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In dieser Dissertation modellieren und analysieren wir scRNA-Seq-Daten, um Mechanismen, die biologischen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen In scRNA-Seq-Experimenten wird biologisches Rauschen mit technischem Rauschen vermischt. Mittels eines vereinfachten scRNA-Seq-Modells leiten wir eine analytische Verteilungsfunktion für die beobachtete Verteilung unter Kenntnis einer Ausgangsverteilung her. Charakteristiken und sogar ein allgemeines Moment der Ausgangsverteilung können aus der beobachteten Verteilung berechnet werden. Unsere Formeln stellen den Ausgangspunkt zur Quantifizierung von Zellvariabilität dar. Wir haben eine vollständig lineare Analyse von Transkriptomdaten entwickelt, die zeigt, dass sich Zellen während des Zellzyklus auf einer ebenen zirkulären Trajektorie im Transkriptomraum bewegen. In immortalisierten Zelllinien stellen wir fest, dass die Transkriptomdynamiken des Zellzyklus hauptsächlich unabhängig von den Dynamiken anderer Zellprozesse stattfinden. Unser Algorithmus (“Revelio”) bringt eine einfache Methode mit sich, um unsynchronisierte Zellen nach der Zeit zu ordnen und ermöglicht das exakte Entfernen von Zellzykluseffekten. Die Form der Zellzyklus-Trajektorie zeigt, dass der Zellzyklus sich dazu entwickelt hat, Änderungen der transkriptionellen Aktivitäten und der damit verbundenen regulativen Anstrengungen zu minimieren. Dieses Konstruktionsprinzip könnte auch für andere Prozesse relevant sein. Durch die Verwendung von metabolischer Molekülmarkierung erweitern wir Modelle zur mRNA-Kinetik, um dynamische mRNA-Ratenparameter für Transkription, Splicing und Degradation zu erhalten und die Lösungen auf den Zellzyklus anzuwenden. Wir zeigen, dass unser Modell zwischen Genen mit ähnlicher Genexpression aber unterschiedlicher Genregulation unterscheiden kann. Zwar enthalten scRNA-Seq-Daten aktuell noch zu viel technisches Rauschen, unser Modell wird jedoch für das zukünftige Errechnen von dynamischen mRNA-Ratenparametern von großem Nutzen sein., In this dissertation, we model and analyse scRNA-seq data to understand mechanisms underlying biological processes. In scRNA-seq experiments, biological noise gets convoluted with various sources of technical noise. With the help of a simplified scRNA-seq model, we derive an analytical probability distribution function for the observed output distribution given a true input distribution. We find that characteristics and even general moments of the input distribution can be calculated from the output distribution. Our formulas are a starting point for the quantification of cell-to-cell variability. We developed a fully linear analysis of transcriptome data which reveals that cells move along a planar circular trajectory in transcriptome space during the cell cycle. Additionally, we find in immortalized cell lines that cell cycle transcriptome dynamics occur largely independently from other cellular processes. Our algorithm (“Revelio”) offers a simple method to order unsynchronized cells in time and enables the precise removal of cell cycle effects from the data. The shape of the cell cycle trajectory indicates that the cell cycle has evolved to minimize changes of transcriptional activity and their related regulatory efforts. This design principle may be of relevance to other cellular processes. By considering metabolic labelling, we extend existing mRNA kinetic models to obtain dynamic mRNA rate parameters for transcription, splicing and degradation and apply our solutions to the cell cycle. We can distinguish genes with similar expression values but different gene regulation strategies. While current scRNA-seq data contains too much technical noise, the model will be of great value for inferring dynamic mRNA rate parameters in future research.

Hochdurchsatzverfahren quantifizieren eine Vielzahl zellulärer Komponenten, können aber selten deren Interaktionen beschreiben. Daher wurden in den letzten 20 Jahren verschiedenste Netzwerk-Rekonstruktionsmethoden entwickelt. Insbesondere Perturbationsdaten erlauben dabei Rückschlüsse über funktionelle Mechanismen in der Genregulierung, Signal Transduktion, intra-zellulärer Kommunikation und anderen Prozessen zu ziehen. Dennoch bleibt Netzwerkinferenz ein ungelöstes Problem, weil die meisten Methoden auf ungeeigneten Annahmen basieren und die Identifizierbarkeit von Netzwerkkanten nicht aufklären. Diesbezüglich beschreibt diese Dissertation eine neue Rekonstruktionsmethode, die auf einfachen Annahmen von Perturbationsausbreitung basiert. Damit ist sie in verschiedensten Zusammenhängen anwendbar und übertrifft andere Methoden in Standard-Benchmarks. Für MAPK und PI3K Signalwege in einer Adenokarzinom-Zellline generiert sie plausible Netzwerkhypothesen, die unterschiedliche Sensitivitäten von PI3K-Mutanten gegenüber verschiedener Inhibitoren überzeugend erklären. Weiterhin wird gezeigt, dass sich Netzwerk-Identifizierbarkeit durch ein intuitives Max-Flow Problem beschreiben lässt. Dieses analytische Resultat erlaubt effektive, identifizierbare Netzwerke zu ermitteln und das experimentelle Design aufwändiger Perturbationsexperimente zu optimieren. Umfangreiche Tests zeigen, dass der Ansatz im Vergleich zu zufällig generierten Perturbationssequenzen die Anzahl der für volle Identifizierbarkeit notwendigen Perturbationen auf unter ein Drittel senkt. Schließlich beschreibt die Dissertation eine mathematische Weiterentwicklung der Modular Response Analysis. Es wird gezeigt, dass sich das Problem als analytisch lösbare orthogonale Regression approximieren lässt. Dies erlaubt eine drastische Reduzierung des nummerischen Aufwands, womit sich deutlich größere Netzwerke rekonstruieren und neueste Hochdurchsatz-Perturbationsdaten auswerten lassen. 'Omics' technologies provide extensive quantifications of components of biological systems but rarely characterize the interactions between them. To fill this gap, various network reconstruction methods have been developed over the past twenty years. Using perturbation data, these methods can deduce functional mechanisms in gene regulation, signal transduction, intra-cellular communication and many other cellular processes. Nevertheless, this reverse engineering problem remains essentially unsolved because inferred networks are often based on inapt assumptions, lack interpretability as well as a rigorous description of identifiability. To overcome these shortcoming, this thesis first presents a novel inference method which is based on a simple response logic. The underlying assumptions are so mild that the approach is suitable for a wide range of applications while also outperforming existing methods in standard benchmark data sets. For MAPK and PI3K signalling pathways in an adenocarcinoma cell line, it derived plausible network hypotheses, which explain distinct sensitivities of PI3K mutants to targeted inhibitors. Second, an intuitive maximum-flow problem is shown to describe identifiability of network interactions. This analytical result allows to devise identifiable effective network models in underdetermined settings and to optimize the design of costly perturbation experiments. Benchmarked on a database of human pathways, full network identifiability is obtained with less than a third of the perturbations that are needed in random experimental designs. Finally, the thesis presents mathematical advances within Modular Response Analysis (MRA), which is a popular framework to quantify network interaction strengths. It is shown that MRA can be approximated as an analytically solvable total least squares problem. This insight drastically reduces computational complexity, which allows to model much bigger networks and to handle novel large-scale perturbation data.

ERK1/2 are known key players in the pathophysiology of heart failure, but the members of the ERK cascade, in particular Raf1, can also protect the heart from cell death and ischemic injury. An additional autophosphorylation (ERK1 at Thr208, ERK2 at Thr188) empowers ERK1/2 translocation to the nucleus and phosphorylation of nuclear targets which take part in the development of cardiac hypertrophy. Thereby, targeting this additional phosphorylation is a promising pharmacological approach. In this thesis, an in silico model of ERK cascade in the cardiomyocyte is introduced. The model is a semi-quantitive model and its behavior was tested with different softwares (SQUAD and CellNetAnalyzer). Different phosphorylation states of ERK1/2 as well as different stimuli can be reproduced. The different types of stimuli include hypertrophic as well as non-hypertrophic stimuli. With the introduced in-silico model time courses and synergistic as well as antagonistic receptor stimuli combinations can be predicted. The simulated time courses were experimentally validated. SQUAD was mainly used to make predictions about time courses and thresholds, whereas CNA was used to analyze steady states and feedback loops. Furthermore, new targets of ERK1/2 which partially contribute, also in the formation of cardiac hypertrophy, were identified and the most promising of them were illuminated. Important further targets are Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 and SPIN90. Cardiomyocyte gene expression data sets were analyzed to verify involved components and to find further significantly altered genes after induced hypertrophy with TAC (transverse aortic constriction). Changes in the ultrastructure of the cardiomyocyte are the final result of induced hypertrophy., ERK1/2 sind bekannte Schlüsselfiguren bei der Entstehung der Herzinsuffizienz. Weitere Komponenten der ERK-Kaskade, insbesondere Raf1, können das Herz jedoch vor Zelltod und ischämischem Schaden schützen. Eine zusätzliche Autophosphorylierung von ERK1 an Thr208 bzw. von ERK2 an Thr188 ermöglicht ERK1/2 die Translokation zum Zellkern und befähigt ERK dort zur Phosphorylierung von nukleosolischen Zielproteinen, welche eine Herzmuskelhypertrophie auslösen. Daher erscheint diese zusätzliche Autophosphorylierung als eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur. In dieser Arbeit wird ein in-silico Modell der ERK-Kaskade im Kardiomyozyten präsentiert. Das Modell ist ein semi-quantitatives Modell und wurde mit den Programmen SQUAD und CellNetAnalyzer getestet. Verschiedene Phosphorylierungs-Zustände von ERK1/2 als auch verschiedene Stimuli (hypertrophe als auch nicht-hypertrophe) können mit dem Modell reproduziert werden. Mit dem präsentierten in-silico Modell können sowohl zeitliche Abläufe als auch synergistische und antagonistische Effekte vorhergesagt werden. Die simulierten zeitlichen Abläufe wurden durch in-vitro Experimente validiert. SQUAD wurde hauptsächlich für die Modellierung von zeitlichen Abläufen und Schwellenwerte genutzt, wohingegen CellNetAnalyzer vor allen Dingen zur Analyse von Fließgleichgewichten und Rückkopplungs-Mechanismen genutzt wurde. Darüberhinaus wurden Zielstrukturen von ERK1/2, welche zusätzlich an der Entstehung der Herzhypertrophie mitwirken, identifiziert. Diese umfassen unter anderem Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 und SPIN90. Gen-Expressions-Datensätze von Kardiomyozyten nach TAC (transverse aortic constriction) wurden analysiert. Diese wurden mit den im Model vorhandenen Strukturen verglichen und signifikant veränderte Expressionslevel wurden identifiziert. Veränderungen der Ultrastruktur des Kardiomyozyten sind das Ergebnis der induzierten Hypertrophie.

Given the complex nature of biological systems and organisms, the examination of single protein interactions is not enough to understand ageing, the development of diseases or cancer. For this reason, this thesis aimed to explore new relationships between signalling pathways. This was achieved by studying various signalling pathways with Boolean network models. First, the crosstalk of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and Wingless (Wnt), as well as the signalling pathway of nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B-cells (NF- B) were investigated by a literature-based and a data-driven approach. Despite huge differences in the model setups, similar conclusions were drawn from model simulations. Although the process of ageing could only be simulated by crosstalk of IGF-1 and Wnt, it could be shown that Wnt signalling dominates IGF-1 by impairing feedback. Thereby, proteins maintain their activity state. Likewise, proteins that were constantly inactive could be found in the reconstructed NF- B networks of young and aged phenotype. Network analyses further indicated a loss of redundant protein interactions accompanied by an escalation in error susceptibility with age. These alterations in activity and accumulation of damage can, in turn, be attributed to the development of ageing-associated diseases. In particular, activation of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) could be identified in the IGF-1/Wnt model, which can be associated with the development of diabetes mellitus type II and the inhibition of autophagy. Likewise, constantly inactive components in the NF- B model seem to be involved in a decreased inflammatory response and reduced angiogenesis. The next step in this work was to investigate the role of cofilin-1 (CFL1) in pancreatic cancer. Previously it was already known that CFL1 is highly expressed in pancreatic cancer and correlates with high invasiveness and poor prognosis. However, pathways that contribute to fast cancer progression were still unknown. Based on a Boolean network model newly established in this thesis, it was possible to predict them. Model simulations indicated that Kirsten rat sarcoma (KRAS) induces an imbalance in actin remodelling leading to overexpression and activation of CFL1. Due to the imbalance in actin remodelling, it seems that the expression of the transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) can no longer be suppressed by protein kinase D1 (PRKD1) which leads to an increased expression of TCF7L2 itself and subsequently induces the expression of CFL1. In addition, the activator of CFL1, slingshot (SSH1L), seems to be increasingly expressed by an increased AURKA expression. Thus, CFL1 would not only be present in increased quantities but can also be activated. These model-based assumptions that both AURKA and TCF7L2 are overexpressed in pancreatic cancer patients could be confirmed by gene expression data from pancreatic cancer tissues. Besides the signalling pathway leading to the overexpression and activation of CFL1, the model could also provide an explanation for the involvement of CFL1 in proliferation control and apoptosis inhibition. Here, model simulations suggested that CFL1 regulates cell cycle components based on its impact on the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). This assumption could be supported by western blots showing reduced protein levels of STAT3. Moreover, STAT3 also seems to be involved in the abrogation of apoptosis in pancreatic cancer cells by inducing the expression of anti-apoptotic proteins. In addition, to reveal the role of CFL1 in pancreatic cancer, the newly established model was used to suggest new therapeutic targets for pancreatic cancer patients with high CFL1 expression. Here, the most promising identified intervention target was CD44 antigen whose in silico inhibition blocked the proliferative phenotype and induced apoptosis. The last part of this thesis dealt with the identification of dynamic-influencing nodes, called implicants. Here, a new algorithm was established that is able to identify these implicants in a feasible time frame. By studying 35 publically available, biologically motivated Boolean network models, it could be shown that a small set of nodes is sufficient to determine the dynamics of a complete system. Although highly connected components (hubs) are frequently considered to be master regulators of biological processes, the majority of implicants were not static hubs. Furthermore, it could be shown that targeting these implicants reduces the risk for side effects in comparison to targeting static hubs. The superiority of dynamic influencing-targets versus static hubs was confirmed by experimental validation of a newly established Boolean network model depicting the crosstalk of Wnt and mitogen activating protein kinase (MAPK) in colorectal cancer. Based on this model dynamic determining proteins were identified. The two most promising targets, extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) and cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A) were treated with specific inhibitors. Thereby, it was shown that their inhibition reduced the proliferative and invasive potential of colorectal cancer cells.

