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Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten., Pemphigus vulgaris (PV) is a blistering autoimmune disease characterised by antibodies directed against Dsg1 (desmoglein 1) and Dsg3 (desmoglein 3). The exact pathomechanism leading to PV-IgG induced loss of intercellular adhesion is still unclear. The Dsg3-depletion and the modulation of signaling pathways are characteristics of the disease. With the results of this study, a better classification of Dsg3-depletion in the pathogenetic context of pemphigus vulgaris becomes possible. The experiments show that the Dsg3-depletion is dependent on differentiation processes and can be accompanied by a loss of adhesion. Inhibition of PKC in this case prevents PV-IgG-mediated effects in the cell culture as well as blistering in murine skin in vivo and in human skin ex vivo. Furthermore, this work provides new insights that could be significant for the suprabasal localisation of blistering.

Die vorliegende Dissertation hatte zum Ziel, die Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Expression von Interleukin-18 mRNA sowie die Sekretion von Interleukin-18 Protein in primären humanen Keratinozyten mittels qPCR bzw. ELISA zu untersuchen. In mehreren Versuchsreihen wurde eine zeitabhängige Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Interleukin-18 Produktion in einem Zeitraum von 4 bis 96 Stunden untersucht und ein signifikanter Abfall nach 4 Stunden sowie ein signifikanter Anstieg ab 24 Stunden bei Inkubation mit Lithium Chlorid festgestellt. Bei Flagellin zeigte sich kein statistisch signifikanter Effekt. Eine Konzentrationsreihe von 1 bis 40 mmol Lithium Chlorid konnte eine Wirkung auf die Interleukin-18 mRNA Expression, nicht aber auf die Proteinsekretion zeigen. Hohe Konzentrationen von Lithium Chlorid und lange Inkubationszeiten (96 Stunden) waren jedoch Auslöser zytotoxischer Reaktionen. Insgesamt konnte allerdings keine signifikante Wirkung von Lithium Chlorid auf Expression sowie Sekretion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten nachgewiesen werden. Damit erscheint eine pathophysiologisch relevante Induktion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten isoliert durch Lithium Chlorid oder Flagellin als Erklärung für eine Exazerbation oder Manifestation der Psoriasis unwahrscheinlich.

Die durch den demografischen Wandel ständig ansteigende Inzidenz an Patienten mit chronischen Wunden stellt ein großes gesellschaftliches und gesundheitsökonomisches Problem dar. Ziel dieser Arbeit ist es, die PRF-Applikation mit autolog kultivierten Keratinozyten zu kombinieren, um so eine verbesserte Wundheilung zu erreichen und eine neue Behandlungsmöglichkeit bei Patienten mit chronischen Wunden zu schaffen. Um eine breite klinische Anwendung zu ermöglichen, steht die Optimierung und Beschleunigung des Isolierungsverfahrens von Keratinozyten im Mittelpunkt dieser Dissertation. Dazu wurden versuchsweise in Lokalanästhesie kleine Hautproben vom Oberschenkel der Patienten entnommen und im Labor kultiviert. Durch Erfahrungen anderer Protokolle sowie eigene Ergebnisse wurde ein neues Isolierungsprotokoll entwickelt. Die korrekte Differenzierung der Zellen konnte molekularbiologisch bestätigt werden. Nach histologischer Auswertung zeigten sich eine gleichmäßige Verteilung und Vitalität der im Co-Delivery-Verfahren aufgesprühten Zellen. In einem letzten Schritt erfolgten zwei individuelle Heilversuche am Patienten. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Optimierung und Verbesserung der Keratinozyten-Isolierung. Die Fragestellungen bzw. Ziele bezüglich der Verkleinerung der am Patienten zu entnehmenden Hautprobe, des verbesserten sowie regelhaften Anwachsens der isolierten Keratinozyten und vor allem der Verkürzung der Kultivierungsdauer in Hinblick auf eine spätere klinische Anwendung bei Patienten mit chronischen Wunden konnten positiv beantwortet werden. Der individuelle Heilversuch am Patienten konnte eine deutliche Verkleinerung der Wundfläche auf Niveau der intakten Haut zeigen. Zudem traten keine Infektionen auf, sodass die Applikation von Keratinozyten im Co-Delivery-Verfahren mit PRF eine vielversprechende alternative Therapieoption bei chronischen Wunden darstellt

