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El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena localizada en la matriz mitocondrial. La transcripción del DNAmt se inicia a partir de tres promotores localizados en el D-loop, uno para la cadena ligera (L) y dos para la cadena pesada (H1 y H2). Las unidades de transcripción que se inician en H2 y en L producen una especie policistrónica gigante que cubre casi toda la cadena. En cambio, la transcripción iniciada en H1 se termina en el extremo 3’ del rRNA 16S. El papel principal de esta atenuación se debe al factor de terminación de la transcripción, mTERF. mTERF, es una proteína codificada en núcleo, cuya forma madura tiene 342 aminoácidos. Se ha descrito que se une a varios lugares estratégicos del DNA mitocondrial, donde controla procesos como la terminación de la transcripción o la pausa de la maquinaria de replicación mitocondrial. De estos lugares, el que presenta mayor afinidad es la secuencia de 28 pares de bases (DNA28pb) en el gen del tRNALeu(UUR) mitocondrial. Ensayos in vitro han demostrado que la unión de mTERF a esta región provoca la terminación de la transcripción del DNA mitocondrial en ambos sentidos. En este trabajo se estudia, desde un punto de vista estructural y mediante técnicas de cristalografía de proteínas, el complejo de mTERF con el DNA que contiene la secuencia de terminación. Durante la producción de mTERF recombinante, la proteólisis espontánea de la forma entera de la proteína (Arg56-Ala399) dio lugar a una variante corta, mTERF-ΔN (Arg99-Ala399) que mantenía la unión al DNA. Se determinó la estructura tridimensional del complejo con DNA de mTERF-ΔN a 2.4 Å de resolución. La disposición del DNA en el eje z del cristal provocó que los cristales de mTERF-ΔN en complejo con un DNA29pb, con un parámetro c de la celda unidad demasiado pequeño para albergarlo, presentaran graves problemas de anisotropía y desorden, dando lugar a mapas de densidad electrónica muy distorsionados. Se realizaron entonces ensayos de cristalización con oligonucleótidos de menor longitud, pudiéndose trazar y refinar el DNA y la proteína completa con los cristales de mTERF-ΔN en complejo con el DNA12pb. La estructura del fragmento ΔN se usó para resolver la estructura del complejo de mTERF entera con el DNA15pb a 3.1 Å de resolución. En estos cristales, la proteína interacciona mediante los subdominio N-terminal y C-terminal con dos moléculas de DNA simétricas que no interaccionan entre ellas y cuya posición relativa viene dada por un ángulo de ~36º. mTERF se une a la largo del surco mayor del DNA, estableciendo contactos con los fosfatos mediante 19 residuos y con bases nitrogenadas mediante 5 residuos. La estructura cristalográfica de mTERF consiste en nueve repeticiones estructurales, de TERF-I a IX, flanqueadas por un segmento N-terminal y una hélice α C-terminal. Cada motivo TERF está formado por unos 35 aminoácidos que se estructuran en tres hélices α (H1, H2 y H3) formando una superhélice trigonal levógira con un núcleo hidrofóbico central. La combinación de la conectividad en superhélice levógira con la propagación en tándem del motivo para formar un solenoide es única de las proteínas de la familia MTERF. En base a la estructura cristalográfica se generaron modelos para estudiar los complejos en solución mediante la técnica de SAXS. La representación gráfica del error asociado al ajuste entre la curva teórica de dispersión para cada modelo y la curva medida experimentalmente, presenta un mínimo, indicando que la unión de mTERF al DNA28pb se da preferentemente sobre una zona del DNA. Los ensayos de unión y especificidad de mTERF y las formas truncadas de ésta con el DNA28pb mediante geles nativos de retardo muestran que mTERF-ΔC y ΔN-mTERF-ΔC no unen DNA y que mTERF y mTERF-ΔN lo unen específicamente., The human mitochondrial genome is a closed circular molecule located within the mitochondrial matrix. mtDNA transcription is initiated from tree promoters in the D-loop, one for L-strand (L) and two for the H-strand (H1 and H2). Transcription from H2 and L proceeds around the mtDNA circle, creating a polycistronic RNA. On the other hand, transcription initiated in H1 ends at the 3’end of rRNA 16S. The main role of this attenuation is due to the mitochondrial transcription termination factor mTERF. mTERF, is a nucleus-encoded protein whose mature form has 342 amino acids. It has been described that mTERF binds to several strategic mtDNA sites, where it controls processes such as transcription termination or pausing of the replication machinery. Among them, the 28bp sequence from the tRNALeuUUR gene shows the highest affinity of binding to mTERF. In vitro assays have shown that binding of mTERF to this site promotes termination of transcription bidirectionally. We study, from a structural point of view, the mTERF