Darmkrebszellen und T-Zellen regulieren ihren zentralen Kohlenstoffmetabolismus um ihren anabolen Bedarf zu erfüllen. Tumorzellen mit einer KRAS- oder BRAF-Mutation zeigen ein schnelles Wachstum, welches eine Umprogrammierung des Metabolismus vor aussetzt. Der mitochondriale T-Zellen-Aktivierungsinhibitor (TCAIM) ist bekannt dafür die mitochondriale Zellstruktur zu beeinflussen. Der Einfluss auf den Metabolismus nicht klar. In dieser Arbeit präsentiere ich erstmalig ein mathematische Model des zentralen Kohlen stoffmetabolismus in Darmkrebszellen und T-Zellen. Mithilfe dieses Modells analysiere ich, wie sich die Regulation in ähnlichen Zelllinien unterscheidet. In Bezug auf die Darm krebszellen vergleiche ich BRAF-(CaCO2-BRAFV600E), KRAS-(CaCO2-KRASG12V) mu tierte Zelllinien mit einer Basiszelllinie (CaCO2-control) und zeige, dass der Kohlenstoff metabolismus in BRAF-mutierten Zellen im Vergleich zu den beiden übrigen Zelllinien herabreguliert ist. Das Modell bestätigt außerdem, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) in den Darmkrebszellen eine wichtige Rolle, insbesondere in den KRAS mu tierten Zellen, spielt. In T-Zellen zeigt der Vergleich von Wildtypzellen (CD8 T-Zellen) mit TCAIM homozygoten Zellen (TCAIM homozygote CD8 T-Zellen), dass der Kohlen stoffmetabolismus in zweiteren überwiegend herabreguliert und weniger aktiv ist. Diesen Effekt konnte ich durch die Analyse von RNASeq-Daten der jeweiligen Zelltypen bestä- tigen. Des Weiteren stelle ich fest, dass sich der Tricarbonsäurezyklus umkehrt, wenn durch die Glykolyse nicht ausreichend Laktat exportiert und die Biomasseproduktion unterstützt werden kann. Meine Arbeit stellt damit insgesamt einen neuartigen Ansatz zur Integration von Meta bolomik und RNAseq Daten dar, um die Regulation des zentralen Kohlenstoffmetabo lismus zu verstehen. Colon cancer cells and T cells regulate central carbon metabolism to meet their anabolic needs. In KRAS and BRAF tumors, metabolic reprogramming is a premise to support rapid proliferation. In T cells, the mitochondrial T cell activation inhibitor (TCAIM) is known to affect mitochondrial morphology but its effect on cellular metabolism is not well understood. Via mathematical modelling, I investigate the differential regulation of closely related cell lines. I present the first mathematical model for colon cancer and T cell metabolism, unraveling differential regulation between related cell lines. The model shows that CaCO2-BRAFV600Ecells are mostly downregulated compared to CaCO2-KRASG12Vand CaCO2-control. Additionally, it demonstrates the critical role of monocarboxylate transporter (MCT), especially for CaCO2-KRASG12V. Concerning T cells, I compare wild-type T cells to homozygous TCAIM T cells. This unveils that TCAIM homozygous cells have a mostly downregulated TCA cycle, validated by RNASeq data, and are less metabolically active than wild-type T cells. Furthermore, if the glycolytic flux is not sufficient to support lactate export and biomass production, the model reveals that the TCA cycle is reversed as it requires less regulation. Taken together, this work presents a novel approach to integrate data referring to metabolic and genetic regulation of metabolism. On this basis, we can now better discriminate the metabolic capacity of CaCO2-control, CaCO2-BRAFV600E, CaCO2-KRASG12V, wildtype CD8 T cells, and homozygous TCAIM CD8 T cells.

Die Durchführung von Experimenten und das mathematische Modellieren von zellulären Prozessen gehören in der Systembiologie untrennbar zusammen. Das gemeinsame Ziel ist die Aufklärung des Zusammenspiels intrazellulärer Prozesse wie Metabolismus, Genexpression oder Signaltransduktion. Während sich molekularbiologische Untersuchungen mit den molekularen Mechanismen einzelner isolierter Systeme beschäftigen, zielt die Systembiologie auf die Aufklärung der Zusammenhänge ganzer Prozesse und schließlich auch ganzer Zellen ab. Die Verfügbarkeit von umfangreichen Datensätzen und die steigenden Möglichkeiten im Bereich der Computersimulation haben in den letzten Jahren den Weg geebnet, um auch Ganzzellsimulationen nicht mehr unmöglich erscheinen zu lassen. Diese Arbeit stellt das erste eukaryotische Ganzzellmodell der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vor. Hefe als eukaryotischer Modellorganismus ist hierbei der perfekte Kandidat für die Erstellung eines solchen Modells. Er bietet, als wohl meist erforschter eukaryotischer Einzeller in Verbindung mit der Verfügbarkeit einer großen Menge experimenteller Daten, beste Voraussetzungen zur Erstellung eines solchen Modells. Das Projekt ist hierbei in drei Teile gegliedert: i) Die Erstellung eines modularen Ganzzellmodells das alle zellulären Funktionen wie Zellzyklus, Genexpression, Metabolismus, Transport und Wachstum abbildet. ii) Die Implementation einer spezialisierten Simulationsumgebung in Verbindung mit einer Datenbank, um die Erstellung, Simulation und Parametrisierung von Modulen zu ermöglichen. iii) Die Durchführung von Experimenten, um einen ganzheitlichen Datensatz zu erlangen, der Wachstum, Genexpression und Metabolismus abbildet. Die hier vorgestellte Arbeit liefert nicht nur ein mathematisches Modell, sondern benennt auch die Herausforderungen, die während der Arbeit an einem Ganzzellmodell auftreten und stellt mögliche Lösungsansätze vor., In systems biology experiments and mathematical modeling are going hand in hand to gain and increase understanding of cellular processes like metabolism, gene expression, or signaling pathways. While molecular biology investigates single isolated parts and molecular mechanisms of cellular processes, systems biology aims at unraveling the whole process and ultimately whole organisms. Today the availability of comprehensive high-throughput data and computational power paved the way to increase the size of analyzed systems to reach the cellular level. This thesis presents the first whole-cell model (WCM) of a eukaryotic cell, the yeast Saccharomyces cerevisiae. This established model organism is the perfect candidate for the implementation of a holistic model based on the available experimental data and the accumulated biological knowledge. The project is split into three parts: i) The creation of a modular functional-complete whole-cell model, combining the processes cell cycle, gene expression, metabolism, transport, and growth. ii) The implementation of a specialized simulation environment and a database to support module creation, simulation, and parameterization. iii) The elicitation of experimental data by conducting an experiment to achieve a comprehensive data set for parameterization, combining growth, metabolic, proteomic, and transcriptomic data. The presented work provides not only a simple mathematical model but also addresses challenges occurring during the development of whole-cell models and names possible solutions and new methodologies required for the creation of WCMs.

Metabolism provides the essential biochemical intermediates and energy that enable life and its growth. In this thesis we studied robustness of Escherichia coli metabolism, by perturbing it with different methods and measuring the response at a molecular level. In Chapter 1, we introduce the latest insight into metabolic regulation and optimality in microbial model organisms. Overall, we identified and described two major gaps in knowledge: the limited amount of known metabolite-protein interactions and the unknown objectives towards which cells optimize their enzyme levels. Moreover, we provide a short introduction to the relevant methods utilized in this thesis. In Chapter 2, we describe a series of experiments which confirmed that CRISPRi is a reliable tool to specifically perturb metabolism in E. coli. We showcase the advantage of using a CRISPRi system integrated in the genome, which is suitable to apply inducible knockdowns of essential genes. We demonstrate this by characterizing growth for a library of over 100 strains and verifying inducibility and specificity with proteomics data. In Chapter 3 we applied the validated CRISPRi setup to perturb and study metabolism systematically. First, we used a pooled CRISPRi library to knock down all metabolic genes in E. coli. By following the appearance of growth defects with next generation sequencing, we show that metabolic enzymes are expressed at higher levels than strictly necessary. We then focused on a panel of 30 CRISPRi strains and characterize their response to lower enzyme levels with metabolomics and proteomics. We show that the metabolome can buffer perturbations of enzyme levels in two different stages: first, metabolites increase enzyme activity to maintain optimal growth and only later they activate gene regulatory feedbacks to specifically upregulate perturbed pathways. In Chapter 4 we employed a different approach to perturb bacterial metabolism, by growing E. coli in different environmental conditions and measuring the response at the metabolome level. We could show that in exponentially growing cells key biosynthetic products as amino acids and nucleotides are kept at relatively stable levels across different environments. We compared our dataset to a matching published proteomics dataset, showing that unlike the proteome, metabolite levels are independent from growth effects., Der Stoffwechsel, oder auch Metabolismus, stellt die essentiellen Bausteine und die Energie bereit, die Leben und zelluläres Wachstum voraussetzen. In dieser Doktorarbeit wurde die Robustheit des Metabolismus von Escherichia coli untersucht, indem er mit verschiedenen Methoden perturbiert und die zelluläre Antwort auf molekularer Ebene verfolgt wurde. In Kapitel 1 werden die neuesten Erkenntnisse über die Regulation und Optimalität des Metabolismus in mikrobiellen Modellorganismen betrachtet. Zusammenfassend ließen sich zwei große Probleme feststellen: Zum einen die niedrige Zahl an nachgewiesenen Metabolit-Protein Interaktionen und zum anderen die unbekannten Ziele, auf deren Grundlage Bakterien ihre Enzymlevel regulieren und einstellen. Darüber hinaus werden in diesem Kapitel die für diese Arbeit relevanten und verwendeten Methoden besprochen. In Kapitel 2 werden eine Reihe von Experimenten beschrieben, die bestätigen, dass CRISPRi eine zuverlässige Methode ist, um den Metabolismus in E. coli spezifisch zu perturbieren. Außerdem werden die Vorteile von einem genomisch integriertem CRISPRi-System gezeigt, das dazu verwendet werden kann die Expression von essentiellen Genen induzierbar zu reprimieren. Die Induzierbarkeit und Spezifität konnten durch ein Wachstumsscreening von 100 Stämmen und Proteom-Analysen belegt werden. In Kapitel 3 wird dargestellt, wie das im vorherigen Kapitel beschriebene CRISPRi- System verwendet wurde, um den Metabolismus systematisch zu perturbieren und zu untersuchen. Zunächst wurde das Wachstum von Stämmen in einer gepoolten CRISPRi-Library, welche alle Gene im zentralen Stoffwechsel von E. coli beinhaltete, mittels Next-Generation Sequencing verfolgt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Enzyme im zentralen Metabolismus in höheren Mengen von der Zelle hergestellt werden, als es für die Aufrechterhaltung des Wachstums nötig wäre. Es wurden 30 CRISPRi Stämme mit Hilfe von Metabolomics und Proteomics genauer untersucht, um die zelluläre Antwort auf niedrigere Enzymlevel zu studieren. Hierbei konnte festgestellt werden, dass das Metabolom die Störung von Enzymleveln auf zwei unterschiedliche Wege puffern kann. Zunächst erhöhen Metabolite die Aktivität von Enzymen, um optimales Wachstum zu gewährleisten, und erst später aktivieren sie genregulatorische Feedback-Mechanismen, um perturbierte Stoffwechselwege spezifisch hochzuregulieren. In Kapitel 4 wird geschildert, wie eine alternative Methode, nämlich das Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, genutzt wurde, um den Metabolismus zu perturbieren und anschließend die metabolische Antwort zu bestimmen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass in exponentiell wachsenden Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen die Konzentrationen von Schlüsselbausteinen, wie Aminosäuren und Nukleotiden, stabil gehalten werden. Diese Daten wurden zudem mit einem passenden, bereits publizierten Proteomics Datensatz verglichen und es konnte gezeigt werden, dass Metabolitkonzentrationen, im Gegensatz zu Proteinkonzentrationen, unabhängig von Wachstumseffekten sind.

