possible paper de Sid2 com a regulador negatiu de la via de les SAPK., [eng] In Schizosaccharomyces pombe, cytokinesis is accomplished by the assembly and constriction of the contractile actomyosin ring (CAR). Minor perturbations on this structure activate a set of control mechanisms which major goal is to delay G2/M phase as well as stabilize the CAR. Critical components in monitoring this system include the septation initiation network (SIN), the member of the Cdc14 phosphatase family Clp1 and the carboxyl-terminal domain of the Lsk1 kinase. Cytokinesis checkpoint is activated in mutants affecting different components of the CAR, as well as in cultures exposed to drugs such as latrunculin B (LatB). LatB is responsible of interrupting the polymerization of the actin cytoskeleton. G2/M transition delay is associated with the Clp1-dependant activation of Wee1 and Cdc25 destabilization. Simultaneously, molecular mechanisms involved in CAR maintenance are related to Lsk1 activity. Here we prove that the deletion of the MAPKAP kinase Srk1 causes hypersensibility to LatB in concentrations that do not affect wild type cells. Both Srk1 and its upstream kinase Sty1 are activated after exposing those cells lo LatB. Moreover, we have observed that Srk1 is necessary in maintaining the CAR stability and completing cytokinesis. To identify the mechanism of action of Srk1 upon cytokinesis, we performed a screening on proteins that bind this kinase. Of these, we selected Lsk1 as a possible substrate of Srk1. This thesis proves the binding of these two kinases. Srk1 can also phosphorylate Lsk1 in its amino-terminal domain. We also studied the possibility of Sid2 regulating negatively the SAPK network.

La depressió és una malaltia heterogènia que afecta una part substancial de la població mundial en algun moment determinat de la seva vida. En els casos lleus, la gent pot sentir tristesa i apatia durant diversos dies per les coses que li agradava fer a la vida quotidiana, mentre que en els casos greus la persona pot necessitar una combinació d’antidepressius i psicoteràpia durant diversos anys. En aquests darrers casos, iniciar el tractament tard, per diversos factors com ara un diagnòstic poc clar, pot dificultar les possibilitats futures d’èxit. Fins el moment, el diagnòstic es basa en un examen clínic dels símptomes exposats. El principal problema ve del fet esmentat que, tot i que la depressió té subtipus altament heterogenis, els metges encara no tenen el coneixement precís dels factors neurobiològics associats, i especialment dels de la depressió resistent al tractament. En aquests casos, el tractament estàndard d’assaig i error amb antidepressius pot tenir resultats perjudicials per a la salut mental del pacient, així com per a la societat si se’n mesuren les pèrdues econòmiques per absència a la feina i el cost d’un tractament més llarg. Per tant, es fa necessari esbrinar els factors neurobiològics associats a la resposta i resistència al tractament per proporcionar pistes per a un tractament dirigit amb més precisió i augmentar la taxa de resposta. Aquesta tesi se centra a crear i ampliar el coneixement existent proporcionant proves de nous marcadors genètics, epigenètics i de neuroimatge per a la resistència al tractament, especialment els relacionats amb la inflamació. El primer estudi va explorar 153 pacients deprimits que es van puntuar en funció del seu nivell de resistència i, en funció d’això, es van dividir en dos grups: resistents i no resistents. Les dues mostres es van comparar en diverses anàlisis genètiques (al·lel, genotip, haplotip) i epigenètiques (estat de metilació). Els resultats van suggerir que les variants dels gens IL-1β, IL-6 i IL-6R es podrien associar a la resistència. El segon estudi va investigar possibles alteracions neuroquímiques glutamatèrgiques associades a una pitjor resposta mesurada amb espectroscòpia de ressonància magnètica. Cinquanta pacients van proporcionar mostres per genotipar i es van sotmetre a un protocol estandarditzat per adquirir nivells metabòlics a la zona ventromedial de l’escorça prefrontal. Els resultats van mostrar que una de les mutacions genètiques examinades situada a la zona promotora del gen IL-1β podria estar associada