complex with the oligonucleotide containing the termination sequence. During recombinant mTERF production, spontaneous proteolysis of the full-length protein (Arg56–Ala399) yielded a shorter variant (Arg99–Ala399; mTERF-ΔN) yet DNA-binding form. The three-dimensional struc¬ture of mTERF-ΔN was determined from SeMet-derivatized crystals at 2.4Å resolution. In the first mTERF-ΔN-DNA crystals, the arrangement in the z-axis of the large 29bpDNA molecule, compared to the c parameter of the unit cell, caused severe problems of anisotropy and disorder, which resulted in low quality electron density maps. Then crystallization assays were performed with shorter oligonucleotides, being able to trace and refine the complex structure with mTERF-ΔN-12bpDNA crystals. The structure of ΔN fragment was used to solve the full-length mTERF structure at 3.1Å resolution in complex with 15bpDNA. In these crystals, two crystallographically related identical oligonucleotides related by ~36° are bound by two distinct regions of a single protein moiety, the N-terminal and C-terminal subdomains. mTERF wraps round the DNA along the major groove through 19 nonspecific interactions with both dsDNA backbone phosphates and 5 interactions with DNA nitrogen bases. mTERF consists of nine structural repeats, TERF-I–TERF-IX flanked by an N-terminal extended segment and a C-terminal α-helix C. Within each repeat, roughly 35 residues fold into three α-helices (H1, H2 and H3) that are arranged in a left-handed triangular superhelix around a central hydrophobic core. The combination of left-handed helical connec¬tivity with tandem propagation is unique to mTERF. Based on the crystallographic structure, we constructed models to study the complex in solution by small-angle X-ray scattering (SAXS). The graphical representation of agreement of each of the models to the experimental SAXS curve presents a minimum, indicating the specificity of the binding between mTERF and the 28bpDNA. The 28bpDNA binding affinity and specificity of mTERF and truncated forms, assayed by native gels, shows that mTERF-ΔC and ΔN-mTERF-ΔC do not bind DNA while mTERF and mTERF-ΔN bind it specifically.

La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia.En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa.Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN., Bacterial conjugation is one of the most important horizontal gene transfer mechanisms and the main cause of the rapidly spread of the antibiotic resistance in bacteria. The ability of bacteria to conjugate was discovered in 1946 in E. coli cultures and years later in Gram-positive bacteria. The conjugative process begins with the cleavage of a specific phosphodiester bond through a relaxase protein, playing a key role in the initiation of the transfer.TrwC is the DNA strand transferase that catalyzes the initial and final stages of conjugative DNA transfer in the plasmid R388 from E. coli. We have solved the crystal structure of the N-terminal relaxase domain of TrwC in complex with a 27 base-long DNA oligonucleotide that contains both the recognition hairpin and the scissile phosphate. In addition, a series of ternary structures of protein-DNA complexes with different divalent cations at the active site have been solved. Systematic anomalous difference analysis allowed us to determine unambiguously the nature of the metal bound. Zn2+, Ni2+ and Cu2+ were found to bind the histidine-triad metal binding site. Comparison of the structures of the different complexes suggests two pathways for the DNA to exit the active pocket. They are probably used at different steps of the conjugative DNA-processing reaction. The structural information allows us to propose (i) an enzyme mechanism where the scissile phosphate is polarized by the metal ion facilitating the nucleophilic attack of the catalytic tyrosine, and (ii) a probable sequence of events during conjugative DNA processing that explains the biological function of the relaxase.We also investigated the N-terminal relaxase domain of the protein MobM from plasmid pMV158 from Streptococcus agalactiae, and herein we report the X-ray crystal structure of the complex between this domain and a 26-mer oligonucleotide that mimics the oriT sequence just upstream the nic site. The overall fold of the protein shows a core domain comprising five anti-parallel beta-strands flanked by pairs of alfa-helices. This fold resembles that of Gram-negative relaxases in spite of the very low sequence homology. The DNA molecule binds to MobM through a number of electrostatic interactions following a large crevice over the surface of the protein. Intermolecular contacts are clustered in four main regions; the two most important ones involve a bulge formed by two consecutive beta-turns, and a long unstructured loop that wraps around the single stranded DNA part.