Krebs und Infektionskrankheiten, wie z.B. Influenza, stellen zwei der großen Bedrohungen für die Menschheit dar. Gerade durch den demographischen Wandel sind immer mehr Menschen gefährdet. Mathematische Modelle von Krankheiten decken verschiedene Detailebenen ab -- von epidemologischen Modellen der Virusinfektion bis zu intrazellulären Modellen der Signaltransduktion in einzelnen Krebszellen. Diese Modelle, sofern sie anhand von biologische Daten kalibriert wurden, können sich als sehr nützlich erweisen um Hypothesen zu bisher unbekannten Wechselwirkungen zu generieren, Wirkstoffkandidaten vorherzusagen, und die Funktionsweise von existierenden Wirkstoffen besser zu verstehen. Im Rahmen dieser Arbeit möchte ich mehrere Projekte vorstellen, in denen prädiktive mathematische Modelle dazu benutzt wurden, tiefere Einblicke in die biologischen Prozesse zu gewinnen und die Therapieansätze bei Krebserkrankungen und den damit verbundenen Gesundheitsproblemen zu verbessern. Im ersten Teil geht es um die Bedeutung von gemeinschaftlich entwickelter Software für die Systembiologie. Eine offene und erweiterbare Modellierungssoftware ermöglicht es ständig verbessert zu werden und an die Bedürfnisse der Nutzer angepasst zu werden. Im zweiten Projekt wurden die intrazellulären Prozesse während der frühen Influenza A Infektion untersucht. Durch eine Kombination von biologischen Messungen und mathematischer Modellierung konnte der Abbau von viraler RNA wähernd des Transportes durch das Wirtszellzytoplasma als limitierender Faktor für die erfolgreiche Infektion identifiziert werden. Mit Hilfe eines experimentell modifizierten viralen Hämagglutintin-Proteins mit veränderter pH-Abhängigkeit konnte gezeigt werden, dass sich der Abstand zum Zellkern, in dem das virale Genom freigesetzt wird, vergrößert. Die Modellvorhersage, dass die Infektion dadurch weniger effektiv wird, konnte experimentell bestätigt werden. Im dritten Projekt beschäftigte ich mich mit gesundheitlichen Problemen, die im Zusammenhang mit einer Krebserkrankung und deren Behandlung auftreten können. Chemotherapie oder die Krebserkrankung selbst führt bei vielen Patienten zu einer Blutarmut (Anämie). Diese wird aktuell entweder durch regelmäßige Bluttransfusionen oder durch Verabreichung von sogenannten Erythropoiesis-Stimulating Agents (kurz: ESA, zu Deutsch: Erythropoese-stimulierende Substanzen) behandelt. Mithilfe eines publizierten mathematischen Modells zur ESA-EpoR Interaktion konnten die Bindungseigenschaften verschiedener ESAs charakterisiert und zudem die Anzahl der Bindungsstellen auf unterschiedlichen Zelllinien bestimmt werden. Durch eine Erweiterung des Modells mit einem pharmakokinetischen und -dynamischen Teil konnte die Dosierung für Anämiepatienten retrospektiv verbessert werden. Das letzte Projekt stellt eine computerbasierte Methode zur Analyse und Entschlüsselung der zellulären Zusammensetzung von Tumorproben dar. In den vergangenen Jahren wurde vermehrt eine neue Klasse von Krebsmedikamenten entwickelt, die sich das körpereigene Immunsystem zunutze macht, um den Krebs zu bekämpfen. Das Funktionieren dieser Medikamente hängt jedoch davon ab, ob bestimmte Immunzellen in der Umgebung des Tumors vorhanden sind. Auf Grundlage von Einzelzell RNA-Sequenzierungsdaten konnte eine existierende Methode so erweitert werden, dass nunmehr auch Proben von soliden Tumoren entschlüsselt werden können. Zudem wurden die Einflüsse von verschiedenen Faktoren, wie etwa der Gewebeherkunft oder dem verwendeten Algorithmus, systematisch ausgewertet. Zusammengefasst habe ich in dieser Arbeit dargestellt, wie prädiktive Computermodelle dazu verwendet werden können bestehende Behandlungsansätze zu verbessern und neue Wirkstoffkandidaten zu identifizieren. Cancer and infectious diseases, such as influenza infection, represent major threats to the human population, especially since demographic change makes more and more people vulnerable. Mathematical modeling of disease covers several layers of detail ranging from epidemiological models for infection spread to cancer-associated signaling within individual cells. These models, when being calibrated to biological data, can provide useful means for generating hypothesis of priorly unknown interactions, predicting drug targets for novel therapeutic substances and for improving the understanding and efficient functioning of existing treatment strategies. In this thesis, I present several projects in which predictive computational models are utilized to gain deeper insights into the biological processes and to improve therapy of cancer and associated health problems. The first part highlights the importance of community-driven software development for systems biology applications. Efficient, yet expandable and open software continuously improves, driven by an active community of users and developers. In the second project, the intracellular processes during the early influenza A infection are investigated. Using a combination of experimental measurements and mathematical modeling, degradation of the viral genome during its diffusion through the cytoplasm could be identified as a limiting factor for a successful infection. By experimentally increasing the pH sensitivity of the viral hemagglutinin protein, the distance of diffusion was increased and the computationally predicted decrease in infectivity could be validated in experiment. The third project deals with cancer-associated health issues and their treatment. Patients suffering from anemia, caused by the cancer itself or as a side-effect of chemotherapy, are treated either with blood transfusions or with an erythropoiesis stimulating agent (ESA). By adapting a published model of ESA-EpoR interaction, not only the biochemical properties of different ESAs could be characterized in silico but also the number of binding sites (i.e. Epo receptors on the cell surface) in different cell lines was accurately determined. The model was extended by a pharmaco-kinetic and -dynamic part. The combined ESA-EpoR-PK/PD model could be utilized to retrospectively optimize the dosing regimen of patients suffering from anemia. In the last project, a computational method for analyzing and deciphering the cellular composition of bulk tumor samples is presented. Only recently, a new class of anti-cancer drugs was introduced recruiting the body’s own immune system to combat malignant tissue. However, the efficient functioning of these immunotherapeutical drugs heavily depends on the presence of specific immune cells in the tumor micro-environment. Based on single-cell RNA sequencing data, an existing method for computational deconvolution could be adapted for data from solid tumor tissue and its performance was benchmarked. Taken together, in this thesis I present approaches how predictive computational models can be utilized to render more efficient existing treatment strategies.

Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise - zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen). - Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle), - stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar. (i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann. (iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen. Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist. Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften., The use of computer-based analysis has become an integral part of life science research. Within this thesis, systems biology investigations have been applied to various biological topics and organisms which provides an innovative and interdisciplinary methodological approach. The basic question was: How do I understand and describe signaling pathways and how can I influence them? The approach combines various biological data sets and data levels starting from the genome and interaction context over semiquantitative simulations towards new interventions and experiments which can be used therapeutically and biotechnologically. The analysis can contribute to - a better understanding of experimental data and biological questions and enables a systematic understanding of the signaling pathways and network effects (e.g. in plants). - They enable the identification of important functional hub nodes as well as the development of new therapeutic strategies for further experimental testing (e.g. tumor models), - also representing a helpful step on the path to personalized medicine (e.g. lncRNAs and tumor models) and drug development (e.g. database DrumPID). (i) As a basis, an integrated systems biology methodology was developed which examines experimental data sets (e.g. transcriptome data) with respect to their biological functions and enables the identification of relevant functional clusters and hub nodes. In the first part of the thesis, analyzes regarding the plant immune system were accomplished. Using the developed methodology, gene expression datasets of A. thaliana infected with the pathogen Pst DC3000 were analyzed in order to investigate the influence of different virulence factors on the host interactome, and to find new modulators of CK-mediated immune defense. In this context, the analysis could show that the secreted defense compounds of Pst DC3000 influence important plant hormone signaling pathways for the immune defense in A. thaliana. Moreover, the results show that the impact on the network behavior of the effector proteins and COR phytotoxins differ from the PAMPs, but there also exists an overlap in common regulated signal pathways as well as an overlap between the two phases of immune response (PTI and ETI) in A. thaliana. In addition, the complex immune response to an infection is also reflected by a higher number of functional clusters and hub nodes in Pst DC3000 compared to the two studied mutants, whereby for Pst DC3000 a highly connected immune-relevant cluster around the JA pathway has been found. Furthermore, using the developed methodology several important hub nodes for the immune defense have been identified. As most important candidates, AHK2 and AAR14 have to be highlighted which are part of the two-component-system of signal transduction of CK and represent in this context important modulators for a CK mediated immune defense. (ii) In the second part of the thesis, analyzes of a HSP90 treatment in lung cancer in an in vitro experiment in 2D and 3D cell cultures were accomplished. In this context using the developed methodology, differences between the two cell cultures explaining the differences in treatment responses were found, and for the two KRAS mutated cell lines A549 and H441 of the 3D test system new prognostic marker and therapeutic drug candidates were identified. However, the analyzes found two functional clusters of protein interactions around p53 and the STAT family which have a connection to HSP90 and might explain the observed treatment differences for the HSP90 inhibition between the two cell culture systems. Considering the mutational background of the cell lines, a prognostic marker signature were found and derived from it HIF1A for the H441 cell line and AMPK for the A549 cell line as new therapeutic drug targets. Moreover, the subsequently performed in silico simulations could show a potential therapeutic effect of the identified drug targets. Furthermore, important experimental read-out parameters were integrated into the in silico lung tumor model, and by considering the mutation background of the used cell lines the HSP90 treatment of the 3D test system could be in silico simulated. In the further course of the thesis, resistance mechanisms after gefitinib treatment with known mutation status for the HCC827 and A549 cell lines were investigated in the in silico lung tumor model and consequently new therapeutic approaches were derived which may be of potential clinical relevance. Here, the in silico simulations for HCC827 cells show that a co-activation of EGFR and c-MET can lead to a gefitinib resistance, whereas in the A549 a co-mutation of KRAS and IGF-1R can contribute to the reduced treatment response. In addition, the simulations reveal that a direct inhibition of the resistance contributing receptors c-MET and IGF-1R reflect not the best treatment strategy in both cases. However, in both cell lines a combined inhibition of PI3K and MEK provides the best therapeutic effect, thus representing a promising new therapeutic approach in gefitinib resistant lung cancer patients. In a further step, the therapeutic potential of the miRNA-21 was examined in the in silico model for the HCC827 cells. The simulations show that an overexpression of the miRNA-21 can contribute to a resistance development after gefitinib treatment, in which an inhibition of the miRNA-21 reverses this effect. Moreover, the results show that a PTEN activation can function as a potential marker of therapeutic success of miRNA-21 inhibition whereas a reduced miRNA-21 expression may serve as a potential marker for a successful gefitinib treatment. (iii) In the third part of the thesis, systematic RNA and protein interactions were investigated. For this, integrated systems biology analyzes were carried out on new identified and previously functional unknown lncRNAs. The analyzes of the cardiac hypertrophy caused upregulated lncRNA Chast have extensive demonstrated that Chast can regulate and bind proteins and transcription factors which regulate signal transduction and gene expression, but it has also a connection to the cardiovascular system and stress-induced cardiac hypertrophy. Based on the results, it can be concluded that Chast can directly and indirectly (a) bind proteins and influence the translation but also possess a chromatin-modifying function and regulate transcription e.g. for cardiac and stress-associated genes, and/or (b) regulate its own transcription in a negative feedback loop. Although lncRNAs often have a low conservation the analysis could show a sequence-structure-conservation for Chast in mammalians. Furthermore, the investigations for two hypoxia induced endothelial lncRNAs have shown that the lncRNA MIR503HG represents a high sequence-structure-conservation in mammalians, whereas the LINC00323-003 shows a low conservation. This underscores the fact that lncRNAs often have a low conservation thereby making studies regarding the therapeutic potential in model organisms difficult. Finally, as numerous analyzes in this thesis have focused on interactions and signaling pathways, a database was developed which brings a sustainable progress in analysis of protein interactions and signaling pathways. The developed DrumPID database puts especially the interaction between a drug and its target into its focus and allows analysis of individual interactions and involved signaling pathways but, additionally, provides various crosslinks to other databases for individual further analysis. DrumPID enables to find a suitable drug, e.g. for a given target protein, and to analyze its mechanism of action as well as interaction context which can contribute to a better understanding of experimental data. Moreover, DrumPID allows to develop a potential chemical lead structure for a target protein which e.g. specifically inhibits a parasitic protein but has no toxic effect in humans. Numerous additional pharmaceutical examples verify that DrumPID is suitable for the daily scientific usage in the field of analysis of protein-drug-interactions and drug development. The described results of the doctoral thesis were published in five research papers, two review articles and a book chapter, e.g. in Science Translational Medicine, including six first authorships.

Information spielt in der Natur eine zentrale Rolle. Als intrinsischer Teil des genetischen Codes ist sie das Grundgerüst jeder Struktur und ihrer Entwicklung. Im Speziellen dient sie auch Organismen, ihre Umgebung wahrzunehmen und sich daran anzupassen. Die Grundvoraussetzung dafür ist, dass sie Information ihrer Umgebung sowohl messen als auch interpretieren können, wozu Zellen komplexe Signaltransduktionswege entwickelt haben. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf Signalprozesse in S.cerevisiae die von osmotischem Stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalweg) und der Stimulation mit α-Faktor (Pheromon Signalweg) angesprochen werden. Wir wenden stochastische Modelle an, die das intrinsische Rauschen biologischer Prozesse darstellen können, um verstehen zu können wie Signalwege die ihnen zur Verfügung stehende Information umsetzen. Informationsübertragung wird dabei mit einem Ansatz aus Shannons Informationstheorie gemessen, indem wir sie als einen Kanal in diesem Sinne auffassen. Wir verwenden das Maß der Kanalkapazität, um die Genauigkeit des Phosphorelays einschränken zu können. In diesem Modell, simuliert mit dem Gillespie Algorithmus, können wir durch die Analyse des Signalverhaltens den Parameterraum zusätzlich stark einschränken. Eine weitere Herangehensweise der Signalverarbeitung beschäftigt sich mit dem “Crosstalk” zwischen HOG und Pheromon Signalweg. Wir zeigen, dass die Kontrolle der Signalspezifizität vor allem bei Scaffold-Proteinen liegt, die Komponenten der Signalkaskade binden. Diese konservierten Motive zellulärer Signaltransduktion besitzen eine geeignete Struktur, um Information getreu übertragen zu können. Im letzten Teil der Arbeit untersuchen wir potentielle Gründe für die evolutionäre Selektion von Scaffolds. Wir zeigen, dass ihnen bereits durch die Struktur des Mechanismus möglich ist, Informationsgenauigkeit zu verbessern und einer verteilten Informationsweiterleitung sowohl dadurch als auch durch ihre Robustheit überlegen sind. Information plays a ubiquitous role in nature. It provides the basis for structure and development, as it is inherent part of the genetic code. It also enables organisms to make sense of their environments and react accordingly. For this, a cellular interpretation of information is needed. Cells have developed sophisticated signaling mechanisms to fulfill this task and integrate many different external cues with their help. Here we focus on signaling that senses osmotic stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway) as well as α-factor stimulation (pheromone pathway) in S.cerevisiae. We employ stochastic modeling to simulates the inherent noisy nature of biological processes to assess how systems process the information they receive. This information transmission is evaluated with an information theoretic approach by interpreting signal transduction as a transmission channel in the sense of Shannon. We use channel capacity to both constrain as well as quantify the fidelity in the phosphorelay system of the HOG pathway. In this model, simulated with the Gillespie Algorithm, the analysis of signaling behavior allows us to constrain the possible parameter sets for the system severely. A further approach to signal processing is concerned with the mechanisms that conduct crosstalk between the HOG and the pheromone pathway. We find that the control for signal specificity lies especially with the scaffold proteins that tether signaling components and facilitate signaling by trans-location to the membrane and shielding against miss-activation. As conserved motifs of cellular signal transmission, these scaffold proteins show a particularly well suited structure for accurate information transmission. In the last part of this thesis, we examine the potential reasons for an evolutionary selection of the scaffolding structure. We show that due to its structure, scaffolds are increasing information transmission fidelity and outperform a distributed signal in this regard.