Die menschliche Haut hat neben anderen Mechanismen antimikrobielle Proteine (AMP) als chemische Barriere gegen Mikroorganismen entwickelt. Ziel der Arbeit war es, die Induzierbarkeit von AMP (Rnase7, Psoriasin, hBD-2, hBD-3) durch Zytokine, bzw. Zytokinkombinationen in humanen Keratinozyten zu analysieren. Die Proteinsekretion der AMP nach Stimulation wurde mittels ELISA bestimmt, die Analyse der Induktion der mRNA-Expression erfolgte mittels „real-time“-RT-PCR. Die Kombination von IFN-? mit IL-17 war besonders potent, um die Protein - und Genexpression der AMP RNase7, hBD-2 und hBD-3 synergistisch zu induzieren. Für Psoriasin ließ sich kein synergistischer Effekt durch diese Zytokinkombination nachweisen. IFN-? mit IL-1ß war hier die einzig potente Kombination. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit die Kombination von Zytokinen, v. a. IFN-? plus IL-17 als sehr potenter Induktor der AMP Expression von RNase-7, hBD-2 und hBD-3 in humanen Keratinozyten identifiziert werden.

Ziel der Arbeit war, die Expression und Funktionalität von TLRs auf Keratinozyten anhand der Zelllinien PAM 212 und HaCaT zu bestimmen sowie die Interaktion mit dem immunmodulierenden POMC-System der Haut zu untersuchen. Mittels RT-PCR konnte die Expression der TLRs 1, 2, 4 und 6 in den PAM 212 Zellen nachgewiesen werden. Da nach rezeptorspezifischer Stimulation (Pam3Cys, Poly (I:C), LPS, Flagellin) eine vermehrte Zytokinexpression (IL-6, IL-8, CXCL-2) in der real-time PCR sowie eine verstärkte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK 1/2 und p38 im Western Blot nachgewiesen werden konnte, war die Funktionalität der Rezeptoren in beiden Zelllinien anzunehmen. Jedoch konnte eine mittels Immunfluoreszenz detektierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nf-kB nur nach Stimulation mit Flagellin in den HaCaTs gezeigt werden. Weitere Versuche deuten darauf hin, dass das POMC-System über eine Erhöhung der cAMP Konzentration die TLR-vermittelte Entzündungsreaktion in beiden Zelllinien beeinflusst.

Human mesenchymal stem cells (hMSC) are able to differentiate into mature cells of various mesenchymal tissues. Recent studies have reported that hMSC may even give rise to cells of ectodermal origin. This indication of plasticity makes hMSC a promising donor source for cell-based therapies. This study explores the differentiation potential of hMSC in a tissue-specific microenvironment simulated in vitro. Human MSC were cultured air-exposed on dermal equivalents (DEs) consisting of collagen types I and III with dermal fibroblasts and subjected to similar conditions used for tissue engineering of skin with keratinocytes. Culture conditions were additionally modified by pre-treating the cells with 5-azacytidine or supplementing the medium with all trans retinoic acid. Human MSC were capable of adaptation to epidermis-specific conditions without losing their mesenchymal multipotency. However, despite the viability and evident three-dimensional epidermis-like growth pattern, hMSC showed a persistent expression of mesenchymal but not of epithelial markers, thus indicating a lack of epidermal (trans) differentiation. Further, electron microscopy and immunohistochemical analyses demonstrated that hMSC cultured under epidermis-specific conditions adopted myofibroblastic phenotype and function, promoted in particular by air-exposure. In conclusion, multipotent hMSC failed to differentiate into E-cadherin- or cytokeratin-expressing cells under optimized organotypic culture conditions for keratinocytes but differentiated into myofibroblast-like cells contracting the extracellular matrix, a phenomenon which was enhanced by retinoic acid and 5-azacytidine. These results indicate that hMSC might contribute to wound healing processes by extracellular matrix reorganization and wound contraction but not by differentiation into keratinocytes.

