Search

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agrarias, área Reproducción, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en marzo de 2018. La aplicación de la inseminación artificial (IA) en cualquier especie requiere del mantenimiento del semen en condiciones no fisiológicas. En ovinos, la IA con semen refrigerado se encuentra más difundida que con semen congelado debido a los bajos porcentajes de preñez obtenidos con este último. Estos resultados se deben a la complejidad del cérvix de la oveja, que dificulta el paso del instrumental de IA y deposición del semen en la luz uterina, y a la mayor sensibilidad espermática a la criopreservación. Una de las razones de la baja fertilidad obtenida con semen congelado sería la criocapacitación, debida a una redistribución lipo-protéica de la membrana plasmática durante la congelación. En estudios previos del grupo se observó que la calidad espermática se ve afectada por el método de colecta, por lo que se hipotetizó que podría relacionarse al contenido de plasma seminal (PS) de los eyaculados y que esto, a su vez, influiría en la sensibilidad espermática a la criopreservación. Se compararon eyaculados obtenidos con vagina artificial (VA) y electroeyaculador (EE) en estado fresco y luego de la criopreservación y los componentes proteicos del PS. Se observó que, los eyaculados frescos obtenidos con EE presentaron mayor calidad, proporción de PS y contenido de proteínas totales. Ha sido demostrado que las proteínas del PS previenen/revierten algunos de los daños ocasionados por la congelación y mantienen a los espermatozoides en un estado no capacitado. Este efecto se debería a una fracción del PS compuesta por proteínas que interactúan con la superficie espermática (PPSiE), pertenecientes a una familia de proteínas compuestas por un doble dominio de fibronectina tipo II (FN-II). Luego de analizar el efecto del agregado de las PPSiE a espermatozoides criopreservados se observó que su adición revirtió la criocapacitación, sin diferencias entre métodos y estaciones de colecta. Con el objetivo de establecer si las subpoblaciones espermáticas influyen en el efecto de determinados tratamientos se llevó adelante su caracterización en semen criopreservado en base a sus características de movilidad y se comparó la distribución en carneros de alta y baja fertilidad. Fueron distinguidas cuatro subpoblaciones en el semen descongelado distribuidas diferencialmente según la fertilidad del reproductor. Al evaluar el efecto de las PPSiE se observó interacción entre el tratamiento y la estación de colecta y diferencias según el método de colecta, opuestamente a lo observado al analizar a la población en conjunto sin distinguir entre poblaciones. Destacando los inconvenientes que ocasiona ignorar la variabilidad de las muestras seminales. Los resultados obtenidos demostraron que las proteínas del PS son capaces de revertir los daños ocasionados por la criopreservación, pero debido a que su concentración como la capacidad para proteger a los espermatozoides es muy variable, se planteó la expresión de un péptido recombinante compuesto por cuatro dominios de FN-II, que podría llevar adelante la actividad crioprotectora. Se logró expresar en E. coli una proteína compuesta por tiorredoxina, cuatro dominios de FN-II y un tag de histidina y se observó que esta se unió preferentemente a la región acrosomal y pieza media de los espermatozoides, siendo capaz de revertir la fosforilación en sustratos de PKA y al ser utilizada en la concentración 0,3 μM aumentó el porcentaje de fecundación in vitro. Los resultados obtenidos podrían servir para el desarrollo de estrategias biotecnológicas para mejorar la calidad y la capacidad fecundante del semen ovino criopreservado. The application of artificial insemination (AI) in any species requires the maintenance of semen under non-physiological conditions. In sheep, AI with refrigerated semen is more widespread than with frozen semen due to the low percentages of pregnancy obtained. These results are due to the complexity of the sheep's cervix, which makes it difficult to pass the AI instruments and deposition of the semen in the uterine lumen and to the greater sperm sensitivity to cryopreservation. One of the reasons for the low fertility obtained with frozen semen would be cryocapacitation, due to a lipoprotein redistribution of the plasma membrane during freezing. In previous studies of the group it was observed that the sperm quality is affected by the collection method, so it was hypothesized that it could be related to the seminal plasma (SP) content of the ejaculates and that this, in turn, would influence the sperm sensitivity to cryopreservation. Ejaculates obtained with artificial vagina (AV) and electroejaculation (EE) were compared in fresh and after cryopreservation and the SP protein components. It was observed that, fresh ejaculates obtained with EE presented higher quality, proportion of SP and total protein content. It has been shown that SP proteins prevent/reverse some of the damage caused by freezing and keep the sperm