Search

Die akute therapeutische Hypothermie (HT) ist die einzige klinisch etablierte therapeutische Intervention gegen die neonatale hypoxisch-ischämische Enzephalopathie (HIE), jedoch ist ihr protektiver Effekt gegenüber neuronaler Schädigung limitiert. Regenerative Therapien, wie die Behandlung mit mesenchymalen Stromazellen (MSZ), stellen eine vielversprechende adjuvante Therapieform dar. Stabile experimentelle Modelle der HIE und HT sind für die Etablierung neuroprotektiver Strategien unverzichtbar. Trotz klinischer und experimenteller Indikationen für eine endogene thermoregulatorische Reaktion auf die HIE, haben die potentiellen Effekte auf die Hypoxie-Ischämie (HI)-induzierte Hirnschädigung in vorklinischen Studien bisher weitestgehend keine Beachtung gefunden. In der vorliegenden Studie wurde daher ein klinisch relevantes Modell der HIE und HT etabliert, das die Testung adjuvanter therapeutischer Strategien ermöglicht. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Modellierung der HIE in neonatalen Mäusen mit einer signifikanten endogenen Herunterregulierung der Körpertemperatur von 2°C assoziiert ist. Diese endogene Hypothermie war mit einer signifikanten Neuroprotektion assoziiert, die sich in einer verminderten neuropathologischen Schädigung, einem verminderten neuronalen Zellverlust und einer reduzierten Abnahme axonaler/neuronaler und Myelin-assoziierter Strukturproteine äußerte. Für die Evaluierung der Effekte einer therapeutischen HT wurde im zweiten Teil der Arbeit das HIE-Modell ausgewählt, bei dem die Nest-Körpertemperatur während der Hypoxie beibehalten wird, da dies die klinische Situation bestmöglich widerspiegelt. Verglichen wurden zwei milde HT-Protokolle (Differenz der Rektaltemperatur betrug 3°C für 4 Stunden), die sich im Zeitpunkt der Therapieeinleitung unterschieden: entweder unmittelbar nach der HI oder mit einer Verzögerung von 2 Stunden. Die direkt nach HI eingeleitete Therapie ergab bezüglich ihres protektiven Effekts auf die kurz- und langfristige histologische Gewebeschädigung und assoziierte Verhaltensdefizite leichte Vorteile gegenüber dem verzögerten Therapiebeginn. Die neuroprotektiven Therapieeffekte waren ähnlich, bzw. geringer ausgeprägt, verglichen mit der Wirkung der HI-induzierten endogenen Kühlung. Zudem wurden die HI-induzierten Verhaltensdefizite durch HT nur teilweise verbessert, indem eine signifikante Verbesserung motorischer Defizite erzielt wurde, kognitive Defizite hingegen unverändert blieben. Diese experimentell ermittelten Therapieeffekte sind im Einklang mit klinischen Beobachtungen, die eine signifikante aber unvollständige Protektion vor zerebraler Schädigung sowie einer limitierten Wirksamkeit auf kognitive Defizite indizieren. Vor diesem Hintergrund wurde dieses Modell der HIE und HT als geeignetes Modell zur Evaluierung von Kombinationstherapien ausgewählt. In Anbetracht der regenerativen Wirkung von MSZ, wurde in der vorliegenden Arbeit die Hypothese überprüft, dass eine kombinierte Behandlung mit einer akuten therapeutischen HT und einer verzögerten MSZ-Therapie in einer verbesserten Protektion vor zerebraler Schädigung und langfristigen Verhaltensdefiziten resultiert. Daher wurde im dritten Teil der vorliegenden Studie der Effekt der Einzeltherapien mit der Kombinationstherapie verglichen. Die alleinige HT-Behandlung führte zur Protektion neuronaler Strukturen und verbesserte signifikant die motorischen Defizite, während die Myelinschädigung und kognitive Defizite durch die MSZ-Einzeltherapie, nicht jedoch durch eine HT, verbessert wurden. Die kombinierte Anwendung beider Therapien führte hingegen zu einer Abmilderung oder Aufhebung dieser protektiven Einzeltherapieeffekte, was sich in einer verschlechterten zerebralen Schädigung und stärkeren langfristigen motor-kognitiven Defiziten im Vergleich zu den jeweiligen Einzeltherapien äußerte. Entgegen unserer Hypothese zeigen diese Ergebnisse die Möglichkeit eines nachteiligen Interaktionseffekts des kombinierten Therapieprotokolls auf. Da jede Einzeltherapie für sich jedoch vielversprechende Effekte aufweist, sollten weitere Studien die schädliche Wirkung der Kombinationstherapie untersuchen und mögliche Strategien entwickelt werden, die dieser negativen Interaktion entgegen wirken können. Das in der vorliegenden Studie entwickelte Modell der HIE, therapeutischen HT und MSZ-Applikation bietet hierfür eine geeignete und zuverlässige experimentelle Grundlage. Abstract Acute hypothermia treatment (HT) is the only clinically established intervention against neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE). However, 40-50% of cooled infants still suffer from major neurological problems. Regenerative therapies, such as mesenchymal stromal cells (MSC) appear promising as adjuvant therapy. In order to develop new therapeutic strategies, stable experimental models of HIE and HT are required. Despite clinical and experimental indications for an endogenous thermoregulatory response to HIE, the potential effects on HIE-induced brain injury have largely been neglected in pre-clinical studies. In the present study we established a clinical relevant model of HIE and HT which is suitable for testing adjuvant therapeutic strategies. Here, we demonstrated that HIE modeling in neonatal mice is associated with a significant endogenous drop in body core temperature by 2°C resulting in profound neuroprotection, revealed by reduced neuropathological injury scores, reduced loss of neurons, axonal structures and myelin. In the second part of this