Der humane Stammzellfaktor (SCF) ist ein zentraler Wachstumsfaktor für Mastzellen in der Dermis und für Melanozyten in den Basalzellschichten der Epidermis. Er wird u. a. von Keratinozyten produziert. In dieser Arbeit wurde die mögliche Regulation der Expression von SCF aus Keratinozyten durch All-Trans-Retinsäure (RA) und Dexamethason in vitro an Hand der HaCaT-Zelllinie untersucht. Die HaCaT-Zellen wurden mit den beiden o. g. Substanzen (10 hoch -5 M bis 10 hoch -9 M) über 24 Stunden und 11 Tage inkubiert. Die Auswertung der HaCaT-Zellzahl, des Gesamt-Proteins SCF, dessen Splicevarianten (mSCF, sSCF) und der Rezeptoren von RA (RAR-alpha, -beta, -gamma) und von Dexamethason (GR-alpha, -beta) erfolgte mittels ELISA und RT-PCR. Dabei ergaben sich folgende Resultate: RA bewirkt einen Anstieg von SCF, Dexamethason bewirkt bei Kurzinkubation eine deutliche Zunahme von SCF, bei Dauerinkubation einen starken Abfall. Die RA-Rezeptoren RA-alpha und -gamma waren nach Inkubation mit RA verstärkt nachzuweisen; die Glukokortikoid-Rezeptoren GR-alpha und -beta zeigten nach Inkubation mit Dexamethason ebenfalls eine vermehrte Expression. Die Expression des Mastzellwachstumsfaktors SCF könnte deshalb unter physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bedingungen durch Retinoide und Glukokortikoide reguliert sein. The human stem cell factor (SCF) is a crucial growth factor for mast cells in the dermis and for the melanocytes in the basal layers of the epidermis. SCF is produced, among others, by keratinocytes. This study examines the possible regulation of the expression of SCF from keratinocytes by all-trans retinoic acid (RA) and dexamethasone in vitro by the keratinocyte cell line HaCaT. The HaCaT-cells were incubated for 24 hours or 11 days, respectively, with one of the above mentioned substances (10 to the power of -5 M to 10 to the power of -9 M). The analysis of the number of HaCaT-cells, of the total SCF protein, its splice variants (mSCF, sSCF), the receptors of RA (RAR-alpha, -beta, -gamma), and of the dexamethasone (GR-alpha, -beta) was done by ELISA and RT-PCR. The following results were found: RA induces an increase of SCF, dexamethasone at a short incubation period a considerable increase of SCF, and at long-term incubation a strong decrease. The RA-receptors RA-alpha und -gamma expression is increased after incubation with RA, and the glucocorticoid-receptors GR-alpha and -beta after the incubation with dexamethasone. Therefore, it is probable that the increase of the mast cell growth factor SCF under physiological, pathological and therapeutic conditions could be regulated by retinoic acid and glucocorticoids.

Die befallene sowie die unbefallene Haut von Patienten mit atopischem Ekzem weist in vivo, im Vergleich zur Haut gesunder Probanden, ein erhöhtes Chemilumineszenzsignal nach UVA-Bestrahlung auf. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, welche Bestandteile der menschlichen Haut für die erhöhte Chemilumineszenz (CL) nach UVA-Bestrahlung verantwortlich sein können. Die Chemilumineszenz der Haut ist unseren Untersuchungen zufolge nicht auf die zellulären Bestandteile der Epidermis und Dermis zurückzuführen, da in vitro weder an primär isolierten noch an etablierten Keratinozyten oder Fibroblasten eine UVA-induzierte CL gemessen werden konnte. Unter Verwendung eines Lipidoxidationsmodells konnte nach einer Bestrahlung von Riboflavin und Linolsäure CL detektiert werden, die sich abhängig sowohl von der Riboflavin- als auch von der Linolsäurekonzentration zeigte, wobei vor allem Superoxidanionen für das entstandene CL-Signal verantwortlich waren. Auch Histidin, sowie die cis- und die trans- UCA, neben ihrer UV-Filterfunktion, und Eisen können eine vermehrte Sauerstoffradikalbildung induzieren, wobei unseren Untersuchungen zufolge ebenfalls vor allem die Superoxidanionen für die entstehenden CL-Signale verantwortlich sind. Unsere Untersuchungen belegen, daß verschiedene Strukturen in der Haut für die Sauerstoffradikalbildung nach UV-Bestrahlung verantwortlich sind. Neben einem veränderten Antioxidantienstatus können eine Veränderungen im Lipidstatus, eine Erhöhung des Histidins, eine Verringerung des UCA-Gehaltes als UV-Absorber und ein erhöhter Eisengehalt bei Patienten mit atopischem Ekzem für eine erhöhtes Chemilumineszenzsignal verantwortlich sein. Both lesional and non-lesional skin of patients with atopic eczema is characterized by an increased chemiluminescence(CL)-signal after ultraviolet(UV)-A irradiation in comparison to healthy non-atopic individuals. Skin structures responsible for this ef-fect are not known at the moment. After irradiation with UVA, CL could neither be detected in HaCat keratinocytes nor in keratinocytes or fibroblasts from primary cell cultures of patients with or without atopic eczema. In contrast, after irradiation of li-noleic acid and riboflavin, histidine, trans-urocanic acid and trans-cis-urocanic acid CL was found. In order to identify the reactive form of oxygen, inducing the CL-signal, the antioxidants superoxide dismutase and catalase were added to the assay before UVA-irradiation. Only the addition of superoxide dismutase showed a clear CL-decrease. Based on these results, various structures of the skin are involved in the formation of oxygen radicals (especially superoxide radicals) after ultraviolet-irradiation. In addition to a different status of antioxidants, the reasons for an increased CL-signal in the skin of patients with atopic eczema could be a changed lipid status, an increase of histidine, a decrease of urocanic acid as an absorber of UVA and an in-creased concentration of ferrous ions.

