Search

[cat] Aquesta Tesi Doctoral ha estat pensada per avaluar, mitjançant l’estudi de virus contaminants, l’origen de la contaminació fecal i l’avast de la disseminació a l’aigua. Amb aquesta finalitat s’han utilitzat eines moleculars per a la detecció i quantificació de virus especifics humans, bovins i porcins i a més a més s’ha desenvolupat una nova eina per traçar la contaminació ovina a l’ambient. Els principals agents virals amb risc per als humans són d’origen humà però les femtes animals, amb potencials patògens zoonòtics, representen també un risc per a la salut humana. La intensificació de la producció animal o l’increment de plujes torrencials previst amb els escenaris proposats per al canvi climàtic presenten nous reptes per al control de la contaminació fecal a l’aigua. Bona part de la Tesi, ha anat lligada al projecte europeu VIROCLIME permetent dur a terme estudis a nivell internacional. S’ha caracteritzat la disseminació de virus humans contaminants a l’aigua d’un riu situat en una conca Mediterrània. Mitjançant el registre de variables hidro-climàtiques, la recollida de mostres d’aigua de riu, aigua de mar i aigua residual, i l’anàlisi de FIB i virus indicadors de contaminació fecal humana (HAdV i JCPyV), virus patògens (NoVGII, HEV), i un virus emergent (MCPyV), s’ha estudiat durant un any, l’impacte que l’aigua residual crua o els efluents de les depuradores tenen en la qualitat microbiològica del riu. En un segon estudi realitzat conjuntament amb laboratoris de Suècia, Grècia, Hongría i Brasil, s’ha pogut estandarditzar el mètode de floculació amb llet descremada, per a la concentració de virus, i els assajos de qPCR per identificar i traçar l’origen de la contaminació fecal a l’aigua. Durant 18 mesos de mostrejos a conques de rius situats a les regions Mediterrània, Àrtica, Continental i Tropical, s’han identificat virus humans (HAdV i JCPyV), bovins (BPyV) i porcins (PAdV), demostrant que aquestes eines virals són fiables i útils per a qualsevol àrea geogràfica o matriu d’aigua. Fins al principi d’aquesta tesi, només es disposava de marcadors virals de contaminació fecal porcina i bovina. Analitzant mostres de femta i orina d’ovella, amb un assaig de PCR d’ample espectre per a la detecció de poliomavirus, es van obtenir per primera vegada seqüències d’un putatiu nou poliomavirus oví. A partir d’aquí, s’han dissenyat dos assajos de PCR específics per poder traçar la contaminació fecal ovina a l’ambient. Arrel d’aquest treball, durant l’últim any de la tesi, es va plantejar una estada a Nova Zelanda perquè es tracta del país amb més ovelles per càpita i representa bona part de la indústria ramadera del país. Traçar i identificar l’origen de la contaminació fecal animal a l’aigua és doncs bàsic, tant per la gestió dels residus com per l’avaluació dels riscos per a la salut humana. El quart estudi inclòs a la tesi, es va dissenyar per identificar les fonts principals de contaminació fecal i avaluar, al mateix temps, les diferents eines de MST utilitzades a Nova Zelanda i al laboratori de la doctoranda. S’han recollit mostres de riu als territoris ramaders més importants de l’illa del sud, i s’han analitzat E. coli, virus específics indicadors de contaminació fecal humana (HAdV, JCPyV) bovina (BPyV) i ovina (OPyV), marcadors bacterians específics d’humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) i de remugants (BacR) i esterols i estanols indicadors de contaminació fecal humana o de remugant., [eng] This thesis was designed to evaluate, through the study of viruses, the source of the fecal contamination and its spread in water matrices. For this purpose molecular tools have been used for the detection and quantification of specific human porcine and bovine viruses, and a new tool has been developed to trace ovine pollution in the environment. Human waterborne viruses pose the main risk to humans, but animal feces, with potential zoonotic pathogens, also represent a risk to human health. The intensification of animal production and the predicted scenarios for climate change, with increase of torrential rains, present new challenges for the control of fecal contamination in water . Much of this work has been linked to the European project VIROCLIME allowing studies conducted worldwide. We characterized the spread of contaminant human viruses in a Mediterranean river basin . By recording hydro-climatic variables, collecting samples of river water, sea water and wastewater, and analysing FIB and human virus indicators of fecal pollution (HAdV and JCPyV), pathogenic viruses (NoVGII , HEV) and an emerging virus (MCPyV) we have studied, thoughouth a year, the impact of raw wastewater and efluents from the wastewater treatment plants the microbiological quality of the river. In a second study, conducted with laboratories in Sweden, Greece, Hungary and Brazil, we standardized the viral concentration method, Skimmed Milk Flocculation, and specific qPCR assays to identify and trace the origin of contamination in water. During an 18 months sampling period, in river basins located in the mediterranean region, arctic, continental and tropical regions, we identified human (HAdV and JCPyV), bovine (BPyV ) and porcine viruses (PAdV), demonstrating that these tools are reliable and useful for