amb un augment dels nivells glutamatèrgics i una major resistència al tractament. En conclusió, els resultats d’ambdós estudis suggereixen que la depressió resistent al tractament podria representar un subtipus separat caracteritzat per factors neurobiològics específics. El gen IL-1β, juntament amb el complex de gens IL-6 / IL-6R semblen tenir un paper específic en la resposta als antidepressius, de manera que proporcionen una gran oportunitat per a més investigacions i objectius provisionals per desenvolupar nous tractaments personalitzats en un futur proper. La depresión es una enfermedad heterogénea que afecta a una parte sustancial de la población mundial en algún momento determinado de su vida. En los casos leves, la gente puede sentir tristeza y apatía durante varios días por las cosas que le gustaba hacer en la vida cotidiana, mientras que en los casos graves la persona puede necesitar una combinación de antidepresivos y psicoterapia durante varios años. En estos últimos casos, iniciar el tratamiento tarde, por varios factores como un diagnóstico poco claro, puede dificultar las posibilidades futuras de éxito. Hasta el momento, el diagnóstico se basa en un examen clínico de los síntomas expuestos. El principal problema viene del hecho mencionado que, aunque la depresión tiene subtipo altamente heterogéneos, los médicos aún no tienen el conocimiento preciso de los factores neurobiológicos asociados, y especialmente los de la depresión resistente al tratamiento. En estos casos, el tratamiento estándar de ensayo y error con antidepresivos puede tener resultados perjudiciales para la salud mental del paciente, así como para la sociedad si se miden las pérdidas económicas por ausencia al trabajo y el coste de un tratamiento más largo. Por lo tanto, se hace necesario averiguar los factores neurobiológicos asociados a la respuesta y resistencia al tratamiento para proporcionar pistas para un tratamiento dirigido con más precisión y aumentar la tasa de respuesta. Esta tesis se centra en crear y ampliar el conocimiento existente proporcionando pruebas de nuevos marcadores genéticos, epigenéticos y de neuroimagen para la resistencia al tratamiento, especialmente los relacionados con la inflamación. El primer estudio exploró 153 pacientes deprimidos que se puntuaron en función de su nivel de resistencia y, en función de ello, se dividieron en dos grupos: resistentes y no resistentes. Las dos muestras se compararon en varias análisis genéticos (alelo, genotipo, haplotipo) y epigenéticas (estado de metilación). Los resultados sugirieron que las variantes de los genes IL-1β, IL-6 e IL-6R se podrían asociar a la resistencia. El segundo estudio investigó posibles alteraciones neuroquímicas glutamatérgicas asociadas a una peor respuesta medida con espectroscopia de resonancia magnética. Cincuenta pacientes proporcionaron muestras para genotipar y se sometieron a un protocolo estandarizado para adquirir niveles metabólicos en la zona ventromedial de la corteza prefrontal. Los resultados mostraron que una de las mutaciones genéticas examinadas situada en la zona promotora del gen IL-1β podría estar asociada con un aumento de los niveles glutamatérgicos y una mayor resistencia al tratamiento. En conclusión, los resultados de ambos estudios sugieren que la depresión resistente al tratamiento podría representar un subtipo separado caracterizado por factores neurobiológicos específicos. El gen IL-1β, junto con el complejo de genes IL-6 / IL-6R parecen tener un papel específico en la respuesta a los antidepresivos, por lo que proporcionan una gran oportunidad para más investigaciones y objetivos provisionales para desarrollar nuevos tratamientos personalizados en un futuro próximo. Depression is a heterogeneous disease affecting a substantial part of the world population at a given point in their life. In the mild cases people might feel sad and loose passion for several days for the things they enjoy doing in everyday life, while in the severe cases the person might need a combination of antidepressants and psychotherapy for several years. In the latter cases, starting the treatment late due to various factors such as unclear diagnose can hinder the future chances of success. At the moment