in anon-capacitated state. This effect is due to a fraction of the SP composed of proteins that interact with the sperm surface (PPSiE), belonging to a family of proteins composed of a double domain of fibronectin type II (FN-II). After analyzing the effect of adding the PPSiE to cryopreserved spermatozoa, it was observed that their addition reversed the cryocapacitation, without differences between methods and collection seasons. In order to establish how sperm subpopulations could influence the effect of certain treatments, their characterization in cryopreserved semen was carried out based on their motility characteristics, and the distribution in rams of high and low fertility. Four subpopulations in the thawed semen were differentially distributed according to the reproductive fertility. When evaluating the effect of the PPSiE, interaction between the treatment and the collection season was observed and differences according to the collection method, opposite to what was observed when analyzing the population as a whole without distinguishing between populations. Highlighting the inconvenience caused by ignoring the variability of the seminal samples. The results obtained showed that SP proteins are capable of reversing the damage caused by cryopreservation, but because their concentration as the ability to protect sperm is very variable, the expression of a recombinant peptide composed of four domains of FN-II was proposed which could carry out the cryoprotective activity. It was possible to express a protein composed of thioredoxin, four domains of FN-II and a histidine tag. It was observed that this was preferentially bounded to the acrosomal region and middle piece of the sperm, being able to reverse the phosphorylation in PKA substrates and when used in the concentration 0.3 μM increased the percentage of in vitro fertilization. The results obtained could be used to develop biotechnological strategies to improve the quality and fertility of cryopreserved sheep semen. EEA Balcarce Fil: Ledesma, Alba Verónica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina

Seminal plasma (SP) of South American Camelids could interfere with the interaction of spermatozoa with the extenders; therefore it becomes necessary to improve semen management using enzymatic treatment. Our objective was to compare two cooling protocols for llama semen. Twelve ejaculates were incubated in 0.1% collagenase and then were divided into two aliquots. One was extended in lactose and egg yolk (LEY) (Protocol A: collagenase and SP present). The other aliquot was centrifuged, and the pellet was resuspended in LEY (Protocol B: collagenase and SP absent). Both samples were maintained at 5°C during 24 hr. Routine and DNA evaluations were carried out in raw and cooled semen. Both cooling protocols maintained sperm viability, membrane function and DNA fragmentation, with Protocol A showing a significantly lowered total and progressive motility (p < .05) and Protocol B showing a significant increase in chromatin decondensation (p < .05). Protocol A avoids centrifugation, reducing processing times and making application in the field simpler. However, as neither protocol showed a significant superiority over the other, studies should be carried out in vivo to evaluate the effect on pregnancy rates of the presence of collagenase and SP in semen samples prior to either cooling or freeze-thawing. Fil: Carretero, Maria Ignacia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Area de Teriogenología; Argentina Fil: Giuliano, S. M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina Fil: Arraztoa, Claudia Cecilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Area de Teriogenología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Santa Cruz, R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Area de Teriogenología; Argentina Fil: Fumuso, Fernanda Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Area de Teriogenología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Neild, Debora Margarita. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Area de Teriogenología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigacion y Tecnología en Reproducción Animal; Argentina

Submitted by Suzane Peres Campanholi null (supc@hotmail.com) on 2016-06-02T21:33:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Suzane - Versão final pro repositório UNESP.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-06T16:46:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 campanholi_sp_me_jabo.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) Made available in DSpace on 2016-06-06T16:46:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 campanholi_sp_me_jabo.