Corynebacterium glutamicum is of huge importance in the production of amino acids and has an impressive portfolio of substrates and products. In this thesis it was shown that elevated growth temperature led to decreased biomass yield and specific growth rate and to increased lysine yield. At 38°C, the lysine yield was ca. 40-55% higher than at 30°C. Metabolic flux analysis of C. glutamicum Lys12 revealed 101% flux through the pentose phosphate pathway at 38°C as compared to 86% at 30°C. In a fed-batch bioreactor setup, the cultivation at 38°C led to a 10% higher yield, as compared to 30°C. Also, C. glutamicum Lys12 was modified to allow for growth and lysine production from xylose via expression of the Escherichia coli genes xylA and xylB. The resulting strain C. glutamicum Xyl1 was able to grow at 0.17 1/h and converted xylose into lysine at a yield of 0.25 mol/mol. In a more industry-like fed-batch bioreactor setup 116 g/L lysine were produced with a xylose based medium. Finally, the Pseudomonas stutzeri ectABCD operon (with the osmosensitive promoter exchanged for a constitutive one and the codon usage of C. glutamicum considered) was expressed in C. glutamicum lysC T311I to enable ectoine production. This strain produced ectoine (19 mmol/mol) from glucose, but also lysine, which was stopped by deletion of lysE. Elevated temperatures led to improved ectoine secretion and 4.5 g/L ectoine could be produced in a fed-batch process at 35°C. Corynebacterium glutamicum ist von großer Bedeutung für die Produktion von Aminosäuren und weist ein beeindruckendes Spektrum an Substraten und Produkten auf. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass erhöhte Wachstumstemperaturen zu reduzierter Biomasseausbeute und spezifischen Wachstumsrate sowie erhöhter Lysinausbeute führten. Bei 38°C lag die Ausbeute ca. 40-555 höher als bei 30°C. Metabolische Flussanalyse zeigte 101% Kohlenstofffluss durch den Pentosephosphatweg bei 38°C, während bei 30°C nur 86% erreicht wurden. In einem Fedbatch Prozesses im Bioreaktor war die Lysinausbeute bei 38°C 10% höher als bei 30°C. Das Einbringen der Escherichia coli Gene xylA und xylB in C. glutamicum ermöglichte außerdem Wachstum mit 0,17 1/h sowie Lysinproduktion mit einer Ausbeute von 0,25 mol/mol auf Xylose. In einem Fedbatch Bioreaktorexperiment wurden in einem auf Xylose basierten industrienahen Medium 116 g/L Lysin produziert. Schließlich wurde noch das Pseudomonas stutzeri ectABCD Operon (mit ausgetauschtem Promotor und berücksichtigter Codonverwendung) in C. glutamicum lysC T311I eingebracht, was die Ectoinproduktion von Glukose ermöglichte (19 mmol/mol). Die Sekretion des Nebenprodukts Lysin wurde durch Deletion von lysE unterbunden. Wie bei der Produktion von Lysin führten erhöhte Temperaturen zu einer verbesserten Ectoinproduktion und in einem Fedbatch Bioreaktor konnten bei 35°C 4,5 g/L Ectoin produziert werden.

Das Leben und Überleben einer Zelle wird auf verschiedenen Ebenen streng reguliert. Diese Ebenen sind eng miteinander verknüpft: (i) Signalwege leiten extrazelluläre Signale in den Zellkern, wo (ii) Genregulation sie zu Proteinen übersetzt, und (iii) Proteine kontrollieren metabolische Funktionen, die Nährstoffe zu Energie und zellulären Bausteinen konvertieren. Diese Systeme sind hochkomplex und werden oft nur einzeln betrachtet. Systembiologie ist ein interdisziplinäres Forschungsgebiet, das Methoden anbietet, um Informationen aus heutigen Hochdurchsatz-Experimenttechnologien zu extrahieren. Diese Methoden können effektiv sein, um die vorgenannten Systeme einzeln oder im Ganzen zu untersuchen. In dieser Doktorarbeit wende ich Methoden an, um Signalwege und Zellmetabolismus zu erforschen, und ich präsentiere neue Arbeitsabläufe für das Modellieren und Analysieren dieser Systeme. Beide Methoden sind auf großskalige Netzwerkrekonstruktionen fokussiert. Da die Erhältlichkeit von xperimentellen Daten eines der größten Probleme der Systembiologie darstellt, befassen sich die Methoden explizit mit dem Umgang mit Wissenslücken. Sie werden auf den Snf1 Signalweg und den Metabolismus von Hefezellen angewendet und vermitteln neue Erkenntnisse über diesen Modellorganismus. Des Weiteren präsentiert diese Arbeit eine eingehende Analyse vom metabolischen Reprogrammieren in Darmkrebszellen, welche bisher unbekannte Zusammenhänge von metabolischer Funktionalität und Onkogenen beinhaltet. Zum Abschluss stelle ich unseren Vorschlag für ein standardisiertes Datenaustauschformat vor, welches seinen Schwerpunkt auf Datentabellen der Systembiologie legt. Zusammenfassend behandelt diese Doktorarbeit die Signalwege und den Metabolismus von Zellen, inklusive neuer Modellierabläufe und biologischer Erkenntnisse. Diese Erkenntnisse werden in den Kontext unseres aktuellen Wissensstandes gesetzt und darauf aufbauend werden neue potentielle Ansatzpunkte für Experimente vorgeschlagen. Cellular life is governed on different layers of regulation, which are tightly interconnected: (i) Signalling pathways transmit extracellular signals to the cells’ nucleus, where (ii) gene regulation translates these signals into proteins, and (iii) proteins control metabolic functions, which convert nutrients to energy and cell building blocks. Due to the complexity of each of these systems, they are often analysed individually or only partially. Systems Biology is an interdisciplinary field of research that offers techniques to harvest the information of todays high-throughput experiments. These techniques can be powerful approaches to investigate the aforementioned regulatory layers of a cell either individually or as a whole. In this thesis, I am employing means of Systems Biology to explore signalling pathways and metabolism, and I provide novel workflows for modelling and exploring these systems. Both workflows are focussed on accurate large-scale network reconstructions of the target system. Since one of the major problems in Systems Biology is the availability of experimental data, the workflows put emphasis on the handling of knowledge gaps. They are applied on the Snf1 pathway and metabolism in yeast and provide new findings about this model organism. Furthermore, this thesis presents an in-depth analysis of metabolic reprogramming in colorectal cancer cells, which yields previously unknown coherences of metabolic function and oncogenes. Finally, I am presenting a proposal for a standardised data format in Systems Biology, which is based on data tables. In summary, this thesis comprises works on signalling pathways and cell metabolism, which includes novel modelling workflows and new biological findings, analyses their impact on the scientific state of the art, and proposes directions for new experimental targets.

Interleukin 2 (IL-2) ist ein Zytokin, welches in menschlichen Gedächtnis-T-Helfer-Zellen (Teff Zellen) exprimiert und sekretiert wird und damit die Immunantwort formt. Im Gegensatz dazu wird IL-2 normalerweise nicht in regulatorischen T-Zellen (Treg Zellen) exprimiert, sondern von diesen nur aufgenommen. Durch die Aktivierung des T-Zellrezeptors werden Signalkaskaden induziert, welche zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren AP-1, NFAT, und NF-kB führen. Diese sind entscheidend für die Genexpression von IL-2. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die Regulation der IL-2 Genexpression untersucht. Dabei vergleiche ich die transkriptionelle Regulation in Teff Zellen mit der Regulation in Treg Zellen. Insbesondere konnte ich zeigen, dass die endogene Konzentration der Transkriptionsfaktoren sich auf die Anzahl der IL-2 Produzenten auswirkt, aber nicht auf die Konzentration von IL-2 innerhalb einer Zelle. Deshalb untersuche ich wie sich die Konzentration der Transkriptionsfaktoren auf die Häufigkeit von IL-2 Produzenten auswirkt. Ich nutze die vorhandenen endogenen Konzentrationen und kann damit vorhersagen, dass die Zahl der IL-2 Produzenten entscheidend von der c-fos Konzentration in Teff Zellen abhängt. Mit Hilfe des entwickelten Modells kann ich voraussagen, wie der spezifische Inhibitor U0126 die Häufigkeit von IL-2 Produzenten verringert. Diese Vorhersage wurde durch Experimente belegt. Meine Modelle zeigen weiterhin, dass c-fos und NFATc2 die Häufigkeit der IL-2 Produzenten in Teff Zellen kooperativ regulieren. In Treg-Zellen zeigt meine Analyse, dass alle Transkriptionsfaktoren eine ähnliche sigmoidale Wirkung auf die Häufigkeit der IL-2-Produzenten ausüben. Im Gegensatz zu den Teff Zellen haben alle Transkriptionsfaktor eine ähnliche maximale Wirkung auf Genexpression von IL-2. Mittels eines Inhibitionsmodelles konnte ich zeigen, dass der Treg zellspezifische Transkriptionsfaktor FoxP3 allen aktivierenden Transkriptionsfaktoren entgegenwirkt. Interleukin 2 (IL-2) is a cytokine expressed in human memory T helper cells (Teff cells) and the secretion of IL-2 shapes the immune response. In contrast, human regulatory T-cells (Treg cells) commonly do not express IL-2. The gene expression of IL-2 is induced by the activation of the T-cell receptor signaling network activating the transcription factors AP-1, NFAT, and NF-kB. These transcription factors are crucial for initiating IL-2 gene expression. Within my thesis I compare the regulation of IL-2 gene expression in Teff cells and Treg cells using experiments and modeling. I demonstrate that the transcription factor concentrations correlate with number of IL-2 producers but do not affect IL-2 concentration per cell. Thus, I investigate how the transcription factor concentration of c-fos, NFATc2, p65, and p-c-jun affects the frequency of IL-2 producing cells as a proxy for the probability of a cell to produce IL-2. Using the endogenous heterogeneity of transcription factor concentrations, I predict that the number of IL-2 producers is critically dependent on the amount of c-fos in Teff cells. I use my model to predict how perturbations of c-fos by the specific inhibitor U0126 decrease the frequency of IL-2 producers in Teff cells. This prediction was than validated by experiments. My models furthermore indicate the cooperative behavior of c-fos and NFATc2 on the level of frequency of IL-2 producers in Teff cells. In Treg cells, I show that all transcription factors exert a similar sigmoidal effect on the frequency of IL-2 producers. In contrast to the effects seen in Teff cells, all transcription factor have a similar maximal effect on the IL-2 gene expression. With an inhibitory model I explore the relation between the Treg cell-specific transcription factor FoxP3 the transcription factors c-fos, NFATc2, p65, and p-c-jun on the frequency of IL-2 producers. This model indicates that FoxP3 counteracts the activating function of NFATc2, AP-1, and also NF-kB.

Succinic acid is a highly versatile chemical with the potential of replacing the maleic acid platform currently derived from petroleum. Among the microorganisms suitable for succinic acid production, Basfia succiniciproducens stands out as one of the most efficient commercial producers. In the present work, succinic acid production by B. succiniciproducens from sucrose, fructose, and xylose was analyzed at a systems level by means of 13C metabolic flux analysis. Qualitative 13C tracer studies and in vitro enzymatic assays shed light on so far unknown key properties of the B. succiniciproducens metabolism. Strategies for systems metabolic engineering of B. succiniciproducens were inferred from these results and successfully applied. Compared to other sugars, succinate yields on sucrose and fructose were reduced. This effect could be traced back to the PTS systems responsible for substrate uptake. The beneficial effect of fructokinase, a key enzyme of the B. succiniciproducens sucrose catabolism newly discovered in this work, was exploited to engineer a mutant strain with a tremendously increased succinate yield. Towards utilizing hemicellulose as a raw material, xylose was identified as a promising substrate for succinate production, with formate dehydrogenase possibly involved in superior redox recycling, leading to high succinate yields coupled to reduced by-product formation. Bernsteinsäure ist eine vielfältig einsetzbare Chemikalie mit dem Potential, die aus Rohöl gewonnene Plattformchemikalie Maleinsäure zu ersetzen. Unter den verschiedenen Bernsteinsäure-produzierenden Mikroorganismen sticht Basfia succiniciproducens als effizienter kommerzieller Produzent hervor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bernsteinsäurebildung durch B. succiniciproducens auf Saccharose, Fructose und Xylose mithilfe von 13C-metabolischer Flussanalyse auf Systemebene untersucht. Qualitative 13C Markierungsstudien und Enzymaktivitätsmessungen trugen zur Aufklärung bisher unbekannter Eigenschaften des Metabolismus von B. succiniciproducens bei. Aus den Ergebnissen wurden Strategien zur Stammverbesserung mittels Systems Metabolic Engineering abgeleitet und erfolgreich umgesetzt. Die Produktausbeuten auf Saccharose und Fructose waren vergleichsweise gering. Dies konnte auf die für die Aufnahme der Zucker verantwortlichen PTS Systeme zurückgeführt werden. Der vorteilhafte Effekt der Fruktokinase, eines wichtigen Enzyms im Saccharosekatabolismus von B. succiniciproducens, das in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen wurde, konnte zur Konstruktion eines Produzenten mit deutlich erhöhter Bernsteinsäureausbeute genutzt werden. In Hinblick auf die Verwendung von Hemicellulose als Rohstoff wurde Xylose als vielversprechendes Substrat identifiziert. Dabei war das Enzym Formiatdehydrogenase in einen vorteilhaften Redoxstoffwechsel involviert, der zu hohen Produktausbeuten führte.

Violacein and deoxyviolacein are promising therapeutics against pathogenic bacteria and viruses as well as tumor cells. In the present work, systems-wide metabolic engineering was applied to Escherichia coli for heterologous production of these high-value products. First, a high performance liquid chromatography method for accurate separation and quantification of violacein and deoxyviolacein was developed. Afterwards, a basic producer, E. coli dVio-1, that expressed the vioABCE cluster from Chromobacterium violaceum under control of the araBAD promoter and induction by L-arabinose, was constructed. Targeted intracellular metabolite analysis then identified bottlenecks in pathways that supply tryptophan, the major product building block of the natural products of interest. This was used for systems-wide engineering of serine, chorismate and tryptophan biosynthesis and the non-oxidative pentose-phosphate pathway, followed by elimination of L-arabinose catabolism. Transferred to a glycerol-based fed-batch process, E. coli dVio-8 surpassed the gram scale and produced 1.6 g L-1 deoxyviolacein (>99.5% purity). The created chassis of a high-flux tryptophan pathway was complemented by genomic integration of the vioD gene of Janthinobacterium lividum, which enabled exclusive production of violacein (710 mg L-1 with 99.8% purity). This demonstrates the potential of E. coli as a platform for production of tryptophan based therapeutics. Violacein und Deoxyviolacein sind vielversprechende Therapeutika gegen pathogene Bakterien und Viren als auch Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde Escherichia coli zur heterologen Produktion dieser hochwertigen Produkte untersucht. Zuerst wurde eine HPLC-Methode für eine genaue Trennung und Quantifizierung von Violacein und Deoxyviolacein entwickelt. Anschließend wurde einer Basisstamm von E. coli, die die vioABCE Operon aus Chromobacterium violaceum unter der Kontrolle des araBAD-Promotor, konstruiert. Gezielte intrazelluläre Stoffwechselanalysen identifizierten dann Engpässe in den zuliefernden Routen der Biosynthese von Tryptophan, dem zentralen Baustein für das Produkt. Dieses Wissen wurde für die rationale Stammoptimierung genutzt. Durch die aufeinanderfolgende Optimierung von Serin-, Tryptophan- und Chorismat-Biosynthese sowie des nicht-oxidativen Pentose-Phosphat-Weges konnte eine umfassende Optimierung des Stoffflusses zum Zielprodukt erreicht werden. In einem Glycerin-basierten Fed-Batch-Verfahren, hat E. coli dVIO-8 den Gramm-Maßstab übertroffen (1,6 g L-1 Deoxyviolacein, >99,5% Reinheit). Das metabolische Chassis von E. coli mit einem High-Flux-Tryptophan-Weg wurde durch genomische Integration des vioD Genes aus Janthinobacterium lividum zur gezielten Produktion (710 mg L-1, 99,8% Reinheit) von Violacein weiterentwickelt. Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus das große Potential von E. coli als Plattform für die Produktion Tryptophan-basierter Therapeutika.

Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.

In its natural environment, the soil bacterium Bacillus subtilis permanently encounters nutrient limitations and increases in osmotic stress. The present study investigated the systems-wide response of B. subtilis to different simultaneously imposed stresses by combining chemostat experiments under conditions of carbon and nitrogen limitation, ionic and non-ionic osmotic stress and osmoprotection with multi-omics analyses of the transcriptome, proteome, metabolome and fluxome. Surprisingly, the flux through central carbon and energy metabolism is very robust under all conditions studied. The key to achieve this robustness is the increased production of several enzymes of central carbon metabolism to compensate for their reduced activity in the presence of high salt. A major response of the cell during osmotic stress is the production of the compatible solute proline through the concerted adjustment of multiple reactions around the 2-oxoglutarate node, which drives metabolism towards the precursor glutamate. Co-regulations between the individual cellular components under the investigated stress conditions indicate that the fine-tuning of the transcriptional and metabolic networks involves functional modules that outreach single pathways. Additionally, the work shortly describes the salinity-decoupled fed-batch production of the compatible solute ectoine in Corynebacterium glutamicum and the contribution of precursor amino acids of the aspartate family. Das Bodenbakterium Bacillus subtilis ist in seiner natürlichen Umgebung permanenten Schwankungen des Nährstoffangebots und osmotischem Stress ausgesetzt. Die vorliegende Arbeit untersucht die systemweite Anpassung von B. subtilis an verschiedene, gleichzeitig auftretende Umweltstresse. Dazu wurden Chemostatexperimente, die sowohl Kohlen- und Stickstofflimitierung, als auch osmotischen Stress und Osmoprotektion nachbilden, mit Analysen des Transkriptoms, Proteoms, Metaboloms und Fluxoms kombiniert. Überraschenderweise ist die metabolische Flussverteilung im zentralen Kohlenstoffwechsel unter allen untersuchten Bedingungen sehr rigide. Eine erhöhte Produktion wichtiger Enzyme des zentralen Kohlenstoffwechsels kompensiert deren reduzierte Aktivität in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen im Cytosol. Eine weitere Reaktion der Zelle auf erhöhten osmotischen Stress ist die verstärkte Synthese des kompatiblen Soluts Prolin. Dies wird ermöglicht durch eine abgestimmte Anpassung der Reaktionen bis zum 2-Oxoglutarat-Knoten, die den Kohlenstofffluss in Richtung des Vorläufers Glutamat treibt. Regulatorische Interaktionen innerhalb funktionaler Module ermöglichen dabei eine systemweite Feinabstimmung des metabolischen Netzwerks über einzelne Stoffwechselwege hinaus. Die Arbeit beschreibt weiterhin die erfolgreiche, Hochsalz-unabhängige Produktion des kompatiblen Soluts Ectoin mit Corynebacterium glutamicum und geht kurz auf die Rolle beteiligter Aminosäuren der Aspartatfamilie ein.

Mit ihrem neuen Themenband – der hier zusammengefasst vorgestellt werden soll – wendet sich die interdisziplinäre Arbeitsgruppe „Gentechnologiebericht“ der Berlin-Brandenburgischen Akademie der Wissenschaften erstmalig der in der Öffentlichkeit noch weitgehend unbekannten Synthetischen Biologie zu. Von besonderer Faszination ist dabei die noch im Fluss befindliche Auseinandersetzung, was denn nun eigentlich die Synthetische Biologie ist und welche Forschungsansätze ihr konkret zuzuordnen sind. Entsteht hier wirklich eine neue Ingenieurbiologie? Nach einer inhaltlichen (Kapitel 1) und methodischen (Kapitel 2) Einführung beginnt die thematische Auseinandersetzung mit einer wissenschaftshistorischen Perspektive auf synthetisch-technische Traditionen in der Biologie (Kapitel 3). Anschließend wird der aktuelle naturwissenschaftliche Sachstand präsentiert mit einem Fokus auf chemisch-synthetische Forschungsansätze (Kapitel 4) und neue Anwendungen in der Biomedizin (Kapitel 5). Überdies werden in interdisziplinärer Ausrichtung der Arbeitsgruppe auch neue philosophische (Kapitel 6) und ethische (Kapitel 7 und 8) Implikationen der Synthetischen Biologie diskutiert. Als letzter Themenbereich wird die aktuelle gesellschaftliche Wahrnehmung der Disziplin besprochen: sowohl die gegenwärtige Berichterstattung zum Thema (Kapitel 9) als auch die öffentliche Meinung in Deutschland und Europa (Kapitel 10). Die inhaltlichen Ausführungen werden in gewohnter Weise durch quantitative Daten in Form von Indikatoren unterstützt (Kapitel 11). Ergänzt werden die Beiträge durch die gemeinsamen Kernaussagen und Handlungsempfehlungen der Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Synthetische Biologie. With their new thematic volume – presented here in summarised form – the Interdisciplinary Research Group "Gene Technology Report" of the Berlin-Brandenburg Academy of Sciences and Humanities turns its attention to synthetic biology, a topic that remains largely ignored by the general public. Particularly fascinating here are the ongoing disagreements as to exact nature of synthetic biology, in addition to which research methods should be concretely recognised in this field. Does this indeed reflect the emergence of a new kind of biological engineering? After introducing the factual (chapter 1) and methodological (chapter 2) frameworks, the issue is discussed in a critical fashion from a scientific-historical perspective in connection with synthetic-technical traditions in biology (chapter 3). After that, the current state of scientific knowledge is elucidated with a focus on chemical-synthetic research methodologies (chapter 4), as well as new applications in biomedical science (chapter 5). Using an interdisciplinary approach, the Interdisciplinary Research Group also discusses new philosophical (chapter 6) and ethical (chapter 7 and 8) implications that arise in association with synthetic biology. Lastly, the topic of the public’s perception of this discipline is addressed, both in related contemporary media reports (chapter 9), as well as in a survey of German and European public opinion (chapter 10). As is customary, these substantive remarks are supported by quantitative data in the form of indicators (chapter 11). The individual contributions are complemented by joint key statements and recommendations for action by the members of the Interdisciplinary Research Group "Gene Technology Report".

Within this thesis the glucose metabolism in Penicillium chrysogenum, the most important production organism for beta-lactam antibiotics, was investigated. Therefore, different methods of Systems Biology, including metabolome analysis, 13C-labeling experiments and 13C-metabolic flux analysis, were applied. First, the cultivation of P. chrysogenum was established as a batch process on defined glucose medium. This process served as the basis for all further analyses and showed two characteristic growth phases. During the first phase glucose was fully metabolized and both biomass and the typical overflow metabolite gluconate were produced. Within the second growth phase, gluconate was metabolized after the depletion of glucose. Here not only the formation of biomass, but also excretion of the product penicillin was observed. Hence, depending on the respective carbon source, the batch process represents two different metabolic states of the fungus. In following studies, for the first time the simultaneous utilization of glucose and gluconate under glucose excess conditions was shown for P. chrysogenum. By applying a model-driven approach the specific uptake rates for both substrates were estimated and found to be significantly higher for gluconate. Moreover, gluconate consumption did not interfere with penicillin production, making it an interesting alternative carbon source for production purposes. Furthermore, a distinct metabolic switch in dependence of the actual carbon source was demonstrated on metabolome and fluxome level. For that purpose intra- and extracellular metabolites were quantified and stationary 13C-metabolic flux analyses were conducted. The determined intracellular flux distributions indicated the Entner-Doudoroff pathway to be active during the second growth phase, when P. chrysogenum metabolizes gluconate as the sole carbon and energy source. This pathway could be beneficial for the direct supply of precursors for penicillin biosynthesis as well as of energy and reducing equivalents in the lower part of glycolysis. Therefore, studying the activity and regulation of the Entner-Doudoroff pathway might be of special interest regarding the development of new producer strains. In addition, a concept for the cultivation of the filamentous fungus in a microfluidic perfusion system was developed. Applying microscopic image analyses, the system enables qualitative and quantitative studies of growth and morphogenesis, thereby providing new options for the characterization of producer strains and for bioprocess development.

Yersinia pseudotuberculosis is a human pathogen that causes acute intestinal and systemic diseases. This study investigated the link between pathogenic traits and the metabolic core machinery of Y. pseudotuberculosis using a systems biology approach: the integration of gene expression profiles with metabolic pathway fluxes in the wild type and virulence regulator mutants. The absence of specific virulence regulators particularly perturbed fluxes and gene expression of pyruvate metabolism and tricarboxylic acid cycle, suggesting an involvement of this metabolic node in the virulence management system. Mutants, genetically perturbed in regulators of this metabolic branch point and one of its central enzymes, showed a significant reduction of virulence in an oral mouse infection model. This revealed the pyruvate- TCA cycle node as a focal point for controlling host colonization. Flux rerouting was also identified as response to applied antibiotic therapies. The examination of Yersinia’s fine-tuned adaptation was expanded to temperature, an important infection parameter, using a continuous culture with advanced temperature control to mimic the infection process. The virulence regulator RovA, known to respond to temperature and to control metabolic, stress, and virulence genes, was quantified by Western blot analysis and fluorescence-activated cell sorting. RovA showed a bistable behavior that generally maximizes survival by heterogeneity. Das humanpathogene Bakterium Yersinia pseudotuberculosis verursacht ernsthafte intestinale und systemische Erkrankungen. In dieser Arbeit wurde die Verknüpfung von Pathogenität und Metabolismus in Yersinia pseudotuberculosis unter Verwendung von Transkriptom- und metabolischen 13C-Stoffflussanalysen untersucht. Virulenz-Regulator-Mutanten wiesen im Vergleich zum Wildtyp starke Veränderungen im Pyruvatmetabolismus und im Zitratzyklus auf. Die gezielte genetische Deregulation dieses Stoffwechselknotenpunktes führte zu Mutanten mit stark reduzierter Virulenz im Mausmodell. Der Pyruvat-Zitronensäure-Knoten konnte demnach als ein zentraler Punkt der Virulenzregulation identifiziert werden. Der Einfluss verschiedener Antibiotika auf die Stoffflussverteilung wies darüber hinaus auf einen komplexen Zusammenhang von Metabolismus und inhärenter Resistenz hin. Die feinregulierte Anpassung des Organismus während der Infektion wurde weiterführend anhand des temperaturabhängigen Transkriptionsregulators RovA untersucht, der Gene des Metabolismus, der Stressantwort und des Virulenzprogramms der Zelle kontrolliert. Der Infektionsprozess wurde dazu in einer kontinuierlichen Kultur mit präziser Temperaturführung simuliert. Western Blot Analysen und fluoreszenzgestützte Durchflusszytometrie zeigten bistabiles Verhalten des Proteins RovA. Die daraus hervorgehende Heterogenität der Population kann die Überlebenswahrscheinlichkeit der Gesamtpopulation erhöhen.

The contemporary public and economic awareness for sustainable and ecological technologies drive the industrial development of superior biotechnological processes for bulk and fine chemicals. Regarding top-value compounds within this context, production of bio-based succinate is a highly anticipated industrial process due to its wide industrial applicability. In this work, naturally succinate producing Basfia succiniciproducens was systematically evolved towards improved production and tolerance properties. Small scale CO2-enriched sequential batch cultivations enabled for successful adaptation, evaluated by cell growth and production performance. Evolved phenotypes exhibited improved abilities to cope with the applied stress such as growing at 42 °C, at a pH of 5.2 and with 25 g L-1 succinate – conditions not feasible for the wild-type strain. In addition, they outperformed the parent strain at standard conditions in respect to growth and succinate production reaching a maximum productivity of 2.9 g L-1 h-1. Systems biology approaches were then applied to identify the underlying genotype-phenotype correlations. Most promising targets thereof were selectively introduced into defined production hosts and demonstrated clear improvements regarding temperature tolerance, productivity and cell separation. Taken together, this work is an important contribution to the breeding of superior cell factories of B. succiniciproducens for bio-based succinate production. Das öffentliche und wirtschaftliche Interesse an nachhaltigen, ökologischen Technologien ist Antrieb für die Entwicklung innovativer biotechnologischer Prozesse für Bulk- und Feinchemikalien. Ein Schwerpunkt liegt hier auf der biobasierten Herstellung von Succinat, einem Produkt mit vielfältigen Anwendungsbereichen. In dieser Arbeit wurde Basfia succiniciproducens, ein natürlicher Succinat-Produzent, zur Verbesserung der Produktions- und Toleranzeigenschaften systematisch adaptiert. Ein sequentielles Kultivierungsverfahren unter CO2-Atmosphäre ermöglichte die erfolgreiche Adaption, mit Zellwachstum und Produktivität als Indikatoren. Die generierten Phänotypen zeichneten sich durch verbesserte Stresseigenschaften gegenüber erhöhter Temperatur und Produktkonzentration sowie niedrigerem pH-Wert aus (42 °C, 25 g L-1 Succinat, pH 5.2) – Bedingungen, unter denen der Wildtyp kein Wachstum aufweist. Zudem übertrafen Wachstums- und Produktionseigenschaften unter Standardbedingungen die des Ausgangsstamms (Pmax = 2.9 g L-1 h-1). Zur Identifizierung der zugrundeliegenden Genotyp-Phänotyp Beziehungen wurden systembiologische Methoden herangezogen. Erfolgsversprechende Targets wurden in definierte Produktionsstämme eingebracht und führten zu signifikanter Verbesserung von Temperaturtoleranz, Produktivität und Zellseparation. Diese Arbeit stellt somit einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Etablierung von B. succiniciproducens als Zellfabrik für die biobasierte Succinatproduktion dar.