Trotz mikrobieller Besiedlung kommt es relativ selten zu Infektionen der Haut. Einen wichtigen Grund dieser natürlichen Resistenz stellen durch Mikroorganismen induzierbare antimikrobielle Proteine wie hBD-2 dar. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Haut in der Lage ist, zwischen verschiedenen Mikroorganismen zu differenzieren. Dazu wurde die differentielle Genexpression in Keratinozyten nach Kontakt mit verschiedenen mikrobiellen Stimuli analysiert. Mithilfe der Systematischen Differential Display-PCR wurde IFIT4 als ein Gen identifiziert, welches in Keratinozyten v.a. durch P.aeruginosa-Überstände induzierbar ist, während S.aureus- und C.albicans-Überstände IFIT4 nicht induzieren. Anhand von Microarray-Analysen und der Suppressiven Subtraktiven Hybridisierung wurde der Einfluss hBD-2-induzierender und hBD-2-inhibierender P.aeruginosa-Kulturüberstände auf die Keratinozytengenexpression untersucht. Während hBD-2-induzierende Überstände vornehmlich antimikrobielle Proteine induzieren, induzieren hBD-2-inhibierende Überstände auch Gene der adaptiven Immunabwehr. Letzteres ist als Schutz vor Infektionen trotz eingeschränkter angeborener Immunabwehr zu werten.

Obwohl Epithelien wie die menschliche Haut permanent einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen ausgesetzt sind, kommt es nur relativ selten zu Infektionen. Einen wichtigen Aspekt dieser natürlichen Resistenz stellen die durch Bakterien wie P. aeruginosa induzierbaren antimikrobiellen Proteine, wie z.B. HBD-2, dar. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht, dass diese Induktion insbesondere durch die Kulturüberstände Nähstoff-limitierter, statischer Kulturen mit mukoiden, adhärenten Phänotypen erfolgt. Eine molekulare Analyse der bakteriellen induzierenden Faktoren ergab, dass es sich um anionische, hydrophobe Moleküle mit einer Masse >75kD handelt. Zudem scheinen bakterielle Rhamnolipide für eine Induktion von antimikrobiellen Proteinen und proinflammatorischen Zytokinen von Bedeutung zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass einige Faktoren scheinbar selektiv eine Induktion antimikrobieller Proteine bewirken. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem erstmalig ein Prinzip der bakteriellen Inhibition der Expression antimikrobieller Proteine beschrieben werden. Diese Inhibitoren sind säurelabil und besitzen Molekularmassen von weniger als 3 kD.