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O plasma seminal já foi descrito como benéfico e ao mesmo tempo prejudicial aos espermatozoides e isto está relacionado com o tempo de contato entre eles. A criopreservação do sêmen em touros pode ser prejudicada por exposição contínua dos espermatozoides ao plasma seminal (PS) e a aplicação de métodos para sua remoção pode aumentar a qualidade dos espermatozoides recuperados pós-descongelação, melhorando os resultados de biotécnicas que utilizam sêmen criopreservado. Pelo fato da centrifugação causar muitos danos aos espermatozoides, a filtragem com Sperm Filter® apresenta-se como um novo método de remoção do PS que almeja melhores resultados, porém não foi encontrado relato da sua aplicação em bovinos até o momento. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos métodos de centrifugação e filtragem com Sperm Filter® sobre a criopreservação do sêmen bovino. Para isso, o sêmen de 38 touros Nelore foi colhido por eletroejaculação. Após a colheita, o sêmen foi fracionado em três alíquotas iguais para divisão em três grupos: controle (N), em que o sêmen foi diluído com PS; centrifugação (C), em que o PS foi removido por centrifugação a 600 X g por 10 minutos; e filtragem (F), em que o PS foi removido por filtragem com Sperm Filter®. As amostras foram criopreservadas, e pós-descongelação foram avaliados a cinética espermática, a integridade das membranas plasmática e acrossomal, o potencial mitocondrial, o estresse oxidativo e a capacidade fecundante através da produção in vitro de embriões (PIVE). Com relação à cinética, maiores valores da velocidade do trajeto (P = 0,0005) e velocidade progressiva (P =

Sperm cryopreservation is currently the most suitable technique to store boar sperm samples for a long period of time. However, not all boar ejaculations present the same freezability, this allows the classification of boars and their ejaculations into good (GFE) and poor (PFE) freezability boars/ejaculates. In this context, the present Thesis aims to gain new insights into the evaluation and prediction of sperm freezability, thereby preventing PFE cryopreservation. Through Western blot it was determined whether small heat shock protein 10 (ODF1/HSPB10) and voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2) were reliable freezability markers. Furthermore the sperm and seminal plasma proteome of GFE and PFE were compared through two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), seeking potential markers for boar sperm freezability. The main conclusion of this Dissertation is that VDAC2, ACRBP and TPI in fresh sperm and FN1 in fresh seminal plasma may be used to predict the sperm resilience to withstand cryopreservation procedures, La criopreservació espermàtica és actualment la tècnica més eficient per emmagatzemar les mostres d’esperma de porc durant llargs períodes de temps. Però, no totes les ejaculacions presenten la mateixa congelabilitat, permetent classificar tant els porcs com les seves ejaculacions entre els/les de bona (GFE) i mala (PFE) congelabilitat. Així, aquesta Tesi pretén adquirir noves aproximacions en l’avaluació i predicció de la congelabilitat espermàtica, per evitar la criopreservació de les PFE. Mitjançant Western Blot, es va determinar si dues proteïnes (ODF1/HSPB10 i VDAC2) eren marcadores de congelabilitat. També, el proteoma espermàtic i el del plasma seminal de GFE i PFE va ser comparat mitjançant gels 2D-DIGE, per tal de cercar marcadors potencials de la congelabilitat espermática. Les conclusions són que la VDAC2, la ACRBP i la TPI en l’esperma fresc i la FN1 en el plasma seminal poden ser emprades per predir la resistència de les ejaculacions porcines a la criopreservació

Una estrategia exitosa que se ha abordado a nivel mundial para la conservación recursos zoogenéticos que se encuentran en condiciones desfavorables y con peligro de endogamia, como sucede con la población de asnales en Colombia, consiste en la implementación de programas de criopreservación de semen y el establecimiento de bancos de germoplasma ex situ. Pero los resultados de criopreservación de semen asnal, obtenidos de diferentes protocolos son muy variables, caracterizándose por la existencia dos poblaciones de reproductores cuyos espermatozoides responden de manera diferencial a los procesos de criopreservación, los malos criotolerantes (MC), y los buenos criotolerantes (BC). Lo cual limita el uso de una gran proporción de reproductores para los programas de inseminación artificial (IA) con semen congelado. En el presente trabajo se estableció un criterio de selección de reproductores (MC y BC) con base en la metodología de componentes principales (CP) que incluyó 19 variables espermáticas pos descongelación, se evaluó la diferencia en el estatus oxidativo del semen pre congelación y la composición proteica del plasma seminal entre estas dos poblaciones. De igual manera se evaluó las características cinemáticas, estructurales y funcionales de los espermatozoides entre los MC y BC. Sumado a esto, se investigó el efecto que tienen los antioxidantes vitamina E y quercetina y el sistema de empaque en pajillas de 0.25 ml y 0.5 ml sobre las características espermáticas pos-descongelación, con el propósito de evaluar la respuesta diferencial de estas dos poblaciones a las modificaciones en el protocolo de criopreservación y que luego pueda ser utilizado para la conformación de bancos de germoplasma. Los resultados obtenidos