Das Verhalten Biologischer Systeme wird durch eine Vielzahl regulatorischer Prozesse beeinflusst, die sich auf verschiedenen Ebenen abspielen. Die Forschung an diesen Regulationen hat stark von den großen Mengen von Hochdurchsatzdaten profitiert, die in den letzten Jahren verfügbar wurden. Um diese Daten zu interpretieren und neue Erkenntnisse aus ihnen zu gewinnen, hat sich die mathematische Modellierung als hilfreich erwiesen. Allerdings müssen die Daten vor der Integration in Modelle aggregiert und analysiert werden. Wir präsentieren vier Studien auf unterschiedlichen zellulären Ebenen und in verschiedenen Organismen. Zusätzlich beschreiben wir zwei Computerprogramme die den Vergleich zwischen Modell und Experimentellen Daten erleichtern. Wir wenden diese Programme in zwei Studien über die MAP Kinase (MAP, engl. mitogen-acticated-protein) Signalwege in Saccharomyces cerevisiae an, um Modellalternativen zu generieren und unsere Vorstellung des Systems an Daten anzupassen. In den zwei verbleibenden Studien nutzen wir bioinformatische Methoden, um Hochdurchsatz-Zeitreihendaten von Protein und mRNA Expression zu analysieren. Um die Daten interpretieren zu können kombinieren wir sie mit Netzwerken und nutzen Annotationen um Module identifizieren, die ihre Expression im Lauf der Zeit ändern. Im Fall der humanen somatischen Zell Reprogrammierung führte diese Analyse zu einem probabilistischen Boolschen Modell des Systems, welches wir nutzen konnten um neue Hypothesen über seine Funktionsweise aufzustellen. Bei der Infektion von Säugerzellen (Canis familiaris) mit dem Influenza A Virus konnten wir neue Verbindungen zwischen dem Virus und seinem Wirt herausfinden und unsere Zeitreihendaten in bestehende Netzwerke einbinden. Zusammenfassend zeigen viele unserer Ergebnisse die Wichtigkeit von Datenintegration in mathematische Modelle, sowie den hohen Grad der Verschaltung zwischen verschiedenen Regulationssystemen. The behavior of all biological systems is governed by numerous regulatory mechanisms, acting on different levels of time and space. The study of these regulations has greatly benefited from the immense amount of data that has become available from high-throughput experiments in recent years. To interpret this mass of data and gain new knowledge about studied systems, mathematical modeling has proven to be an invaluable method. Nevertheless, before data can be integrated into a model it needs to be aggregated, analyzed, and the most important aspects need to be extracted. We present four Systems Biology studies on different cellular organizational levels and in different organisms. Additionally, we describe two software applications that enable easy comparison of data and model results. We use these in two of our studies on the mitogen-activated-protein (MAP) kinase signaling in Saccharomyces cerevisiae to generate model alternatives and adapt our representation of the system to biological data. In the two remaining studies we apply Bioinformatic methods to analyze two high-throughput time series on proteins and mRNA expression in mammalian cells. We combine the results with network data and use annotations to identify modules and pathways that change in expression over time to be able to interpret the datasets. In case of the human somatic cell reprogramming (SCR) system this analysis leads to the generation of a probabilistic Boolean model which we use to generate new hypotheses about the system. In the last system we examined, the infection of mammalian (Canis familiaris) cells by the influenza A virus, we find new interconnections between host and virus and are able to integrate our data with existing networks. In summary, many of our findings show the importance of data integration into mathematical models and the high degree of connectivity between different levels of regulation.

Die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle. Sie besteht aus der Atmungskette, deren vier Enzymkomplexe einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran aufbauen, und der ATP-Synthase, die diesen Gradienten zur Phosphorylierung von ADP zu ATP, der zelluläre Energieeinheit, nutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein thermodynamisch konformes OXPHOS Modell erstellt, welches auf Differentialgleichungen basiert. Dazu wurden Gleichungen entwickelt, welche die Kinetiken jedes OXPHOS-Komplexes über weite Bereiche von Substrat- und Produktkonzentrationen sowie unterschiedlichster Werte des elektrochemischen Gradientens wiedergeben. Zunächst wurden für jeden Komplex der Atmungskette kinetische Messungen in Abwesenheit des Protonengradientens durchgeführt. Für deren Beschreibung erwiesen sich Gleichungen vom Typ Michaelis-Menten als adäquat; hierbei wurden verschiedene Gleichungstypen verglichen. Anschließend wurde der Einfluss des Protonengradientens auf die kinetischen Parameter so modelliert, dass physiologisch sinnvolle Raten in dessen Abhängigkeit erzielt werden konnten. Diese neuen Ratengleichungen wurden schließlich in ein OXPHOS Modell integriert, mit dem sich experimentelle Daten von Sauerstoffverbrauch, elektrischem Potential und pH-Werten sehr gut beschreiben ließen. Weiter konnten Inhibitor-Titrationskurven reproduziert werden, welche den Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit der relativen Hemmung eines OXPHOS-Komplexes darstellen. Dies zeigt, dass lokale Effekte auf globaler Ebene korrekt wiedergeben werden können. Das hier erarbeitete Modell ist eine solide Basis, um die Rolle der OXPHOS und generell von Mitochondrien eingehend zu untersuchen. Diese werden mit zahlreichen zellulären Vorgängen in Verbindung gebracht: unter anderem mit Diabetes, Krebs und Mitochodriopathien, sowie der Bildung von Sauerstoffradikalen, die im Zusammenhang mit Alterungsprozessen stehen. Oxidative phosphorylation (OXPHOS) plays a central role in the cellular energy metabolism. It comprises the respiratory chain, consisting of four enzyme complexes that establish a proton gradient over the inner mitochondrial membrane, and the ATP-synthase that uses this electrochemical gradient to phosphorylate ADP to ATP, the cellular energy unit. In this work a thermodynamically consistent OXPHOS model was built based on a set of differential equations. Therefore rate equations were developed that describe the kinetics of each OXPHOS complex over a wide concentration range of substrates and products as well for various values of the electrochemical gradient. In a first step, kinetic measurements on bovine heart submitochondrial particles have been performed in the absence of the proton gradient. An appropriate data description was achieved with Michaelis-Menten like equations; here several types of equations have been compared. The next step consisted in incorporating the proton gradient into the rate equations. This was realized by distributing its influence among the kinetic parameters such that reasonable catalytic rates were obtained under physiological conditions. Finally, these new individual kinetic rate expressions for the OXPHOS complexes were integrated in a global model of oxidative phosphorylation. This new model could fit interrelated data of oxygen consumption, the transmembrane potential and the redox state of electron carriers. Furthermore, it could well reproduce flux inhibitor titration curves, which validates its global responses to local perturbations. This model is a solid basis for analyzing the role of OXPHOS and mitochondria in detail. They have been linked to various cellular processes like diabetes, cancer, mitochondrial disorders, but also to the production of reactive oxygen species, which are supposed to be involved in aging.

Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men., In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

Ansätze der mathematischen Modellierung ermöglichen die Analyse der dynamischen Eigenschaften biologischer Systeme und den Einfluß spezifischer Funktionen. Das Ziel dieser Arbeit ist es verschiedene Aspekte der Interaktionen zwischen Wirt und Krankheitserregern zu analysieren. In Kapitel 3 diskutiere ich ein Modell der zellulären Antwort auf Hitzeschockstress im Pilz Candida albicans. Das Modell in Form von gewöhnlichen Differentialgleichungen erörtert mehrere Aspekte des Systems, wie z.B. die erworbene Thermotoleranz und eine perfekte Anpassung an die Beanspruchung durch die Temperaturwechsel. Im Rahmen der Interaktionen zwischen Wirt und Krankheitserreger ist die Studie relevant, da die Entwicklung von Fieber eine primäre Antwort des Organismus auf eine Pilzinvasion ist. Die Dynamik von C. albicans Virulenzfaktoren, wie z.B. der Übergang vom Hefe- zum Hyphenstadium, und die Abwehrmechanismen des Wirts bestimmen den Zustand des Pilzes, d.h. ob er als Kommensale oder Krankheitserreger vorkommt. Mit Hilfe einer agenten-basierten Modellierungstechnik, in Kapitel 4, untersuche ich die Auswirkungen potenzieller medikamentöser Behandlungen von Pilzpopulationen und ihre Effektivität. In Kapitel 5 analysiere ich die Dynamik der C. albicans Hefe- und Hyphenpopulationen unter der Annahme, das zwischen den Individuen beider Populationen paarweise Wechselwirkungen bestehen, die zusätzlich von Fresszellen und Ernährungsbedingungen beeinflusst werden. Das erste Modell basiert auf den Prinzipien der Spieltheorie. Aus dieser Studie lässt sich die Hypothese aufstellen, dass sich im Verlauf der Infektion die evolutionäre Spieldynamik von der Snowdrift Spieldynamik in Richtung Gefangendilemma verschiebt. Im zweiten Modell untersuche ich die Umschaltraten zwischen Hefen und Hyphen. Das Modell zeigt, dass in Pilzpopulationen die Ausprägung verschiedener Phänotypen der Grund für die erhöhte Überlebensfähigkeit der Population sein könnte. Mathematical modeling approaches facilitate the analysis of dynamic properties of mechanisms triggering specific functions of biological systems. Through this work I aim to shed light on various aspects of host-pathogen interactions. In Chapter 3, I discuss a model of heat shock stress response activated in the fungus Candida albicans. The model in form of ordinary differential equations reveals several features of the system, such as acquired thermotolerance and a perfect molecular adaptation to the thermal insult. The study is relevant in the context of host-pathogen interactions since development of fever is a primary host response to fungal invasion. The dynamics of C. albicans virulence factors, e.g., yeast to hypha transition, and defense mechanisms of the host determine the state of the fungi, i.e. whether to act as a commensal or as a foe. Through application of an agent-based modeling technique, in Chapter 4, I investigate effects of potential drug treatments on fungal populations and their effectivity in the fungal clearance. In Chapter 5, I analyze the dynamics of candida yeast and hyphal populations assuming pairwise interactions influenced by phagocytic cells and nutritional conditions. The first model is based on game theory principles. From the study it can be hypothesized that during the course of infection the evolutionary game dynamics shift from Snowdrift game dynamics toward Prisoners’ dilemma. In the second model, I examine switching rates between yeast and hypha. The model reveals that phenotypic variations may occur in order to increase the fitness of the population.

A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ..., Das fein regulierte und kontrollierte Ablaufen zellulärer Prozesse ist essentiell für das gesunde Funktionieren einzelner Zellen, sowie der aus ihnen bestehenden Organe. Diese wiederum bedingen das Funktionieren des gesamten Organismus. Genauso vielschichtig wie die Kommunikation und Signalverarbeitung innerhalb und zwischen den Zellen, sind die Methoden um diese Vorgänge zu beschreiben und zu untersuchen. Die mathematische Modellierung zellulärer Signalverarbeitung findet im Rahmen dieser Arbeit Anwendung in der Analyse zellulärer Prozesse und Signalkaskaden in verschiedenen Organismen....

Chip-based cell biological tests are of increasing importance in the high-throughput analysis of gene functions. The cell chip technology creates microarrays of cell clusters that have been simultaneously transfected with different plasmids within a lawn of untransfected cells. The automation of experimental processes and miniaturization of assay allow the performance of several hundred transfection experiments on a single slide which significantly increases the speed of gene function analysis. However, all available cell chip-based approaches are only susceptible to the analysis of autocrine gene function. This limits the power of this method since most genes have also an impact on juxta- and paracrine cell communications which are of high relevance for many physiologic and pathologic processes. Here, we developed a novel and robust method for the highly parallel analysis of paracrine and juxtacrine cell interaction. To that goal, the cell chip technology was adapted to be per-formed with two different cell types: a producer cell which is transfected with the effector gene and subsequently secrets a paracrine mediator (effector cell), and a responder cell which is not transfected but responds to the secreted paracrine mediator (indicator cell). Spot-to-spot diffusion was prevented by a matrix overlay, ultimately allowing 192 simultaneous transfec-tion experiments for screening of paracrine gene activity to be performed on the same chip. Subsequently, we demonstrate the broad applicability and robustness of this method using (1) various indicator cell types, (2) various paracrine inducers, and (3) various indicator genes, all of which are of relevance for angiogenesis, wound healing, and cancer research. The herein described approach allows for the first time a highly parallel analysis of gene func-tions in paracrine cell interactions at the cell chip level. Due to its robustness and broad applicability in a wide range of research areas, this method holds promise to facilitate and speed up the characterisation of genes involved in heterotypic cell interactions. Chip-basierte zellbiologische Verfahren werden für die Hochdurchsatzanalyse von Genfunktionen immer wichtiger. Mit dem Zellchipverfahren wird ein Microarray bestehend aus Zellklustern, die zeitgleich mit unterschiedlichen Plasmiden transfiziert werden, hergestellt. Durch Automatisierung und Miniaturisierung des Testverfahrens können mehrere hundert Transfektionsexperimente auf einem Chip durchgeführt werden, wodurch sich die Geschwin-digkeit von Genfunktionsanalysen signifikant erhöht. Allerdings sind die derzeit verfügbaren Zellchipverfahren nur für die Untersuchung autokriner Genfunktionen geeignet. Diese Ein-schränkung stellt eine wesentliche Schwäche der bisherigen Zellchiptechniken dar, da auch juxta- und parakrine Zellkommunikation eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielen. In dieser Arbeit wurde eine neue und robuste Methode zur Untersuchung parakriner und jux-takriner Zellkommunikation im Hochdurchsatzformat entwickelt. Hierfür wurde die Zellchip-technik derart erweitert, dass anstelle von nur einer Zellart zwei unterschiedliche Zellarten eingesetzt werden: eine Effektorzelle, welche transfiziert wird und daraufhin einen parakrinen Mediator freisetzt, und eine Indikatorzelle, welche nicht transfiziert, aber durch den von der Effektorzelle freigesetzten parakrinen Mediator induziert wird. Durch Überschichten mit einer Matrix konnte die Diffusion löslicher Mediatoren auf den jeweiligen Transfektionsbereich begrenzt werden. Dies erlaubte 192 parallele Transfektionsexperimente zur Untersuchung pa-rakriner Geneffekte auf einem Zellchip durchzuführen. Die breite Anwendbarkeit und Robustheit dieser neuen Methode wurde anschließend mittels (1) unterschiedlichen Indikator-zelltypen, (2) unterschiedlichen parakrinen Mediatoren, und (3) unterschiedlichen Indikator-genen aufgezeigt. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik ermöglicht zum ersten Mal die Analyse von Gen-funktionen bei parakriner Zellkommunikation auf der Zellchipebene. Diese Methode ist in unterschiedlichen Forschungsgebieten anwendbar und könnte somit die Charakterisierung bestimmter Gene bei der Kommunikation zwischen zwei unterschiedlichen Zelltypen erheblich vereinfachen und beschleunigen.