study, using the model which mimics the clinical situation most closely, i.e. through maintenance of the nesting body temperature during hypoxia, we compared two mild therapeutic HT protocols (rectal temperature difference 3°C for 4 hours), initiated either immediately after insult or with a delay of 2 hours. Immediately applied post-hypoxic HT revealed slight advantages over a delayed onset of therapy on short- and long-term histological outcome and behavioural deficits demonstrated by reduced neuropathological injury scores and preservation of hippocampal structures. However, depending on the brain region analyzed, neuroprotective effects were similar or even reduced compared to endogenous cooling during HIE modelling. Moreover, long-term neurobehavioural outcome was only partly improved for motoric function while cognitive deficits remained unchanged. As these pre-clinical results closely resemble the clinical situation, i.e. significant but incomplete protection from brain injury and no amelioration of cognitive deficits, we chose this model of HIE and HT for the evaluation of a combined treatment with MSC According to the regenerative capacity of MSCs, we hypothesized that acute HT combined with delayed MSC therapy results in augmented protection from brain injury and behavioural deficits. Therefore, in the third part of this study, we compared the effect of either single therapy with the combined treatment. HT single therapy protected neuronal structures and significantly improved motor deficits, while myelination and cognitive function could only be restored by MSC but not by HT. However, compared to each single therapy, combined treatment led to exacerbated brain injury and increased long-lasting motor-cognitive deficits. Against our hypothesis, these results suggest the possibility of a detrimental interaction of the combined therapy protocol. However, regarding the promising effects of each single therapy, further studies on the underlying reasons of the detrimental effect and possible strategies to overcome this negative interaction are urgently needed. According to this, the herein developed mouse model of HIE, therapeutic HT and MSC-application will be a suitable and reliable tool., Acute hypothermia treatment (HT) is the only clinically established intervention against neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE). However, 40-50% of cooled infants still suffer from major neurological problems. Regenerative therapies, such as mesenchymal stromal cells (MSC) appear promising as adjuvant therapy. In order to develop new therapeutic strategies, stable experimental models of HIE and HT are required. Despite clinical and experimental indications for an endogenous thermoregulatory response to HIE, the potential effects on HIE-induced brain injury have largely been neglected in pre-clinical studies. In the present study we established a clinical relevant model of HIE and HT which is suitable for testing adjuvant therapeutic strategies. Here, we demonstrated that HIE modeling in neonatal mice is associated with a significant endogenous drop in body core temperature by 2°C resulting in profound neuroprotection, revealed by reduced neuropathological injury scores, reduced loss of neurons, axonal structures and myelin. In the second part of this study, using the model which mimics the clinical situation most closely, i.e. through maintenance of the nesting body temperature during hypoxia, we compared two mild therapeutic HT protocols (rectal temperature difference 3°C for 4 hours), initiated either immediately after insult or with a delay of 2 hours. Immediately applied post- hypoxic HT revealed slight advantages over a delayed onset of therapy on short- and long- term histological outcome and behavioural deficits demonstrated by reduced neuropathological injury scores and preservation of hippocampal structures. However, depending on the brain region analyzed, neuroprotective effects were similar or even reduced compared to endogenous cooling during HIE modelling. Moreover, long-term neurobehavioural outcome was only partly improved for motoric function while cognitive deficits remained unchanged. As these pre-clinical results closely resemble the clinical situation, i.e. significant but incomplete protection from brain injury and no amelioration of cognitive deficits, we chose this model of HIE and HT for the evaluation of a combined treatment with MSC According to the regenerative capacity of MSCs, we hypothesized that acute HT combined with delayed MSC therapy results in augmented protection from brain injury and behavioural deficits. Therefore, in the third part of this study, we compared the effect of either single therapy with the combined treatment. HT single therapy protected neuronal structures and significantly improved motor deficits, while myelination and cognitive function could only be restored by MSC but not by HT. However, compared to each single therapy, combined treatment led to exacerbated brain injury and increased long-lasting motor-cognitive deficits. Against our hypothesis, these results suggest the possibility of a detrimental interaction of the combined therapy protocol. However, regarding the promising effects of each single therapy, further studies on the underlying reasons of the detrimental effect and possible strategies to overcome this negative interaction are urgently needed. According to this, the herein developed mouse model of HIE, therapeutic HT and MSC-application will be a suitable and reliable tool.