en los diferentes experimentos permitieron establecer que la velocidad progresiva (VSL) pos descongelación, es un parámetro adecuado para hacer la selección de BC y MC, encontrando que todas las variables cinemáticas, estructurales y funcionales pos descongelación fueron significativamente diferentes (p 0,05) entre estos dos grupos, siendo los clasificados como BC los que mejor desempeño mostraron. No se encontró diferencia estadística (p 0,05) para los resultados del estatus oxidativo del eyaculado pre congelación, no obstante los promedios encontrados sugieren que tanto el plasma seminal como los espermatozoides de los reproductores buenos congeladores (BC) tienen una mayor capacidad antioxidante y menor peroxidación lipídica, lo cual se refleja en los mayores valores de porcentaje de inhibición del radical DPPH, en los mayores valores FRAP y en los menores valores de µM de equivalentes MDA. Se identificaron 5 familias de proteínas (KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 y HYOU1) presentes en el plasma seminal. Aunque no se encontraron diferencia estadística significativas para las diferentes concentraciones de los antioxidantes, su adición si mejoró significativamente las características cinemáticas de los reproductores MC, más sin embargo, también pareció afectar negativamente las membranas plasmáticas, lo cual contrasta con lo reportado por otros autores. De igual manera, se logró dilucidar también que el sistema de empaque juega un papel importante en la preservación de las características estructurales y funcionales de los espermatozoides de los reproductores MC sometidos a X Criotolerancia espermática y efecto de los antioxidantes y el sistema de empaque sobre las características espermáticas de semen asnal criopreservado un procedimiento de criopreservación, obteniéndose los mejores resultados con las pajillas de 0.25. No se encontró una relación estadísticamente significativa entre las variables estudiadas y su comportamiento después del proceso de criopreservación, pero la interpretación biológica de los promedios de las variables del estatus oxidativo fueron importantes ya que se logró evidenciar que los reproductores BC tienen un mejor estatus oxidativo que los MC, lo cual respalda la hipótesis de que dichas propiedades pueden proteger los espermatozoides de los daños oxidativos en membranas y en otras organelas, como se evidencia en estos resultados. Se hace necesario darle continuidad al presente proyecto de investigación, vinculando las asociaciones de criadores y profesionales del área, para fortalecer las capacidades en biotecnologías reproductivas, optimizar protocolos de criopreservación seminal y generar redes de colaboración internacional que permitan fortalecer las capacidades nacionales en la conservación de recursos zoogenéticos. Abstract: A successful strategy that has been tackled globally for the conservation of animal genetic resources that are in unfavorable conditions and in danger of inbreeding, is the case with the population of donkey in Colombia, consists in the implementation of semen cryopreservation programs and establishment of ex situ germplasm banks. The results of donkey sperm cryopreservation, obtained from different protocols are very variable, characterized by the existence of two populations of breeders whose spermatozoa respond differently to cryopreservation, bad freezers (BF) and good freezers (GF). This limits the use of a large proportion of breeders for artificial insemination (AI) programs with frozen semen. In the present work, a criterion for the selection of breeders (BF and GF) was established based on the main components methodology (MC), which included 19 sperm variables after thawing, the difference in the oxidative status of pre-freezing semen and the protein composition of the seminal plasma between these two populations. The kinematic, structural and functional spermatozoa characteristics were evaluated in BF and GF populations. In addition, were investigated the effect of vitamin E and quercetin antioxidants and the 0.25 ml and 0.5 ml straws on the post-thawing characteristics, in order to evaluate the differential response of these two populations to the modifications in the protocol of cryopreservation and then later can be used for the conformation of germplasm banks. The results obtained in the different experiments allowed to establish that the progressive velocity (VSL) after thawing, is a suitable parameter to make the selection of GF and BF, finding that all the kinematic variables, structural and functional after thawing were significantly different (p 0.05) was found for the results of the ejaculate pre-freezing oxidative status, however the mean values found suggest that both the seminal plasma and the spermatozoa of GF have a higher antioxidant capacity and lower lipid peroxidation, which Contenido XI is reflected in the higher values of percent inhibition of the DPPH radical, higher FRAP and lower µM MDA equivalents values. Five protein families (KLK1E2, CRISP3, BSP, HSP-1 and HYOU1) present in seminal plasma were