Der parasitische Nematode Acanthocheilonema viteae kann die Immunantwort seines Wirtes abschwächen, indem er in diesem die Produktion immun-regulatorischer Cytokine Interleukin-10 (IL10) induziert. In dieser Arbeit entwickelte ich spezifische mathematische Modelle um die Mechanismen der IL10 Regulation zu erforschen. Die Annahmen des Modells waren: 1) Av17, ein immun-modulatorisches Protein von A. viteae, zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK und p38 führt; 2) Av17 induzierte IL10 ist ERK und p38 abhängig. Beide Annahmen waren in Übereinstimmung mit experimentellen Ergebnissen zur Aktivierung von ERK and p38. Weiter habe ich mehrere Signalregulationsmodelle getestet und eine Methode entwickelt, die theoretische und experimentelle Ansätze kombiniert. Von hier aus konnte ich ein Modell auswählen, dass unabhängige experimentelle Daten korrekt vorhersagt. Modelle selection identifizierten die Duale-Spezifizität Kinasen (DUSP) als integrale Rückkopplungsregulatoren dieses Systems. Eine Sensitivitätsanalyse zeigte, dass p38 durch DUSP, ERK beeinflusst, das Gegenteil aber nicht. Dieser Befund legt eine autokrine Rückkopplung der Signalkomponenten nahe, die auch experimentell bestätigt werden konnte. Allgemein müssen die immunoregulatorischen Mechanismen im Wirt robust gegen Störungen, z.B. durch Parasiten wie A. viteae, sein. Dies veranlasste mich mit Hilfe eines Monte-Carlo Ansatzes die Robustheit der ausgewählten Modelle gegenüber Variationen zu testen. Ich verglich das zuvor ausgewählte Modell und ein Modell mit transienter Rückkopplung. Das Resultat ließ darauf schließen, dass in diesem Fall die integrale Rückkopplung robuster gegenüber Variationen ist als eine transiente Rückkopplung. Insgesamt verbindet der systembiologische Ansatz meiner Arbeit erfolgreich theoretisches Wissen mit experimenteller Expertise um einen Mechanismus vorzuschlagen, der beschreibt, wie der Parasit A. viteae mit Makrophagen seines Wirtes interagiert, um IL10 Exprimierung zu induzieren. The parasitic nematode Acanthocheilonema viteae can downregulate the immune response of its host by inducing immunoregulatory cytokines such as interleukin-10 (IL10). In this thesis, I developed specific mathematical models to investigate IL10 regulation mechanisms. These models assumed that Av17, an immunomodulatory protein secreted by A.viteae, leads to the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) ERK and p38 phosphorylation and that IL10 transient expression was dependent on the activation of both MAP kinases. These assumptions were validated with experimental data on ERK and p38 activation. Further, I tested alternative ways of signalling regulation and developed a method of model selection that combines the theoretical predictions with experimental evidences. Model selection identified dual specificity phosphatase (DUSP) as integral feedback regulators in this system. Dedicated experiments showed that DUSP1 was responsible for regulation of ERK and p38 phosphorylation and controlled IL10 expression in this system. Furthermore, a sensitivity analysis suggested that p38 affects ERK via DUSP, but ERK does not affect p38, revealing a negative feedback between the components. This model prediction was validated experimentally. Generally, host immune regulation mechanisms should be robust against variations, e.g., by parasites like A. viteae. This prompted me to test the robustness of the selected model against noise, by comparing it with a transient feedback model. The results suggest that the integral feedback model is more robust against noise than the transient feedback model, in the case under study. In summary, based on a systems biology approach that successfully combines theoretical and experimental expertise, this thesis proposes a mechanism that describes how the parasite A. viteae interacts with its host macrophages to induce IL10 expression.

Der zentrale Regulator der Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR), das Katabolitkontrollprotein A (CcpA), reguliert etwa 10 % aller Gene in B. subtilis, welche neben dem Kohlenstoffmetabolismus auch in den Überflussstoffwechsel, den Stickstoff- und Phosphatmetabolismus sowie die Aminosäuresynthese involviert sind (Fujita, 2009). Um ein quantitatives Verständnis dieses weitreichenden Regulationsnetzwerks zu entwickeln, soll im Rahmen des Systembiologie-Projekts BaCell-SysMO bereits determinierte kinetische Daten der Protein-Komponenten der KKR mit der Transkriptbildungsrate in Abhängigkeit der CcpA-vermittelten Regulation vernetzt werden. Dafür wurde im ersten Schritt eine Methode für die absolute Quantifizierung der intrazellulären Transkriptkonzentration auf Basis der quantitativen real-time PCR entwickelt. Diese ermöglicht die akkurate mRNA-Quantifizierung beim Übergang zu physiologischem Stress. Die Validierung der Methodik erfolgte quantitativ mittels β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen und qualitativ mittels RNA-Hybridisierungs-experimenten. Anschließend erfolgte die Optimierung der Wachstumsbedingungen von B. subtilis in Minimalmedium ohne Aminosäurezugabe auf die maximale Wuchsrate. Unter diesen Kultivierungsbedingungen wurden mittels zeitaufgelöster Quantifizierung der Transkriptkonzentration die Rate der Akkumulierung (Summe aus Transkriptauf- und abbau) und des Abbaus der CcpA-regulierten Gene xylA und xynP ermittelt. Daraus berechnete sich die Transkriptbildungsrate, welche als Kenngröße für die Reaktion der Zelle auf die (De-)Aktivierung der KKR definiert ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die alsS-Expression in KKR-defizienten B. subtilis-Mutanten in Abhängigkeit der Kohlenstoffquelle analysiert. Anschließend wurde erörtert, über welche Wege die CcpA-abhängige Aktivierung der Expression des alsSD-Operons funktionieren könnte. The central regulator of carbon catabolite regulation (CCR), the catabolite control protein A (CcpA), regulates about 10 % of the whole genome in B. subtilis. These genes are involved in carbon metabolism, overflow metabolism, amino acid synthesis, nitrogen and phosphate metabolism (Fujita, 2009). To develop a quantitative understanding of this extensive regulatory network, available kinetic data of protein components of the CCR will be cross-linked with transcription rates of CcpA-depending regulation within the systems biology project BaCell-SysMO. Therefor, at first a real-time PCR-based method for the absolute quantification of intracellular transcript concentrations was developed. This allowed the accurate quantification of mRNA during the transition to physiological stress situations. The method was validated quantitatively via β-galactosidase activity measurements and qualitatively via RNA hybridization experiments. Then the growth conditions of B. subtilis in minimal medium without addition of amino acids were optimized to get a maximal growth rate. Using time-resolved quantification of the intracellular transcript concentration, the rate of mRNA accumulation (sum of transcript formation and decay) and the rate of mRNA decay of CcpA-regulated genes xylA and xynP were determined. Using these data the transcript formation rate was calculated, which is defined as parameter for the response to activation or deactivation of CCR in the bacterial cell. In the second part of this thesis the expression of alsS in CCR-deficient B. subtilis strains depending on the present carbon source was analysed. Further it is discussed which mechanism leads to the CcpA-dependent activation of the expression of the alsSD operon.

Ein der Biologie zugrunde liegender Prozess ist die Fortpflanzung. Einzeller wachsen dazu heran und teilen sich. Grundlage hierfür sind ausreichend Nahrung und Ressourcen, um die eigene Masse und alle Zellbestandteile, insbesondere die DNS, zu verdoppeln. Fehler bei der Wachstumsregulation oder der DNS-Verdopplung können schwerwiegende Folgen haben und stehen beim Menschen im Zusammenhang z.B. mit Krebs. In dieser Arbeit werden mathematische Modelle für die Mechanismen zur Wachstumsregulierung und DNS-Verdopplung in der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, vorgestellt. Modellierung kann entscheident zum Verstehen von komplexen, dynamischen Systemen beitragen. Wir haben ein Modell für Einzellerwachstum entwickelt und leiten das Wachstumsverhalten von Zellkulturen von diesem Modell, mittels einer hierfür programmierten Software, ab. Außerdem haben wir ein Model für die Verdopplung der DNS entwickelt, um Auswirkungen verschiedener Aktivierungsmuster auf die Replikation zu testen. Zusätzlich wurde die Verlängerung entstehender DNS Stränge, Elongation, mit einem detaillierten, stochastischen Modell untersucht. Wir haben unsere Ergebnisse zur DNS-Verdopplung mit einer abschließenden Untersuchung ergänzt, die funktionelle Beziehungen von Genen aufzeigt, welche sich in der Nähe von Aktivierungsstellen der Verdopplung befinden. Folgende Einsichten in die komplexe Koordination von Wachstum und Teilung wurden gewonnen: (i) Wachstumskontrolle ist eine inhärente Eigenschaft von Hefezellpopulationen, welche weder Signale noch Messmechanismen benötigt, (ii) DNS Verdopplung ist robuster in kleinen Chromosomen mit hoher Dichte an Aktivierungsstellen, (iii) Elongation ist weitgehend uniform, weicht aber an genau definierten Stellen signifikant ab und (iv) katabole Gene häufen sich nahe der frühen Aktivierungsstellen und anabole Gene nahe der späten. Unsere Ergebnisse tragen zum Verständniss von zellulären Mechanismen zur Wachstumskontrolle und DNS-Verdopplung bei. One of the most fundamental processes in biology is reproduction. To achieve this, single cellular organisms grow, proliferate and divide. The prerequisite for this is acquiring sufficient resources to double size and cellular components, most importantly the DNA. Defects in either sufficient gain in size or chromosomal doubling can be severe for the organism and have been related to diseases in humans, such as cancer. Therefore, the cell has developed sophisticated regulatory mechanisms to control the orderly fashion of growth and duplication. We have developed mathematical models to study systemic properties of size control and DNA replication in the premier eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae. Modeling can help understanding the complex nature of dynamic systems. We provide a single cell model to explore size control. We deduced population behavior from the single cell model through multi-cell simulations using a tailor-made software. Also, we implemented an algorithm that simulates the DNA replication process to test the impact of different replication activation patterns. Additionally, elongation dynamics were assessed with a fine-grained stochastic model for the replication machinery motion. We complemented our analysis of DNA replication by studying the functional association of genes and replication origins. Our systems-level analysis reveals novel insights into the coordination of growth and division, namely that (i) size regulation is an intrinsic property of yeast cell populations and not due to signaling or size sensing, (ii) DNA replication is more robust in small chromosomes with high origin density, (iii) the elongation process is strongly biased at distinct locations in the genome and (iv) catabolic genes are over-represented near early origins and anabolic genes near late origins. Our results contribute to explaining mechanisms of size control and DNA replication.

Systems biology looks for emergent system effects from large scale assemblies of molecules and data, for instance in the human platelets. However, the computational efforts in all steps before such insights are possible can hardly be under estimated. In practice this involves numerous programming tasks, the establishment of new database systems but as well their maintenance, curation and data validation. Furthermore, network insights are only possible if strong algorithms decipher the interactions, decoding the hidden system effects. This thesis and my work are all about these challenges. To answer this requirement, an integrated platelet network, PlateletWeb, was assembled from different sources and further analyzed for signaling in a systems biological manner including multilevel data integration and visualization. PlateletWeb is an integrated network database and was established by combining the data from recent platelet proteome and transcriptome (SAGE) studies. The information on protein-protein interactions and kinase-substrate relationships extracted from bioinformatical databases as well as published literature were added to this resource. Moreover, the mass spectrometry-based platelet phosphoproteome was combined with site-specific phosphorylation/ dephosphorylation information and then enhanced with data from Phosphosite and complemented by bioinformatical sequence analysis for site-specific kinase predictions. The number of catalogued platelet proteins was increased by over 80% as compared to the previous version. The integration of annotations on kinases, protein domains, transmembrane regions, Gene Ontology, disease associations and drug targets provides ample functional tools for platelet signaling analysis. The PlateletWeb resource provides a novel systems biological workbench for the analysis of platelet signaling in the functional context of protein networks. By comprehensive exploration, over 15000 phosphorylation sites were found, out of which 2500 have the corresponding kinase associations. The network motifs were also investigated in this anucleate cell and characterize signaling modules based on integrated information on phosphorylation and protein-protein interactions. Furthermore, many algorithmic approaches have been introduced, including an exact approach (heinz) based on integer linear programming. At the same time, the concept of semantic similarities between two genes using Gene Ontology (GO) annotations has become an important basis for many analytical approaches in bioinformatics. Assuming that a higher number of semantically similar gene functional annotations reflect biologically more relevant interactions, an edge score was devised for functional network analysis. Bringing these two approaches together, the edge score, based on the GO similarity, and the node score, based on the expression of the proteins in the analyzed cell type (e.g. data from proteomic studies), the functional module as a maximum-scoring sub network in large protein-protein interaction networks was identified. This method was applied to various proteome datasets (different types of blood cells, embryonic stem cells) to identify protein modules that functionally characterize the respective cell type. This scalable method allows a smooth integration of data from various sources and retrieves biologically relevant signaling modules., Systembiologie sucht nach Systemeffekten in großflächigen Anordnungen von Molekülen und Daten, beispielsweise in menschlichen Blutplättchen. Allerdings kann der Rechenaufwand in den Schritten, die für solche Einsichten nötig sind, kaum unterschätzt werden. In der Praxis umfasst dies zahlreiche Programmieraufgaben, die Einrichtung neuer Datenbanksysteme, sowie deren Wartung, aber auch die Pflege und Validierung der vorgehaltenen Daten. Zudem sind Netzwerkeinsichten nur möglich, wenn effiziente und gute Algorithmen für versteckte Systemeffekte oder auch codierende Wechselwirkungen entschlüsseln. Diese Dissertation und meine Arbeit sind auf diese Herausforderungen konzentriert. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde ein integriertes Thrombozytennetzwerk, PlateletWeb, aus verschiedenen Quellen zusammengestellt und weiterhin auf Signalverarbeitung und –weitergabe einschließlich mehrstufiger Datenintegration und Visualisierung systembiologisch analysiert. PlateletWeb ist eine integrierte Netzwerkdatenbank, die durch die Kombination von Daten aus den neuesten Thrombozyten Proteom und Transkriptom (SAGE) Studien etabliert wurde. Information über Protein-Protein-Wechselwirkungen und Kinase-Substrat-Paaren wurde aus bioinformatischen Datenbanken hinzugefügt, extrahierte Daten aus der veröffentlichten Literatur ergänzten dies weiter. Darüber hinaus wurde das Blutplättchen-Phosphoproteom aufgrund von Daten aus der Massenspektroskopie mit ortsspezifischen Phosphorylierungs-/ Dephosphorylierungsdaten kombiniert. Ergänzt wurde dies um Daten aus der Datenbank Phosphosite und durch bioinformatische Sequenzanalyse unter Nutzung ortsspezifischer Kinasevorhersagen. Die Zahl der katalogisierten Thrombozytenproteine wurde im Vergleich mit der Vorversion von 2008 um mehr als 80% erhöht (beinahe Verdoppelung der Daten, insbesondere aber neue, zusätzliche Datenkategorien, z.B. über Pharmaka, Phosphorylierung, Gen-Ontologie, daneben auch weitere Validierung und Pflege der vorhandenen Daten). Die neue Integration von Annotationen für Kinasen, Proteindomänen, Transmembranregionen, Gene Ontology, Krankheitsbezüge und Azneimittelziele bietet neue, mächtige Werkzeuge für die funktionelle und systembiologische Analyse von Thrombozytensignalwegen. Die PlateletWeb Datenbank liefert eine neuartige systembiologische Werkbank zur Analyse von medizinisch relevanten Blutplättchensignalen (z.B. Plättchenaktivierung bei Thrombose, Hämostase etc.) im funktionellen Zusammenhang von Proteinnetzwerken. Durch umfassende Untersuchungen wurden über 15000 Phosphorylierungsstellen identifiziert, von denen 2500 einer Kinase zugeordnet werden konnten. Netzwerkmotive wurden auch in diesen Zellen ohne Zellkern untersucht und neue und interessante Signalmodule charakterisiert. Dies war nur durch die integrierte Information über Phosphorylierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen möglich. Darüber hinaus wurden zahlreiche algorithmische Ansätze verwand, darunter ein exakter Ansatz zur Bayesschen Analyse von Interaktionsnetzwerken (Heinz) basierend auf linearer Integer-Programmierung. Gleichzeitig hat sich unser Konzept der semantischen Ähnlichkeiten zwischen zwei Genen basiert auf Gene Ontology (GO) Annotationen etabliert und ist eine wichtige Grundlage für viele analytische Ansätze in der Bioinformatik geworden. Unter der Annahme, dass eine höhere Anzahl von semantisch ähnlichen funktionellen Genannotationen biologisch relevantere Interaktionen reflektieren, wurde eine Bewertung der Kanten für funktionelle Netzwerkanalyse entwickelt. Die Kombination beider Ansäte, die Kantenbewertung, basierend auf der GO-Ähnlichkeit und die Netzknotenbewertung bezogen auf die Expression der Proteine ermöglichte in den analysierten Zelltypen (unter Nutzung von Daten z.B. aus Proteomstudien) die Identifizierung funktioneller Module als maximal bewertete Subnetzwerke in großen Proteinnetzwerken. Dieses Verfahren wurde an verschiedenen Proteomdatensätzen getestet (verschiedene Arten von Blutzellen, embryonale Stammzellen), um Proteinmodule zu identifizieren, die funktionell den jeweiligen Zelltyp charakterisieren. Weitere Ansätze der Methode erfassen die Analyse von quantitativen Phosphoproteom-Daten zur Identifizierung des Signalflusses in einem Kinase-Substrat Netzwerk. Diese skalierbaren Ansätze ermöglichen eine reibungslose Integration von Daten aus verschiedenen Quellen und liefern biologisch relevante Signalmodule.