the diagnosis is based on a clinical examination of the exhibited symptoms. The major problem comes from the aforementioned fact that while depression has highly heterogeneous subtypes, clinicians still lack the precise knowledge of the neurobiological factors associated with them, especially evident in Treatment Resistant Depression. In these cases, the standard trial and error treatment with antidepressants can have detrimental results for the patient’ mental health, as well as for the society measured in economic losses due to absence at work and cost of longer treatment. Therefore, neurobiological factors associated with treatment response and resistance are highly desirable in order to provide clues for more precisely targeted treatment and increase the response rate. This thesis is focused on building on and expanding the existing knowledge by providing evidence for novel genetic, epigenetic and neuroimaging markers for treatment resistance, especially those related to inflammation. The first study explored 153 depressed patients that were scored on their level of resistance and based on this they were divided into resistant and non-resistant group. The two samples were compared in several genetic (allele, genotype, haplotype) and epigenetic (methylation status) analyses. The results suggested that variants in the IL-1β, IL-6 and IL-6R genes might be associated with resistance. The second study investigated potential neurochemical glutamatergic alterations associated with worse response measured by MRI Spectroscopy. 50 patients provided samples for genotyping and underwent a standardized protocol to acquire metabolic levels at the vmPFC area. Results showed that one of the examined genetic mutation located in the promoter area of the IL-1β gene might be associated with increased glutamatergic levels and increased resistance. In conclusion, the results from both studies suggest that Treatment Resistant Depression might represent a separate subtype characterized by specific neurobiological factors. The IL-1β gene, together with the IL-6/IL-6R genes complex seem to play a specific role in the response to antidepressants, hence providing an exciting opportunity for further investigation and tentative targets for developing novel personalized treatments in the near future. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

[spa] La familia de CaM quinasas (CAMK por sus siglas en inglés) son una familia de quinasas, dependientes del complejo Ca2+/CaM importantes por su implicación en diferentes funciones como la transcripción de genes, la supervivencia/muerte celular (apoptosis), la organización del citoesqueleto, el aprendizaje y la memoria (Swulius & Waxham, 2008). Se ha demostrado la funcionalidad de esta familia de quinasas al expresar la CAMKII humana en Schizosaccharomyces pombe produciendo un arresto del ciclo celular. Tambien se ha descrito en S. pombe una quinasa a homologa a la CAMKI de mamíferos funcional, la cual necesita para su activación la unión del complejo Ca2+/CaM y la fosforilación por una quinasa upstream. Nuestro grupo encontró que la fosforilación de Cmk1 en respuesta a Ca2+ desaparece al mutar la CAMKK, ckk2 (Cisneros-Barroso et al., 2014). En este trabajo planteamos como primer objetivo determinar si la fosforilación de Cmk1 es debida a la actividad de la quinasa Ckk2 de manera directa. Encontramos que fosforila a Cmk1 in vivo e in vitro, como su homóloga en mamíferos la CAMKK2, estableciendo una cascada de las CAMK en S. pombe. Encontramos también que Ckk2 es una quinasa dependiente del complejo Ca2+/CaM constituyéndose como una CAMK propiamente dicha. La viabilidad de un mutante nos puede indicar si el gen mutado esta implicado en la vía del estrés al que es sometido. Al evaluar el mutante Δckk2 encontramos que la deleción de ckk2 compromete la viabilidad celular frente agentes que modifican el citoesqueleto (tiabendazol, Latrunculina) y es resistente frente agentes que compromete la pared celular (calcofluor). Del mismo modo quisimos evaluar el mutante Δckk2 en condiciones de deprivación de nutrientes y encontramos que la deleción de ckk2 no afecta la viabilidad celular, a diferencia de Ssp1, otra CAMKK en S. pombe (Hanyu et al. 2009), sin