identified. Although no statistically significant difference (p 0,05) was found for the different concentrations of antioxidants, its addition did significantly improve the kinematic characteristics of the BF, however, it also appeared to negatively affect plasma membranes, which contrasts with that reported by other authors. Likewise, it was also possible to elucidate that the packaging system plays an important role in the preservation of the structural and functional characteristics of the spermatozoa of the GF submitted to a cryopreservation procedure, obtaining the best results with straws of 0.25. There was no statistically significant relationship between the variables studied and their behavior after the cryopreservation process, but the biological interpretation of the averages of the oxidative status variables were important as it was shown that GF have a better oxidative status than the BF, which supports the hypothesis that such properties can protect sperm from oxidative damage in membranes and other organelles, as evidenced in these results. It is necessary to give continuity to this research project, linking the associations of breeders and professionals in the area, to strengthen capacities in reproductive biotechnologies, optimize seminal cryopreservation protocols and generate international collaboration networks to strengthen national capacities in the conservation of animal genetic resources. Doctorado

Variation in the effect of seminal plasma on sperm function and fertility has been hypothesised to be due to differences between males and their seminal plasma composition. The freezing resilience of individual rams (n = 17) was investigated to characterise inter-male variation. This was determined by measuring the degree of change in motility induced by cryopreservation (Experiment 1). Experiment 2 examined the effect of pooled seminal plasma from rams identified as having high or low resilience to freezing on the cryosurvival of washed spermatozoa from either high (n = 3) or low (n = 3) sperm freezing resilience rams. Immediately after thawing and throughout the incubation period (0–4 h), spermatozoa from high-resilience rams frozen with high-resilience seminal plasma demonstrated superior motility to spermatozoa from high-resilience rams frozen with low-resilience seminal plasma (P

Equine seminal plasma was used in a lactose-EDTA extender for cryopreservation of equine epididymal sperm. Twelve pairs of testicles of slaughtered horses were used. Epididymides were separated and washed applying the retrograde technique to obtain sperm by injecting 10 ml of lactose-EDTA extender through the vas deferens. Samples with more than 30% motility were used. Samples were diluted 1: 1 with the lactose-EDTAextender seminal plasma and filled into 0.5 ml straws at a concentration of 386.3 x 106, frozen in liquid nitrogen and stored for 10 days. The values for fresh and thawed samples were: motility: 43.3 and 16.4% (p, Se utilizó plasma seminal equino en un dilutor de lactosa-EDTA para la criopreservación de espermatozoides epididimarios de equinos. Se trabajó con 12 pares de testículos de caballos beneficiados. Se separaron los epidídimos y se utilizó la técnica de lavado retrógrado para obtener los espermatozoides, inyectando 10 ml del dilutor lactosa-EDTA por el conducto deferente. Se utilizaron las muestras con más de 30% de motilidad progresiva. Las muestras fueron diluidas 1:1 con el diluyente lactosa-EDTA-plasma seminal y se envasó en pajillas de 0.5 ml a una concentración 386.3 x 106, y fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas por 10 días. Los valores obtenidos para las muestras frescas y descongeladas fueron: motilidad progresiva: 43.3 y 16.4% (p

Los avances tecnológicos en la reproducción porcina han ocurrido, en parte, debido a la creciente comprensión de las ventajas de la utilización de verracos con características superiores en programas genéticos. Tecnologías reproductivas como la criopreservación y la separación espermática mediante citometría de flujo, como método para predeterminar el sexo de la progenie, proporcionan una valiosa herramienta para la mejora genética. Sin embargo, estos procedimientos normalmente tienen un impacto perjudicial sobre la calidad espermática, en cierta medida, atribuida a la dilución que se produce durante el procesamiento, y la consiguiente disminución en la concentración del plasma seminal (PS). Por ello, esta Tesis Doctoral propone una serie de experimentos orientados a mejorar el conocimiento sobre la influencia del PS de porcino en la criopreservación espermática, evaluando la influencia de la incubación antes de la congelación de las muestras espermáticas en su propio PS, proveniente bien del eyaculado completo o bien de alguna de sus fracciones/porciones, sobre la calidad y la funcionalidad espermática tras la descongelación y capacidad de separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo, evaluando la relevancia del PS en la variabilidad observada en la eficiencia del proceso de separación y su posterior repercusión en la calidad