any geographic area or water matrix. At the beginning of this thesis, only porcine and bovine viral fecal indicators were available to trace fecal pollution. Since no ovine viral indicator was described before the present work, we designed a study to develop a new tool to trace sheep fecal contamination. Firstly we analyzed urine and stool samples from sheep, with a broad spectrum PCR assay for the detection of polyomavirus. We obtained sequences of a putative new ovine polyomavirus and designed two PCR assays specific for the new ovine virus. During the last year of the thesis raised a stay in New Zealand because it is the country with more sheep per capita and represents much of the livestock industry in the country. Trace and identify the source of animal fecal contamination in water is therefore essential for both waste management for the evaluation of risks to human health. The fourth study included in this thesis was designed to identify the main sources of fecal contamination and evaluate the same time , the different tools used MST in New Zealand and the student laboratory. River samples were collected at major livestock areas south of the island , and analyzed E.coli , viruses specific indicators of human fecal contamination (HAdV, JCPyV) bovine (BPyV) and sheep (OPyV) specific bacterial markers in humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) and ruminants ( BacR) and sterols and stanols indicators of human fecal contamination or ruminants.

Les poblacions humanes i animals excreten una gran diversitat de virus patògens en les seves femtes i orina, de manera que l’aigua residual que generen representa un dels principals vehicles de la disseminació de patògens a les aigües superficials, subterrànies o costaneres i conseqüentment, als aliments. La contaminació del medi ambient suposa un risc greu de salut pública. S’ha estimat que en el conjunt del planeta, aproximadament 3.000 milions de persones no disposen d’aigua potable i que el 95% de l’aigua residual domèstica és abocada al medi ambient sense tractar. Aquesta tesi doctoral es basa en dues àrees d’estudi de la virologia ambiental. Per una banda s’ha avaluat l’estabilitat de virus contaminants en condicions naturals (Capítol I) i davant processos de desinfecció (Capítol II). En aquests estudis, els indicadors virals/patògens HAdV i JCPyV han estat analitzats. D’altra banda, s’ha proposat una nova eina per a la identificació de l’origen de la contaminació fecal al medi ambient (Capítol III). Al Capítol I, que inclou els estudis 1, 2 i 3, s’ha caracteritzat els factors ambientals i els mecanismes que intervenen en la inactivació natural dels HAdV a diferents ambients aquàtics i aliments, considerant la temperatura i la llum solar com els agents potencialment més rellevants, així com l’estandardització entre diferents laboratoris d’un mètode de qPCR per a la quantificació dels HAdV en mostres d’aliments (fruits rojos). Al Capítol II (estudis 4, 5 i 6) s’ha estudiat l’efectivitat de tractaments químics (clor) i físics (llum ultraviolada) en la inactivació de virus contaminants. Finalment, al Capítol III (estudi 7), s’ha considerat que era interessant completar les eines moleculars existents per a identificar les fonts de contaminació fecal en aigua i aliments, i s’ha desenvolupat una nova tècnica molecular per a traçar la contaminació fecal d’aviram al medi ambient, mitjançant la detecció i quantificació dels parvovirus de pollastre i gall d’indi. És evident que la contaminació viral en el medi representa un risc d’infecció important en països en vies de desenvolupament però també en zones industrialitzades on els tractaments d’aigua no aconsegueixen eliminar la totalitat dels virus presents. Durant el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral s’ha demostrat que, en molts casos, els mètodes de desinfecció més habituals en la inactivació de virus contaminants no són completament eficients i sovint es detecten virus infecciosos després de tractaments a les dosis o concentracions habitualment utilitzades. Aquesta observació demostra la importància de seguir treballant per a caracteritzar els diversos factors i mecanismes particulars que condicionen la inactivació natural dels virus patògens al medi ambient, i de desenvolupar i optimitzar nous mètodes de desinfecció per assolir la inactivació d’un rang de microorganismes més ampli, més enllà dels indicadors bacterians tradicionals. Els avanços en la virologia ambiental han d’anar forçosament acompanyats d’avenços en els tècniques i mètodes utilitzats, que han de permetre detectar, quantificar i caracteritzar els virus presents al medi de manera rutinària. En aquest sentit, els mètodes moleculars representen eines valuoses que faciliten l’estudi de diversos aspectes de la disseminació de virus al medi ambient, com per exemple identificar l’origen de la contaminació fecal per a implementar mesures de remediació a les fonts de contaminació més rellevants en cada localitat. Els virus patògens contaminants representen un problema de salut pública que cal resoldre imperativament millorant els processos de control microbiològica de recursos tant imprescindibles com són l’aigua i els aliments, introduint paràmetres virals que complementin als indicadors fecals bacterians estàndards.