embargo es importante para la citocinesis. Observamos un retraso en la citocinesis en condiciones de deprivación de glucosa reflejado en un aumento del índice de septación entre las 4 y 12 horas de deprivación, y en condiciones de deprivación de nitrógeno encontramos que el mutante Δckk2 presenta un alto índice de septación con respecto a la cepa salvaje (26% y 0% respectivamente); esto nos indicaría que Ckk2 probablemente esté implicada en algún proceso que dé lugar a la citocinesis. Addicionalmente, encontramos que la expresión de ckk2 aumenta tanto en condiciones de deprivación de glucosa como de nitrógeno, y este aumento se ve reflejado a nivel proteico. La proteína aumenta especialmente a partir de las 12 horas en deprivación, y además se observa una modificación pos-traduccional correspondiente a una sumoilación. Del análisis de la secuencia encontramos una lisina la K202, consenso de sumoilación (Beauclair et al. 2015; Zhao et al. 2014) y que se encuentra conservada en las CAMKK2, la homóloga en mamíferos de esta K202 está descrita como una lisina de ubiquitinación (Kim et al. 2011). Nosotros hemos estudiado la ubiqüitinizacón de nuestra proteína mediante anticuerpos pero no parece ubiquitinada. Por otra parte, tampoco está descrito que la CAMKK de mamíferos se encuentre sumoilada en alguna condición. Las modificaciones por sumo pueden alterar la actividad de una proteína, su localización, y/o estabilidad. En algunos casos sumo y ubiquitina tienen roles opuestos, donde la sumoilación protege la proteína de degradación ocupando la misma lisina para la ubiquitinación (Miteva et al. 2010). Es presumible pensar que en condiciones ricas de nutrientes Ckk2 sea diana de ubiquitina y se degrade, explicando los bajo niveles de la proteína en medio rico; y por el contrario en condiciones de deprivación de nutrientes, se favorezca su sumoilación para estabilizarla, en acorde con la acumulación de Ckk2 a lo largo del tiempo., [eng] CAMK´s are a family of Ca2+/CaM dependent kinases important for several cellular processes such as gene transcription, surveillance and cell death, cytoskeleton organization, learning and memory (Swulius & Waxham 2008). Functionality of this family of kinases has been demonstrated in fission yeast where expression of human CAMKII in Schizosaccharomyces pombe produced cell cycle arrest. Moreover, a mammalian CAMKI homolog has been described in S. pombe, Cmk1. Cmk1 is activated by binding to Ca2+/CaM complex and phosphorylation by an upstream kinase. Our group has observed that phosphorylation of Cmk1 in response to calcium stress is absent in deletion of the CaMKK, Ckk2. (Cisneros-Barroso et al. 2014). At the present work, we have defined that Ckk2 phosphorylates in vivo and in vitro Cmk1, like its mammalian counterpart CAMKK2; establishing a CAMK cascade in S. pombe. Besides, Ckk2 binds to Ca2+/CaM complex constituting a CaM kinase itself . Cell viability of mutants exposed to certain conditions, gives some clues about the function of the mutated gene. So we found that Δckk2 mutant was sensitive to cytoskeleton disrupting agents (thiabendazol, latrunculina) and resistant to a chemical that disrupt cell wall (calcofluor). On the other hand, we analyzed Δckk2 in starving conditions and found that ckk2 deletion doesn’t have impact on cell viability, but it’s important for cytokinesis. We observed a delayed in cytokinesis upon glucose starvation and a high septation index in nitrogen starvation. Furthermore, we find that Ckk2 expression is upregulated at both, upon nitrogen and glucose starvation, and a modification by sumo is also observed. The lysine 202 is a consensus sequence for sumoylation and is conserved between CAMKK homologs. However, in mammalian CAMKK2, the K202 is ubiquitinated (Kim et al. 2011). We have evaluated Ckk2 ubiquitination, using antibodies and Ckk2 is not ubiquitinated. It is reported that the same lysine could be a target for ubiquitine and sumo, where sumoylation protects proteins from degradation by ubiquitynation (Miteva et al. 2010). According to our results, its reasonable to think that in rich nutrient media Ckk2 is target for degradation, and when nutrient availability is limited Ckk2 is expressed and stabilized by sumo.