y funcionalidad de los espermatozoides separados conservados a 15-17 °C. En su conjunto estos estudios demuestran que la incubación de los espermatozoides de porcino en su propio PS influye sobre la capacidad de dichos espermatozoides para soportar la criopreservación y también la separación espermática en poblaciones X e Y mediante citometría flujo. El PS de la fracción post FRE tendría un efecto negativo sobre la congelabilidad espermática, mientras que la incubación de los espermatozoides en presencia de una alta proporción de PS perjudicaría la eficiencia del proceso de separación., Technological advances in pig reproduction have occurred in part because of the growing understanding of the benefits of using boars with superior characteristics in genetic programs. Reproductive technologies such as sperm cryopreservation and sperm sex-sorting by flow cytometry as a method to predetermine the sex of offspring provide a valuable tool for the genetic improvement. However, these methods usually have a detrimental impact on sperm quality, to some extent, attributed to the dilution that occurs during processing, and the resulting decrease in the concentration of seminal plasma (PS). Thus, the present Doctoral Thesis proposes a series of experiments aimed to improve the knowledge of the putative effects of porcine SP on sperm cryopreservation by evaluating the influence of holding time of ejaculate sperm before freezing surrounded in their own SP, from either entire ejaculate or some ejaculate specific fractions/portions, on post-thawing sperm quality and functionality and on sperm sex-sorting procedure; by evaluating the relevance of ejaculate SP on inter- and intra-boar variability in sperm sortability and on capability of sex-sorted sperm to tolerate liquid storage at 15-17 °C, assessed according to sperm quality and functionality. Taken together these experiments show that holding boar sperm in their own SP negatively influences their ability to withstand cryopreservation, particularly the SP from post-SRF, and flow-based sex-sorting procedure.

After a serious injury or sudden death, epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation may present as the last opportunity to obtain genetic material from a valuable stallion. This study evaluated the viability of cooled equine sperm collected by three different methods: sperm of ejaculated (G1), sperm recovered from the epididymal cauda immediately after orchiectomy (G2) and sperm recovered from the epididymal cauda after storage for 24 hours at 5°C (G3). To obtain G1 sperm, two ejaculates were collected. After 1 week, all stallions underwent a bilateral orchiectomy, and one of the removed epididymides was flushed to obtain G2 sperm. The contralateral epididymis was stored at 5°C for 24 hours before being flushed to obtain G3 sperm. The sperm samples were evaluated immediately after the addition of the refrigeration extender, and after 24 and 48 hours of storage at 5°C. After 24 and 48 hours of storage, the epididymal sperm demonstrated higher motility traits when compared to the ejaculated sperm (P

Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-27T11:30:39Z No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-05-27T14:37:58Z : No. of bitstreams: 1 2-s2.0-84883189464.pdf: 403114 bytes, checksum: fc18e5299501abbc1714c79e55e8740a (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-27T11:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-03 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) After a serious injury or sudden death, epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation may present as the last opportunity to obtain genetic material from a valuable stallion. This study evaluated the viability of cooled equine sperm collected by three different methods: sperm of ejaculated (G1), sperm recovered from the epididymal cauda immediately after orchiectomy (G2) and sperm recovered from the epididymal cauda after storage for 24 hours at 5°C (G3). To obtain G1 sperm, two ejaculates were collected. After 1 week, all stallions underwent a bilateral orchiectomy, and one of the removed epididymides was flushed to obtain G2 sperm. The contralateral epididymis was stored at 5°C for 24 hours before being flushed to obtain G3 sperm. The sperm samples were evaluated immediately after the addition of the refrigeration extender, and after 24 and 48 hours of storage at 5°C. After 24 and 48 hours of storage, the epididymal sperm demonstrated higher motility traits when compared to the ejaculated sperm (P

Objetivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la adición de proteínas del plasma seminal sobre el porcentaje de espermatozoides bovinos viables post-descongelación. Materiales y métodos. Los espermatozoides se congelaron usando dos medios (citrato-fructosa-yema y Bioxcell®) y la obtención de proteínas de plasma seminal de bajo peso molecular se realizó por medio de cromatografía líquida de baja presión. Las proteínas de interés eluyeron en las fracciones 21-25 y se sometieron a electroforésis en una y dos dimensiones. Los espermatozoides se incubaron a 37°C durante una hora, con 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg de la fracción 21-25. Se incluyeron dos tratamientos adicionales: uno con proteínas totales del plasma seminal y otro sin proteína. Resultados. La electroforésis bidimensional de las fracciones confirmó la presencia de siete puntos de proteína de bajo peso molecular (14-16 kDa y punto Isoeléctrico de 5.0 - 5.5). La adición de estas proteínas aumentó 20% (p

