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Die vorliegende Dissertation hatte zum Ziel, die Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Expression von Interleukin-18 mRNA sowie die Sekretion von Interleukin-18 Protein in primären humanen Keratinozyten mittels qPCR bzw. ELISA zu untersuchen. In mehreren Versuchsreihen wurde eine zeitabhängige Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Interleukin-18 Produktion in einem Zeitraum von 4 bis 96 Stunden untersucht und ein signifikanter Abfall nach 4 Stunden sowie ein signifikanter Anstieg ab 24 Stunden bei Inkubation mit Lithium Chlorid festgestellt. Bei Flagellin zeigte sich kein statistisch signifikanter Effekt. Eine Konzentrationsreihe von 1 bis 40 mmol Lithium Chlorid konnte eine Wirkung auf die Interleukin-18 mRNA Expression, nicht aber auf die Proteinsekretion zeigen. Hohe Konzentrationen von Lithium Chlorid und lange Inkubationszeiten (96 Stunden) waren jedoch Auslöser zytotoxischer Reaktionen. Insgesamt konnte allerdings keine signifikante Wirkung von Lithium Chlorid auf Expression sowie Sekretion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten nachgewiesen werden. Damit erscheint eine pathophysiologisch relevante Induktion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten isoliert durch Lithium Chlorid oder Flagellin als Erklärung für eine Exazerbation oder Manifestation der Psoriasis unwahrscheinlich.

Die durch den demografischen Wandel ständig ansteigende Inzidenz an Patienten mit chronischen Wunden stellt ein großes gesellschaftliches und gesundheitsökonomisches Problem dar. Ziel dieser Arbeit ist es, die PRF-Applikation mit autolog kultivierten Keratinozyten zu kombinieren, um so eine verbesserte Wundheilung zu erreichen und eine neue Behandlungsmöglichkeit bei Patienten mit chronischen Wunden zu schaffen. Um eine breite klinische Anwendung zu ermöglichen, steht die Optimierung und Beschleunigung des Isolierungsverfahrens von Keratinozyten im Mittelpunkt dieser Dissertation. Dazu wurden versuchsweise in Lokalanästhesie kleine Hautproben vom Oberschenkel der Patienten entnommen und im Labor kultiviert. Durch Erfahrungen anderer Protokolle sowie eigene Ergebnisse wurde ein neues Isolierungsprotokoll entwickelt. Die korrekte Differenzierung der Zellen konnte molekularbiologisch bestätigt werden. Nach histologischer Auswertung zeigten sich eine gleichmäßige Verteilung und Vitalität der im Co-Delivery-Verfahren aufgesprühten Zellen. In einem letzten Schritt erfolgten zwei individuelle Heilversuche am Patienten. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Optimierung und Verbesserung der Keratinozyten-Isolierung. Die Fragestellungen bzw. Ziele bezüglich der Verkleinerung der am Patienten zu entnehmenden Hautprobe, des verbesserten sowie regelhaften Anwachsens der isolierten Keratinozyten und vor allem der Verkürzung der Kultivierungsdauer in Hinblick auf eine spätere klinische Anwendung bei Patienten mit chronischen Wunden konnten positiv beantwortet werden. Der individuelle Heilversuch am Patienten konnte eine deutliche Verkleinerung der Wundfläche auf Niveau der intakten Haut zeigen. Zudem traten keine Infektionen auf, sodass die Applikation von Keratinozyten im Co-Delivery-Verfahren mit PRF eine vielversprechende alternative Therapieoption bei chronischen Wunden darstellt

Die menschliche Haut hat neben anderen Mechanismen antimikrobielle Proteine (AMP) als chemische Barriere gegen Mikroorganismen entwickelt. Ziel der Arbeit war es, die Induzierbarkeit von AMP (Rnase7, Psoriasin, hBD-2, hBD-3) durch Zytokine, bzw. Zytokinkombinationen in humanen Keratinozyten zu analysieren. Die Proteinsekretion der AMP nach Stimulation wurde mittels ELISA bestimmt, die Analyse der Induktion der mRNA-Expression erfolgte mittels „real-time“-RT-PCR. Die Kombination von IFN-? mit IL-17 war besonders potent, um die Protein - und Genexpression der AMP RNase7, hBD-2 und hBD-3 synergistisch zu induzieren. Für Psoriasin ließ sich kein synergistischer Effekt durch diese Zytokinkombination nachweisen. IFN-? mit IL-1ß war hier die einzig potente Kombination. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit die Kombination von Zytokinen, v. a. IFN-? plus IL-17 als sehr potenter Induktor der AMP Expression von RNase-7, hBD-2 und hBD-3 in humanen Keratinozyten identifiziert werden.

Trotz mikrobieller Besiedlung kommt es relativ selten zu Infektionen der Haut. Einen wichtigen Grund dieser natürlichen Resistenz stellen durch Mikroorganismen induzierbare antimikrobielle Proteine wie hBD-2 dar. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Haut in der Lage ist, zwischen verschiedenen Mikroorganismen zu differenzieren. Dazu wurde die differentielle Genexpression in Keratinozyten nach Kontakt mit verschiedenen mikrobiellen Stimuli analysiert. Mithilfe der Systematischen Differential Display-PCR wurde IFIT4 als ein Gen identifiziert, welches in Keratinozyten v.a. durch P.aeruginosa-Überstände induzierbar ist, während S.aureus- und C.albicans-Überstände IFIT4 nicht induzieren. Anhand von Microarray-Analysen und der Suppressiven Subtraktiven Hybridisierung wurde der Einfluss hBD-2-induzierender und hBD-2-inhibierender P.aeruginosa-Kulturüberstände auf die Keratinozytengenexpression untersucht. Während hBD-2-induzierende Überstände vornehmlich antimikrobielle Proteine induzieren, induzieren hBD-2-inhibierende Überstände auch Gene der adaptiven Immunabwehr. Letzteres ist als Schutz vor Infektionen trotz eingeschränkter angeborener Immunabwehr zu werten.

Obwohl Epithelien wie die menschliche Haut permanent einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen ausgesetzt sind, kommt es nur relativ selten zu Infektionen. Einen wichtigen Aspekt dieser natürlichen Resistenz stellen die durch Bakterien wie P. aeruginosa induzierbaren antimikrobiellen Proteine, wie z.B. HBD-2, dar. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht, dass diese Induktion insbesondere durch die Kulturüberstände Nähstoff-limitierter, statischer Kulturen mit mukoiden, adhärenten Phänotypen erfolgt. Eine molekulare Analyse der bakteriellen induzierenden Faktoren ergab, dass es sich um anionische, hydrophobe Moleküle mit einer Masse >75kD handelt. Zudem scheinen bakterielle Rhamnolipide für eine Induktion von antimikrobiellen Proteinen und proinflammatorischen Zytokinen von Bedeutung zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass einige Faktoren scheinbar selektiv eine Induktion antimikrobieller Proteine bewirken. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem erstmalig ein Prinzip der bakteriellen Inhibition der Expression antimikrobieller Proteine beschrieben werden. Diese Inhibitoren sind säurelabil und besitzen Molekularmassen von weniger als 3 kD.