TESI:L'objecte d'estudi d'aquesta tesi és el receptor CD84, que pertany a la Família del CD150, alhora englobada dins la superfamília de les immunoglobulines. La família del CD150 està composta per nou receptors que comparteixen una elevada homologia estructural, i que poden presentar interacció homotípica o heterotípica. Sis dels membres d'aquesta família presenten a la seva cua citoplasmàtica almenys un motiu d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2. La deficiència del gen que codifica per la proteïna SAP (SH2D1A), és la causant de l'aparició d'una immunodeficiència lligada al cromosoma X, la Síndrome XLP, corresponent a un desordre de baixa incidència, que es caracteritza per una elevada susceptibilitat al virus del Epstein-Barr. El CD84 es troba àmpliament expressat a la superfície dels leucòcits i és l'únic membre de la família que es troba expressat a nivells elevats en mastòcits en estat basal. Els mastòcits són les principals cèl·lules efectores de les reaccions al·lèrgiques, tot i que es troben implicats en molts altres processos, inclosos la immunitat innata i l'autoimmunitat. La via clàssica d'activació dels mastòcits s'inicia amb la unió de la IgE al receptor d'alta afinitat per la IgE (FcepsilonRI) i dóna lloc a l'alliberació d'histamina i molts altres mediadors. Les respostes mastocitàries requereixen una regulació molt precisa que està mitjançada per un ampli ventall de factors i molècules. L'objectiu d'estudi d'aquesta tesi ha estat determinar la funció del receptor CD84 en l'activació mastocitària, donada l'elevada expressió d'aquest immunoreceptor en mastòcits, i les implicacions d'aquest tipus cel·lular en la regulació de les respostes del sistema immunitari.Mitjançant estudis de sobre-expressió del receptor CD84 en una línia mastocitària de rata, RBL-2H3, vam caracteritzar el CD84 com un nou receptor inhibidor de la cascada de senyalització iniciada pel receptor d'alta afinitat per la IgE. Vam demostrar que el receptor CD84 inhibeix tant esdeveniments primerencs (com la senyalització de calci, la reorganització del citoesquelet, la desgranulació i la fosforilació de MAPKs), com esdeveniments tardans (síntesi de citocines), mitjançant la interacció homotípica, on el receptor actua com el seu propi lligand. Mitjançant la generació de mutants puntuals per a les quatre tirosines que el receptor CD84 presenta a la seva cua citoplasmàtica, vam disseccionar la implicació de cadascuna d'elles en el mecanisme inhibitori del CD84, i vam comprovar que les tirosines responsables de la inhibició del CD84 són les que es troben a les posicions 279 i 324. Per altra banda, les tirosines 262 i 299, que es troben englobades en motius d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2, no participen en el mecanisme inhibitori del CD84, determinant que la funció negativa del receptor és independent de SAP. Mitjançant estudis bioquímics, vam determinar que les molècules adaptadores c-CBL i DOK-1 participen en el mecanisme inhibitori del CD84. Vam fer també estudis de transfecció en cèl·lules COS, amb la finalitat d'establir les cinases implicades en la fosforilació del receptor CD84 i vam determinar LYN i FPS/FES com les cinases principals en la fosforilació de les tirosines 279 i 324, respectivament. Finalment, vam utilitzar una línia mastocitària humana, LAD-2, que ens ha permès corroborar els efectes observats amb la línia RBL-2H3 en un sistema fisiològicament més proper a l'humà. Vam comprovar que l'efecte inhibitori del CD84, es manté en els esdeveniments primerencs estudiats en LAD-2, i vam confirmar també, en aquesta línia cel·lular, la implicació de DOK-1 en la senyalització negativa del CD84. Les dades obtingudes en aquesta tesi perfilen el receptor CD84 com un molècula important en la funció dels mastòcits i una possible diana terapèutica en al·lèrgies inflamatòries., CD84 belongs to the CD150 family of receptors. This family is a subset of the CD2 cell-surface receptor Ig superfamily and it is defined by its binding to the cytoplasmic adaptors SAP and EAT-2. SAP/SH2D1A is the product of the gene mutation in X-linked lymphoproliferative disease (XLP), a rare immune disorder