Made available in DSpace on 2016-07-07T12:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-07T12:46:11Z : No. of bitstreams: 1 ISSN2178-3764-2012-19-02-169-180.pdf: 120527 bytes, checksum: 171460b2528c63b12fc3fc3c72ee4b61 (MD5) Após sua formação no ambiente testicular, o espermatozóide necessita passar por um processo de maturação para que ele seja capaz de fertilizar o oócito. Durante o trânsito epididimário e a ejaculação, as células espermáticas entram em contato com os produtos secretórios das glândulas anexas e passam a adquirir motilidade progressiva, habilidade de reconhecimento e ligação com a zona pelúcida e fusão com a membrana plasmática do oócito. Sabe-se que algumas proteínas aderidas à membrana espermática são semelhantes àquelas existentes no plasma seminal, sugerindo que estas são provenientes da interação dos produtos secretórios das glândulas anexas com as células espermáticas. Deste modo, a determinação dos componentes do plasma seminal poderia ser considerada uma forma de avaliação do ejaculado. Estudos indicam que o plasma seminal exerce várias funções sobre o metabolismo espermático e o processo de fecundação como a ativação da motilidade espermática, ação antimicrobiana, neutralização dos metabólitos espermáticos, proteção contra a acrosina por meio de inibidores de proteases, entre outros. Além disso, é mediador da capacitação espermática e da resposta inflamatória pós-coital no útero de éguas. Portanto, o estudo do perfil bioquímico e proteico do plasma seminal permite o isolamento e caracterização de substâncias correlacionadas positivamente com a criopreservação e a fertilidade do sêmen de garanhões, possibilitando o aprimoramento das técnicas de armazenamento de espermatozóides equinos e a identificação precoce de animais férteis em relação àqueles subférteis. After its formation in the testicular environment, sperm needs to go through a maturation process for enabling it to fertilize the oocyte. During epididymal transit and ejaculation, sperm cells come into contact with secretory products of the accessory glands and acquire progressive motility, ability to recognize and bind zona pellucida, and fusion with the plasma membrane of the oocyte. It is known that some proteins attached to the sperm membrane are similar to those present in seminal plasma, suggesting that these are from the interaction of secretory products of the accessory glands with spermatozoa. Thus, the determination of seminal plasma components could be considered a form of ejaculate evaluation. Studies indicate that seminal plasma plays several roles on metabolism and sperm fertilization process such as activation of sperm motility, antimicrobial activity, neutralization of sperm metabolites, protection against acrosin by protease inhibitors, among others. Furthermore, it mediates sperm capacitation and post-coital inflammatory response in the uterus of mares. Therefore, the study of biochemical and protein profile of seminal plasma allows the isolation and characterization of components positively related to cryopreservation and fertility of stallion semen, enabling improvements in the storage techniques and early identification of fertile and subfertile animals. Después de su formación en el ambiente testicular, el espermatozoide necesita pasar por un proceso de maduración antes de ser capaz de fertilizar al ovocito. Durante el trayecto epididimario y la eyaculación, las células espermáticas entran en contacto con los productos de secreción de las glándulas anexas y comienzan a adquirir motilidad progresiva, capacidad de reconocimiento y unión con la zona pelúcida así como de fusión con la membrana plasmática del ovocito. Se sabe que algunas proteínas unidas a la membrana espermática son similares a aquellas existentes en el plasma seminal, lo que sugiere que estas son procedentes de la interacción de los productos secretorios de las glándulas anexas con las células espermáticas. De este modo, la determinación de los componentes del plasma seminal podría ser considerada una forma de evaluación del semen. Los estudios indican que el plasma seminal desempeña varias funciones en el metabolismo espermático y el proceso de fertilización, entre las que se incluyen: activación de la motilidad, actividad antimicrobiana, neutralización de los metabolitos de los espermatozoides y protección contra acrosina por inhibidores de la proteasa. Además, interviene en la capacitación espermática y respuesta inflamatoria post-coital en el útero de las yeguas. Por lo tanto, el estudio del perfil bioquímico y de las proteínas del plasma seminal permite el aislamiento y caracterización de substancias correlacionadas positivamente con la criopreservación y la fertilidad del semen de caballo, lo que permite mejorar las técnicas de almacenamiento y la identificación precoz de animales fértiles en relación con los sub-fértiles. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Botucatu, SP, Brasil Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Botucatu, SP, Brasil