[eng] Stable isotopes, as tracers of the food chain, have been used to characterize the relationship between consumers and their food since isotopic fractionation implies discrimination against certain isotopes. But stable isotope analyses (SIA) can also be carried out in fish reared with artificial diets, as gilthead sea bream (Sparus aurata), the species most cultivated in the Mediterranean. Changes in natural abundance of stable isotopes (13C and 15N) in tissues and its reserves may reflect changes in the use and turnover of nutrients as the catabolic enzymes involved in the processes of decarboxylation and deamination show a preference for the lighter isotopes. Therefore these analyses can provide us useful information about the nutritional and metabolic status of fish. The aim of this project was to determine the capacity of stable isotopes to be used as potential markers of growth capacity and rearing conditions in sea bream. In this sense, stable isotope analyses have been combined with other metabolic (cytochrome-c-oxidase, COX, and citrate synthase, CS, activities) and growth parameters (RNA, DNA). The set of results obtained from the different studies conducted in this project shows that SIA, in combination with other metabolic parameters, can serve as an effective tool in discriminating fish with better growth potential as well as sensitive marker of nutritional status and fattening. Moreover, combination of stable isotopes analysis with emerging tools such as proteomic techniques (2D-PAGE), provide new insights on the metabolic changes occurring in fish muscles during exercise induced growth., [spa] Els isòtops estables com a traçadors de la cadena alimentària s'han utilitzat per caracteritzar la relació entre els consumidors i els seus aliments, ja que el fraccionament isotòpic implica una discriminació en contra de certs isòtops. Però les anàlisis d'isòtops estables (SIA), també es poden dur a terme en peixos cultivats amb dietes artificials, com la orada (Sparus aurata), la especie més cultivada a la Mediterrània. Canvis en l'abundància natural d'isòtops estables (13C i 15N) en els teixits i les seves reserves poden reflectir els canvis en l'ús i reciclatge dels nutrients ja que els enzims catabòlics implicats en els processos de descarboxilació i desaminació mostren una preferència pels isòtops més lleugers. Per tant, aquestes anàlisis ens poden proporcionar informació útil sobre l'estat nutricional i metabòlic dels peixos. L'objectiu d'aquest projecte va ser determinar la capacitat dels isòtops estables per ser utilitzats com a marcadors potencials de la capacitat de creixement i condicions de cria de l'orada. En aquest sentit, les anàlisis d'isòtops estables s'han combinat amb altres metabòlics (activitats citocrom-c-oxidasa, COX, i citrat sintasa, CS) i els paràmetres de creixement (ARN/ADN). El conjunt de resultats obtinguts en els diferents estudis realitzats en aquest projecte demostra que el SIA, en combinació amb altres paràmetres metabòlics, pot servir com una eina eficaç per discriminar els peixos amb millor potencial de creixement, així com a marcador sensible de l'estat nutricional i d'engreix. D'altra banda, la combinació de l'anàlisi d'isòtops estables amb les eines emergents, com ara tècniques de proteòmica (2D-PAGE), ens proporciona nous coneixements sobre els canvis metabòlics que ocorren en els músculs dels peixos durant l’increment del creixement muscular induït per l'exercici.