commonly triggered by Epstein-Barr virus. CD84 is a homophilic adhesion molecule expressed in a broad range of leukocytes. The CD84 is the only member of the CD150 family expressed in resting mast cells. Mast cells are currently recognized as effector cells in many settings other than mere allergic reactions, including innate immunity and autoimmunity. The classic and most studied activation pathway of these cells starts with the binding of IgE to the high-affinity Fc receptor for IgE (FcepsilonRI); and the release of histamine and other mediators after crosslinking of surface-bound IgE by allergen. Appropriate activation and fine tuning of mast cell responses is mediated by a complex array of factors and molecules. The aim of this work was to determine the function of CD84 in mast cells.The CD84 receptor was transfected and overexpressed in the rat mast cell line RBL-2H3. We found that this receptor has an inhibitory effect in early events (degranulation, cytoskeleton arrangement, calcium influx, MAPKs phosphorylation and PI3K phosphorylation) and late events (cytokines synthesis). Generation of mutants for each of the four tyrosines present in the cytoplasmic tail of the CD84, demonstrates that this inhibitory effect is related with Y279 and Y324. Interestingly, Y262 and Y299, which are part of a consensus motif for SAP or EAT-2 binding, do not participate in CD84-mediated inhibition. Thus, we postulate that the inhibitory effect of the CD84 is not mediated by SAP or EAT-2 in mast cells. We performed transfection studies with COS cells and we determined that LYN and FPS/FES kinases are the main kinases in Y279 and Y324 phosphorylation, respectively. Finally we used a human mast cell line, LAD-2, to corroborate the effects observed in RBL-2H3. We found that CD84 receptor has also an inhibitory effect in IgE-dependent early events in LAD-2, whereas no inhibitory effect was seen using non-immunological stimuli. These data suggest that CD84 may play a role in modulating FcepsilonRI-mediated signaling in mast cells and it could have a protective role against undesired allergic and inflammatory responses.

Les cèl·lules de llevat, al igual que les cèl·lules eucariotes d'organismes superiors, responen a situacions d'estrès extracel·lular activant la via de les MAP quinases, les quals transdueixen el senyal activant l'expressió de gens necessaris per a mantenir l'homeostasi cel·lular.Evidències experimentals recents ens indiquen que la nova quinasa Srk1, identificada en el nostre grup en cèl·lules de llevat, participa tant en la resposta a estrès cel·lular com en la regulació del cicle cel·lular (López-Avilés S, Grande M, Gonzalez M, Helgesen AL, Alemany V, Sánchez-Piris M, Bachs O, Millar JB, and Aligue R (2005). Inactivation of the Cdc25 phosphatase by the stress-activated Srk1 kianse in fission yeast. Mol Cell, 17, 49-59). Pel que fa al paper de la Srk1 en el cicle cel·lular normal, hem descrit que actua inhibint la transició g2/M mitjançant la fosforilació inhibidora de la fosfatsa CDc25, promovent la seva unió a una proteïna 14-3-3 (Rad24 en S. pombe) i la seva posterior exclusió del nucli tal i com s'havia descrit per a la quinasa de checkpoint Chk1. Pel que fa al paper de la Srk1 en resposta a estrès, estudis paral·lels duts a terme pel grup de la Dra. Quinn van descriure que la Srk1 és fortament induïda en resposta a estrès i que sota aquestes condicions és fosforilada de manera depenent de la MAPK Sty1. Amb la finalitat de determinar la naturalesa d'aquesta fosforilació i la seva rellevància en la resposta a estrès vam realitzar una sèrie d'assajos de fosforilació in vitro que demostren que la Srk1 és fosforilada i activada en la T463 per la MAP quinasa Sty1. A més a més, hem observat que l'activitat i estabilitat de la Srk1 depèn de la presència de la MAP quinasa, ja que en absència de Sty1 la Srk1 no és activa i es degrada via proteasoma. Per altra banda, hem establert el paper de la Srk1 en resposta a estrès: és la responsable d'aturar el cicle cel·lular en la transició G2/M per tal d'evitar que les cèl·lules continuin dividint-se fins que s'hagin adaptat a l'estrès imposat. Aquesta funció