Ca(2+)-Ionen sind ein universeller sekundärer Botenstoff in eukaryotischen Zellen und übertragen Information durch wiederholte, kurzzeitige Erhöhungen der cytosolischen Ca(2+)-Konzentration (Ca(2+) Spikes). Ein bekannter Mechanismus, der solche Ca(2+)-Signale erzeugt, beinhaltet die Freisetzung von Ca(2+)-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum durch IP3-sensitive Kanäle. Puffs sind elementare Ereignisse der Ca(2+)-Freisetzung durch einzelne Cluster von Ca(2+)-Kanälen. Intrazelluläre Ca(2+)-Dynamik ist ein stochastisches System, allerdings konnte bisher keine vollständige stochastische Theorie entwickelt werden. Die vorliegende Dissertation formuliert die Theorie mit Hilfe von Interpuffintervallen und Pufflängen, da diese Größen im Gegensatz zu den Eigenschaften der Einzelkanäle direkt messbar sind. Die Theorie reproduziert das typische Spektrum bekannter Ca(2+)-Signale. Die Signalform und das durchschnittliche Interspikeinterval (ISI) hängen sensitiv von den genauen Eigenschaften und der räumlichen Anordnung der Cluster ab. Im Gegensatz dazu hängt die Beziehung zwischen Mittelwert und Standardabweichung der ISI weder von den Clustereigenschaften noch von der räumlichen Anordnung ab, sondern wird lediglich von globalen Feedbackprozessen im Ca(2+)-Signalweg reguliert. Diese Beziehung ist essentiell für die Funktion des Signalwegs, da sie trotz der Zufälligkeit der ISI eine Frequenzkodierung ermöglicht und den maximalen Informationsgehalt der Spikesequenzen bestimmt. Neben der theoretischen Analyse enthält die vorliegende Arbeit auch experimentelle Puff- und Spikemessungen an lebenden HEK-Zellen, die wichtige Ergebnisse verifizieren. Insgesamt wird durch die integrierte theoretische und experimentelle Untersuchung auf verschiedenen Stufen molekularer Organisation gezeigt, dass stochastische Ca(2+)-Signale verlässliche Informationsträger sind, und dass der Mechanismus durch globalen Feedback an die spezifischen Anforderungen eines Signalpfads angepasst werden kann. Ca(2+) is a universal second messenger in eukaryotic cells transmitting information through sequences of concentration spikes. A prominent mechanism to generate these spikes involves Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum Ca(2+) store via IP3-sensitive channels. Puffs are elemental events of IP3-induced Ca(2+) release through single clusters of channels. Intracellular Ca(2+) dynamics are a stochastic system, but a complete stochastic theory has not been developed yet. As a new concept, this thesis formulates the theory in terms of interpuff interval and puff duration distributions, since unlike the properties of individual channels, they can be measured in vivo. This leads to a non-Markovian description of system dynamics, for which analytical solutions and efficient stochastic simulation techniques are derived. The theory reproduces the typical spectrum of Ca(2+) signals. Signal form and average interspike interval (ISI) depend sensitively on detailed properties and spatial arrangement of clusters. In difference to that, the relation between the average and the standard deviation of ISIs does not depend on cluster properties and cluster arrangement, and it is robust with respect to cell variability. It can only be regulated by global feedback processes in the Ca(2+) signalling pathway. That relation is essential for pathway function, since it ensures frequency encoding despite the randomness of ISIs and determines the maximal spike train information content. Apart from the theoretical investigation, this thesis verifies key results by live cell imaging of Ca(2+) spikes and puffs in HEK cells. Hence, this work comprises a systems level investigation of Ca(2+) signals, integrating data and theory from different levels of molecular organisation. It demonstrates that stochastic Ca(2+) signals can transmit information reliably, and that the mechanism can be adapted to the specific needs of a pathway by global feedback.

Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung einer modifizierten Form des klassichen SILAC-Verfahrens, das in der quantitativen Massenspektrometrie zur Bestimmung von relativen Änderungen in Proteinmengen benutzt wird. Im sog. „pulsed SILAC (pSILAC)“ Verfahren werden Zellen im Zuge einer differentiellen Behandlung in Kulturmedien transferiert, die unterschiedlich Isotop-markierte Aminosäuren enthalten. Da hier die Quantifizierung auf dem Verhältnis der neusynthetisierten Proteinmengen beruht, können gezielt Unterschiede in der Proteinproduktion bestimmt werden. Mit Hilfe von pSILAC konnte im zweiten Teil der Arbeit erstmals quantitativ erfasst werden, welchen Einfluss microRNAs auf die Proteinsynthese ausüben. So konnte gezeigt werden, dass sowohl die Überexpression als auch die Repression einzelner microRNAs die Produktion hunderter Proteine beeinflussen kann. Außerdem konnten Genprodukte identifiziert werden, die ausschließlich translational reguliert werden. Die Messung von Proteinneusynthese ermöglichte auch die Bestimmung von Proteinumsatzraten, dargestellt im dritten Teil der Arbeit. Zusammen mit mRNA-Umsatzraten sowie Protein- und mRNA-Mengen bilden sie die Grundlage für eine dynamische Beschreibung zelluärer Genexpression. Durch den gleichzeitigen Einsatz des Nukleosidanalogons 4-Thiouridin (4sU) und von schweren Aminosäuren (SILAC) konnte eine metabolische Markierung neusynthetiserter mRNAs und Proteine in murinen Fibroblasten erreicht und damit eine Berechnung von Protein- und mRNA-Halbwertszeiten und absoluten Mengen für ca. 5,000 Gene ermöglicht werden. Während mRNA- und Proteinenmengen deutlich korrelierten, war zwischen mRNA- und Proteinhalbwertszeiten nur eine äußerste schwache Korrelation zu erkennen. Dennoch stehen mRNA- und Proteinumsatzraten nicht einem willkürlichen Zusammhang zu einander, da bestimmte Kombinationen von mRNA- und Proteinhalbwertszeiten eine Optimierung von Genen hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen erkennen ließen. The first part of the thesis describes the establishment of a modified version of the classic SILAC approach routinely used in quantitative mass spectrometry (MS) to assay relative changes in protein levels. In the newly-devised approach termed pulsed SILAC (pSILAC) differentially treated cells are transferred to culture medium supplemented with different versions of stable-isotope labeled heavy amino acids. As MS-based relative quantification is exclusively based on the newly-synthesized heavy protein amounts the method enables the detection of differences in protein production resulting from the treatment. The second part of the thesis shows the use of pSILAC to globally quantify the impact of microRNAs onto the proteome. Ectopic over-expression or knock-down of a single microRNA both affected protein production of hundreds of proteins. pSILAC identified several target genes as exclusively translationally regulated as changes in corresponding transcript levels were virtually absent. Measuring newly-synthesized protein amounts with heavy amino acids in a pulsed-labeling fashion has also been used to determine turnover rates of individual proteins, described in the third part of the present work. Along with transcript turnover as well as mRNA and protein levels they are essential for a dynamic description of gene expression. Simultaneous application of the nucleoside analogue 4-thiouridine (4sU) and heavy amino acids (SILAC) to metabolically label newly-produced mRNAs and proteins in mouse fibroblasts resulted in the calculation of mRNA and protein lifetimes and absolute levels for approximately 5,000 genes. While mRNA and protein levels were overall well correlated, a correlation between mRNA and protein half-lives was virtually absent. Yet this seemingly chaotic distribution of mRNA and protein half-lives was highly instructive since specific gene subsets have obviously evolved distinct combinations of half-lives that relate to their biological functions.

Mathematische Modellierung ist ein wichtiges Werkzeug biologischer Forschung geworden, was sich in der Entstehung von Systembiologie widerspiegelt. Eine erfolgreiche Anwendung mathematischer Methoden auf biologische Fragen erfordert die Zusammenarbeit zwischen experimentell und theoretisch arbeitenden Wissenschaftlern, auch um sicherzustellen, dass die Biologie im Modell adäquat dargestellt wird. Ich präsentiere hier zwei Untersuchungen zur Anpassung von Saccharomyces cere- visae an hyperosmotische Bedingungen: Eine biologisch detailgetreue Beschreibung der Signaltransduktion zur Aktivierung von Hog1 und ein Model, das Anpassung an osmotischen Stress in zellulärem Zusammenhang beschreibt. Die Studie zur Osmoadaptation in zellulären Kontext impliziert, dass Hog1 und Fps1, zwei wichtige Bausteine dieses Adaptationsvorgangs, miteinander in Wechselwirkung treten und dies zur Anpassung beiträgt. Dieses Ergebnis wird durch die Integration verschiedener Hefestämme mit zum Teil gegensätzlich wirkenden Mutationen ermöglicht. Diese Studie offenbart des weiteren, dass die Rolle von Glycerol in der langfristigen Anpassung bisher überschätzt wurde. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Glycerol als ’Not’-Osmolyt eingesetzt wird und andere Stoffe, z.B. Trehalose, erheblich zu dauerhafter Osmoadaptation beitragen. Durch die Betrachtung des Zustands mehrerer zellulärer Mechansimen wird deutlich, dass Osmoadaptation stark vom Kontext abhängig ist und nicht perfekt ist. Der Preis schlägt sich in langsamerem Wachstum nieder. Zeitabhängige Sensitivitätsanalyse des Modells untermauert diese Hypothese. Die gewählte Perspektive ermöglicht die Betrachtung von intrazellulären Signaltransduktionskomponenten, Metaboliten und des Wachstums. Der Vergleich mit einer Studie, die Anpassung an osmotischen Stress als perfekte Adaptation auf Grund eines vereinfachten Modells beschreibt, hebt die Rolle der gewählten Perspektive zum Verständnis biologischer Systeme hervor. Mathematical modeling has become an important tool in biology, reflected in the emergence of systems biology. Successful application of mathematical methods to biological questions requires collaboration of experimental and theoretical scientists to identify and study the problem at hand and to ensure that biology and model match. In this thesis, I present two studies on adaptation to hyperosmotic conditions in the yeast Saccharomyces cerevisae: A biologically faithful description of the signaling pathways activating Hog1 and a model integrating the effects of Hog1-activity and cellular metabolism, describing osmoadaptation in cellular context. The study of osmoadaptation in cellular context suggests that Hog1 and Fps1, two crucial components of adaptation, interact upon hyperosmotic stress. This finding is facilitated by incorporating multiple strains with mutations leading to partly oppositional phenotypes. This study further reveals that the role of glycerol in long term adaptation has been overestimated so far. According to the results presented here, glycerol is utilized as an ’emergency’ osmoprotectant and other compounds, e.g. trehalose, contribute significantly to osmoadaptation. Accounting for the state of multiple cellular mechanisms (Hog1-activity, glycolysis, growth) shows that adaptation to hyperosmotic stress and the impact of the individual mechanisms of adaptation is context dependent and that adaptation to sustained osmostress is not perfect, the expense reflected in a reduced growth rate in hyperosmotic medium. Time-dependent sensitivity analysis supports the notion of context. The perspective chosen allows observations on intracellular signaling components, metabolites and growth speed. Comparison with a study that describes osmoadaptation as perfect adaptation highlights the role of this perspective for the conclusions drawn, thus emphasizing the importance of an integrative perspective for understanding biological systems.

Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten., Apoptosis of liver cells is dependent on external signals such as components of the extracellular matrix and cell-cell-contacts, which are processed by a variety of numerous nodes of which several are examined here for their system effects. Despite different input interferences and presumably also due to natural selecti- on, the system nevertheless appears to be optimized to adopt a small number of clear and distinguishable states, and the various inputs and crosstalk mechanisms only optimize the best choice between them. For the model described within this work, two nonapoptotic and two apoptotic states are found, although the degree of activation at a node can differ widely until the absolute system state is altered (Philippi et al., BMC Systems Biology, 2009) [1]. The model is still a simplification of the complete cellular network and its different states, and operates independently of detailed kinetic data and parameters for individual nodes. Nevertheless, it allows modeling the readout of apoptosis after FasL stimulation with qualitative agreement and includes crosstalks from collagen/integrin signa- ling, the effect of genetic deletion of Bid and the consequences of viral infection. The second part of this work deals with other applications using this method. Semi-quantitative models are used for hormonal signaling in plants, viral infec- tions and intra-cellular communication. The simulated results fit to the experi- mental data provided.

ISBN:978-3-909386-21-5