In industralisierten Ländern werden 5.5-11.4% der Kinder zu früh geboren (Geburten zwischen der 23-37 Schwangerschaftswoche). Trotz der großen Vorteile in der Geburtshilfe und der Neonatalversorgung, zeigen Frühgeborene ein erhöhtes Risiko langfristig neurologische Defizite zu entwickeln. Das unreife Gehirn ist sehr vulnerabel gegenüber verschiedenen Noxen wie der Hypoxie oder Hyperoxie. In Experimentellen Studien wurde bereits gezeigt, dass eine neonatale Hyperoxie eine Schädigung der weißen Substanz verursacht, die mit einer Degeneration der Oligodendrozyten und Hypomyelinisierung assoziiert ist. Diese korrelieren mit ultrastrukturellen Veränderungen der weißen Substanz. Obwohl das Wissen über die Pathophysiologie der perinatalen Hirnschädigung zunimmt, gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Daher untersuchten wir das therapeutische Potential des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor Agonisten Fingolimod, welches sich für die Behandlung der demyeliniserenden Erkrankung multiple Sklerose bereits bewährt, in dem Modell der Hyperoxie-induzierten Hirnschädigung in vivo und in vitro. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine einmalige Behandlung mit FTY720 die Hyperoxie-induzierte Hypomyeliniserung sowie langfristige Veränderungen der Mikrostruktur der weißen Substanz verbessert. Außerdem wurden kognitive Dysfunktionen im Erwachsenenalter, die aus einer neonatale Hyperoxie resultieren, durch eine FTY720 Gabe reduziert. Analysen der zugrunde liegenden Mechanismen ergaben, dass eine neonatale Hyperoxie zu einer erhöhten Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL-1β, sowie zu einer Aktivierung von Iba1 markierten Mikroglia führt, welche durch eine einmalige Injektion von FTY720 auf Normalniveau minimiert wurden. Zudem wurde die Hyperoxie-induzierte erhöhte Expression der oxidativen Stressparameter durch die FTY720 Behandlung verbessert. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die protektive Wirkung von FTY720 in Richtung Myelinisierung und langfristigem Verhalten auf seine anti-inflammatorische und anti-oxidative Wirkung zurückgeführt werden kann. Weitere in vitro Analysen mit einem selektiven S1P1-Rezeptor Antagonisten zeigten, dass die protektive Wirkung von FTY720 durch eine direkte Interaktion mit Oligodendrozyten reguliert wird. Auf Grund dieser Ergebnisse, scheint FTY720 ein vielversprechender Kandidat für die Behandlung von Frühgeboren zu sein, die ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Schädigung der weißen Substanz zeigen., 5.5-11.4% of all live births in industrialised countries are preterm born infants (born between gestational ages of 23-37 week). Despite major advances in obstetrics and neonatal intensive care, preterm born infants are at high risk to develop neurological deficits in later life. The immature brain is very susceptible to injury caused by different environmental factors such as hypoxia or hyperoxia. Experimental studies demonstrated that neonatal hyperoxia induces white matter injury, which is associated with oligodendroglial cell death, hypomyelination and with ultrastructural changes of the developing white matter. Despite increasing knowledge about the pathophysiology of perinatal brain injury, up to now there is no effective therapy. Therefore, we investigated the therapeutic potential of the sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist FTY720, which is already approved for the treatment of the demyelinating disease multiple sclerosis, in a model of hyperoxia-induced brain injury in vivo and in vitro. Herein we demonstrated that a single dose of FTY720 improved hyperoxia-induced hypomyelination and long-term microstructural alterations in the white matter. Furthermore, neonatal hyperoxia resulted in long-lasting impairment of cognitive function in adulthood, which was reduced by FTY720 treatment. Analysis of underlying mechanisms revealed that neonatal hyperoxia caused an increased release of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-1β, and induced an increased activation of Iba1-labeled microglia, which were normalized by FTY720 administration. Moreover, hyperoxia-induced upregulation of oxidative stress parameters was ameliorated by FTY720 treatment. These results suggest that FTY720´s protective effects in terms of myelination and long-term functional improvement may be attributed to its anti-inflammatory and anti-oxidative effects. Further in vitro analysis with a selective S1P1-receptor antagonist demonstrated that FTY720 also mediates its protective effect through a direct interaction with the S1P1 receptor on oligodendrocytes. With these findings, FTY720 has been identified as a promising candidate for treating preterm babies with an increased risk for the development of white matter injury.