y se pueden usar para revertir los efectos de la criopreservación en semen bovino. El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de adicionar proteínas del plasma seminal en la viabilidad espermática postdescongelación de semen de toros Sanmartinero y Cebú. Se obtuvo plasma seminal de 10 toros de cada raza y se determinaron los perfiles electroforéticos bidimensionales para establecer la relación entre la cantidad relativa de cada punto de proteína y los porcentajes de viabilidad espermática. Identificados los puntos que presentaron correlación con la viabilidad, se separó el plasma seminal en fracciones mediante cromatografiá de exclusión y aquellas que contenían las proteínas de interés se adicionaron a 1x106 descongelados e incubados a 37°C durante una hora. En plasma de Sanmartinero se detectó un punto de peso molecular 16.20 kDa y punto Isoeléctrico 5.5, que evidenció correlación con la viabilidad espermática (r=0.64 p0.001). Se uso la fracción cromatográfica 20-25, que contenía éste punto. La electroforesis bidimensional de la fracción 20-25, evidenció siete puntos (pesos moleculares de 14-16 kDa y puntos Isoeléctricos de 5.0 - 5.5). La incubación con esta fracción, demostró que el porcentaje de espermatozoides viables de toros Sanmartinero aumenta 20% (p0,05) con dosis de 1 y 1.5 mg/106 espermatozoides, congelados en medio citrato-fructosa y 25% (p0,05) con dosis de 0.5 mg/106 espermatozoides congelados en medio Bioxcell. Los resultados permiten sugerir el uso de proteínas del plasma seminal para disminuir el daño en los espermatozoides por la criopreservación. / Abstract. Some seminal plasma proteins are related to sperm viability and may be used to reverse the effects of cryopreservation on bull semen. The objective of this research was to determine the effect of add seminal plasma proteins in post-thaw sperm viability of Sanmartinero and Cebu bulls. Seminal plasma was obtained from 10 bulls of each breed and two-dimensional electrophoresis profiles. Seminal plasma was separated into fractions by size exclusion chromatography, and those containing the proteins of interest were added to 1x106 thawed and incubated at 37 ° C for one hour. In Sanmartinero plasma was detected one point (16.20 kDa molecular weight and isoelectric point 5.5), which correlated with the sperm viability (r = 0.64 p 0.001). 20-25 chromatographic fraction was used, which contained this point. Dimensional electrophoresis of fraction 20-25, show seven points (14-16 kDa molecular weight and isoelectric points of 5.0 - 5.5). The incubation with this fraction showed that the percentage of viable sperm from bulls Sanmartinero increases 20% (p 0.05) at doses between 1 and 1.5 mg/106 sperm frozen in citrate-fructose medium and 25% (p 0 , 05) with 0.5 mg/106 Bioxcell medium. Results suggest the use of seminal plasma proteins to reduce the sperm cryopreservation damage. Maestría

Un lot de 40 mâles d'une souche de truite arc-en-ciel (Salmo gairdneri) à reproduction printanière a été suivi. Seuls les spermes d'un volume supérieur ou égal à 6 ml ont été caractérisés et congelés en boulettes. L'analyse factorielle des correspondances entre les caractéristiques et la fécondance du sperme après 5 à 9 mois de congélation a montré en particulier que l'aptitude à la cryoconservation peut être caractérisée par l'analyse du plasma séminal : les spermes médiocres sont associés à une osmolarité plasmatique élevée (260 m-osmoles) et/ou une teneur élevée en protéine 42 KD, l'un des constituants majeur de la membrane des spermatozoïdes; les très bons spermes sont associés à l'absence de protéine 42 KD dans le liquide séminal. Ces résultats renforcent l'idée que l'aptitude à la cryoconservation du sperme de truite dépend en premier lieu de la qualité de la membrane des spermatozoïdes., Milt was obtained from 40 males of a spring-spawning strain of rainbow trout (Salmo gairdneri). Only semen with a volume greater or equal to 6 ml were characterized and frozen in pellets. Factorial analysis of correspondences between the physico-chemical characteristics and the fertility of sperm after 5 to 9 months freezing revealed that the fitness for cryopreservation can be particularly characterized by the composition of the seminal plasma: sperm with the lowest capacity to fertilize were associated with a plasma osmolality greater than 260 m-Osm and/or a high level of 42 KD protein, one of the major components of the spermatozoan membrane; sperm with the highest fertilizing ability lacked 42 KD protein in the seminal plasma. These results support the idea that the fitness for cryopreservation of trout sperm primarily depends on the condition of the spermatozoan membrane.