Eine gesteigerte Freisetzung des Opioidpeptids beta-Endorphin aus der Hypophyse ins Blut wurde häufig als Antwort des Organismus auf physischen oder psychischen Streß beobachtet. Über die funktionelle Bedeutung des beta-Endorphins in den peripheren Geweben des Organismus ist jedoch nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Interaktion von beta-Endorphin mit Hautzellen (Keratinozyten der Zellinie HaCaT) untersucht, um Erkenntnisse über eine funktionelle Bedeutung des Opioidpeptids in der Haut zu gewinnen. Zunächst konnte eine Bindung des beta-Endorphins über sein C-terminales Fragment an eine Bindungsstelle in der Keratinozytenzellkultur nachgewiesen und in folgenden Experimenten charakterisiert werden. Charakterisische Übereinstimmungen mit Ergebnissen früherer Experimenten ließen auf eine Interaktion von beta-Endorphin mit dem Glykoprotein Vitronektin schließen. Vitronektin wurde tatsächlich mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Technik auf der Zelloberfläche der Keratinozyten nachgewiesen. Nach Absättigung der C-terminalen beta-Endorphin-Bindungsstelle mit dem C-terminalen beta-Endorphin-Fragment konnte eine beta-Endorphin-Bindung an den Keratinozyten nachgewiesen werden. Diese erfolgte über das Mittelfragment des Opioidpeptids. Dieses Ergebnis ließ sich in Experimenten mit aus dem Zellverband gelösten und in Suspension gebrachten Keratinozyten reproduzieren. Es handelt sich demnach bei beiden nachgewiesenen Bindungen um nicht-opioide Interaktionen. Untersuchungen zur Prüfung der Hypothese einer gesteigerten Freisetzung von beta-Endorphin-immunoreaktivem Material aus Keratinozyten nach UV-Stimulation zeigten nur negative Ergebnisse. Ob POMC tatsächlich in Hautzellen exprimiert und somit beta-Endorphin in Keratinozyten synthetisiert wird, ist auch in der Literatur zur Zeit Gegenstand der Diskussion. Als Ligand der nachgewiesenen beta-Endorphin-Bindungsstellen käme somit beta-Endorphin in Frage, das aus anderen POMC-exprimierenden Zellen der Haut oder an weiteren POMC-Expressions-Orten im Organismus freigesetzt wird. Es wäre sehr wohl denkbar, daß die Interaktion des beta-Endorphins mit Vitronektin einerseits und mit Keratinozyten andererseits eine funktionelle Bedeutung im Rahmen der lokalen Immunabwehr besitzt oder eventuell sogar Wundheilungsprozesse fördert.

Eine gesteigerte Freisetzung des Opioidpeptids beta-Endorphin aus der Hypophyse ins Blut wurde häufig als Antwort des Organismus auf physischen oder psychischen Streß beobachtet. Über die funktionelle Bedeutung des beta-Endorphins in den peripheren Geweben des Organismus ist jedoch nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Interaktion von beta-Endorphin mit Hautzellen (Keratinozyten der Zellinie HaCaT) untersucht, um Erkenntnisse über eine funktionelle Bedeutung des Opioidpeptids in der Haut zu gewinnen. Zunächst konnte eine Bindung des beta-Endorphins über sein C-terminales Fragment an eine Bindungsstelle in der Keratinozytenzellkultur nachgewiesen und in folgenden Experimenten charakterisiert werden. Charakterisische Übereinstimmungen mit Ergebnissen früherer Experimenten ließen auf eine Interaktion von beta-Endorphin mit dem Glykoprotein Vitronektin schließen. Vitronektin wurde tatsächlich mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Technik auf der Zelloberfläche der Keratinozyten nachgewiesen. Nach Absättigung der C-terminalen beta-Endorphin-Bindungsstelle mit dem C-terminalen beta-Endorphin-Fragment konnte eine beta-Endorphin-Bindung an den Keratinozyten nachgewiesen werden. Diese erfolgte über das Mittelfragment des Opioidpeptids. Dieses Ergebnis ließ sich in Experimenten mit aus dem Zellverband gelösten und in Suspension gebrachten Keratinozyten reproduzieren. Es handelt sich demnach bei beiden nachgewiesenen Bindungen um nicht-opioide Interaktionen. Untersuchungen zur Prüfung der Hypothese einer gesteigerten Freisetzung von beta-Endorphin-immunoreaktivem Material aus Keratinozyten nach UV-Stimulation zeigten nur negative Ergebnisse. Ob POMC tatsächlich in Hautzellen exprimiert und somit beta-Endorphin in Keratinozyten synthetisiert wird, ist auch in der Literatur zur Zeit Gegenstand der Diskussion. Als Ligand der nachgewiesenen beta-Endorphin-Bindungsstellen käme somit beta-Endorphin in Frage, das aus anderen POMC-exprimierenden Zellen der Haut oder an weiteren POMC-Expressions-Orten im Organismus freigesetzt wird. Es wäre sehr wohl denkbar, daß die Interaktion des beta-Endorphins mit Vitronektin einerseits und mit Keratinozyten andererseits eine funktionelle Bedeutung im Rahmen der lokalen Immunabwehr besitzt oder eventuell sogar Wundheilungsprozesse fördert.