la realitza a través de la fosforilació de la Cdc25, promovent la seva unió a Rad24 i exclusió del nucli. A més a més, hem descrit que la fosforilació de la Srk1 per la MAPK és necessària per a que les cèl·lules responguin correctatment a l'estrès.Finalment, experiments recents indiquen un nou paper de la Srk1 controlant negativament la via de les MAP quinases de resposta a estrès. Hem observat que en absència de Srk1, Sty1 es manté fosforilada durant períodes de temps molt més llargs, fet que suggereix un paper en el mecanisme de silenciament de la via un cop la font d'estrès ha desaparegut o la cèl·lula s'ha adaptat a ella. Els nostres resultats indiquen que la Srk1 fosforila la T225 de la MAPKK Wis1 afectant la seva unió amb la MAPK Sty1, de manera que s'afavoreix la defosforilació per les fosfatses Pyp1 i Pyp2 i s'evita una possible reactivació de la via que resultaria tòxica per a la cèl·lula., Activation and regulation of the Srk1 kinase in stress response in Schizosaccharomyces pombeControl of cell cycle progression by stress-activated protein kinases (SAPKs) is essential for cell adaptation to extracellular stimuli. The Schizosaccharomyces pombe SAPK Sty1/Spc1 orchestrates general changes in gene expression in response to diverse forms of cytotoxic stress. Here we show that Sty1/Spc1 is bound to its target, the Srk1 kinase, when the signaling pathway is inactive. In response to stress, Sty1/Spc1 phosphorylates Srk1 at threonine 463 of the regulatory domain, inducing both activation of Srk1 kinase, which negatively regulates cell cycle progression by inhibiting Cdc25, and dissociation of Srk1 from the SAPK, which leads to Srk1 degradation by the proteasome.Moreover, we have found a possible role for the Srk1 kinase in the inhibition of the MAPK pathway through a negative feedback mechanism. As srk1 gene is highly induced in response to several types of stress in a Sty1-dependent manner, it seems to be necessary to downregulate the pathway. Our results suggest that Srk1 phosphorylates Wis1 at threonine 225 to impair its binding with the MAPK Sty1, in order to avoid the reactivation of the stress response pathway. Therefore, Sty1 will be dephosphorylated and inactivated by the tyrosine phosphatases Pyp1 and Pyp2. The importance of these results lays on the inactivation of a MAPK pathway by a kinase.

En el llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe Cdc25 és inhibida per fosforilació en resposta a una aturada en la replicació o a dany al DNA per les cinases Cds1 i Chk1. En el nostre grup hem vist que la cinasa activada per estrés Srk1 també està involucrada en la regulació de l'entrada en mitosi a través de la fosfatasa Cdc25.Estudis de co-precipitació i de fosforilació van demostrar la interacció entre Srk1 i Cdc25, així com la fosforilació de Cdc25 per Srk1 in vitro i per Srk1 immunoprecipitada a partir d'extractes cel·lulars. D'altra banda, la fosforilació per Srk1 estabilitza Cdc25 de forma depenent de la proteïna 14-3-3, i la manté retinguda al citoplasma.La fosforilació per Srk1 té lloc en la regió N-terminal de Cdc25, en els mateixos residus fosforilats per les cinases Chk1 i Cds1, i la fosforilació en aquests llocs és necessària per tal que proteïna Srk1 provoqui un bloqueig en la fase G2 del cicle cel·lular. Nosaltres demostrem que Srk1 no regula Cdc25 en resposta a estrès genotòxic, sinó en resposta a estrès ambiental no-genotoxic durant la fase G2. L'estrés osmòtic i oxidatiu provoquen un augment en la taxa transcripcional de Srk1 i una activació de la proteïna depenent de la MAPK Sty1. Sty1 fosforila Srk1 en la treonina 463, augmentant 5 vegades la seva activitat. Srk1 és necessària per mantenir els nivells de Cdc25 durant la resposta a estrès i per tal d'induir la seva estabilització a través de la unió a la proteïna 14-3-3. Tots aquests resultats suggereixen un model en el que Srk1 bloqueja en primer lloc el cicle cel·lular en resposta a estrès ambiental, de forma paral·lela a l'activació transcripcional de gens necessaris per protegir la cèl·lula, i en segon lloc, Srk1 estabilitza Cdc25 per tal que la cèl·lula pugui iniciar la divisió un cop s'ha adaptat a l'estrès.