Search

Campylobacter jejuni es considerado uno de los principales patógenos entéricos a nivel mundial. Nuestro estudio, realizado con cepas aisladas de muestras de humanos, pollos de engorde y aves salvajes, mostró que existe una elevada variabilidad genética en las tres poblaciones. La población de aves salvajes fue la que mayores rasgos distintivos mostró en relación a las poblaciones de humanos y de pollos. Mediante la técnica del campo pulsado, sólo se identificaron 4 clones, los cuales se componían de entre 2 y 6 cepas aisladas de muestras de aves salvajes en tres clones y en un clon de cepas aisladas de muestras de pollos. No fue identificado ningún clon conformado por cepas aisladas de muestras de humanos pues se escogieron pacientes no relacionados con ningún brote. Mediante la técnica del MLST, se identificaron 64 secuencias tipos (ST); de las cuales sólo 3 se compartían entre todas las poblaciones de estudio, 10 entre la población humana y de pollos, y ninguna entre aves salvajes y humanos o aves salvajes y pollos. Por otra parte, se observó un elevado porcentaje de resistencia a tetraciclina (71.3%), ciprofloxacina (67.3%), ácido nalidíxico (64.6%) y ampicilina (63.3%), mientras que en menor medida a aminoglucósidos (7.3%). La población que mostró mayores valores de resistencia frente a estos antimicrobianos fueron las cepas aisladas de muestras de pollos, seguidas por las cepas aisladas de muestras de humanos y menor medida en la población de cepas aisladas de muestras de aves salvajes. Más de la mitad de las cepas estudiadas (58.2%) presentaron multiresistencia, principalmente, a ampicilina, ciprofloxacina y tetraciclina. Los mecanismos involucrados en la resistencia a ampicilina y tetraciclina no fueron exclusivamente debido a la presencia de los genes blaOXA, tetO/tetA, sino que la mutación en Thr86Ile en el gen gyrA, fue la responsable de la resistencia a ciprofloxacina. Además la presencia de las enzimas que modifican aminoglucósidos fueron las responsables, en la mayoría de los casos, de la resistencia a gentamicina, kanamicina y estreptomicina. Mediante el análisis de algunas cepas Whole Genome Sequencing y la determinación del cgMLST y wgMLST, se logró establecer un punto de corte que definió de una manera más exacta, las relaciones epidemiológicas. Además, con el uso de esta herramienta y mediante el análisis con diferentes softwares, se lograron identificar los genes y las mutaciones puntuales responsables de la resistencia a antibióticos, lo cual permitió comprobar o corroborar la información obtenida mediante las técnicas convencionales anteriormente utilizadas en el estudio. Con todos los datos obtenidos en este estudio se confirma que la campilobacteriosis es causada en humanos por el consumo de carne de pollo contaminada, y que esta contaminación puede ocurrir más allá de las granjas de cría, donde juega un papel importante la transportación y el manejo en los mataderos. También pudimos observar que la presencia de C. jejuni en aves salvajes presenta una elevada especificidad hospedador-patógeno, y que la presencia de estas aves en zonas urbanas propicia la diseminación del patógeno, lo cual representa un riesgo potencial de contaminación para los humanos. Campylobacter jejuni is considered one of the main enteric pathogens worldwide. In our study, a high genetic variability was observed in C. jejuni strains isolated from human, broiler and wild bird samples. Comparatively wild birds showed the most distinctive features among the three populations. Using pulsed field gel electrophoresis, only 4 clones were identified, each consisting of between 2 and 6 strains; 3 clones included wild bird strains and 1 clone included broiler strains. No clone was identified from strains isolated from human samples because the patients selected for this study were not associated with any outbreak. Using the MLST technique, 64 sequence types (ST) were identified, only 3 of which were found in all three study populations, 10 in both human and broiler samples, and no ST was shared between wild birds and humans, or wild birds and broilers. Among the strains, a high percentage of resistance was observed to tetracycline (71.3%), ciprofloxacin (67.3%), nalidixic acid (64.6%) and ampicillin (63.3%), and to a lesser extent to aminoglycosides (7.3%). Strains isolated from broiler samples showed the highest resistance to these antimicrobials, followed by those isolated from humans and finally from wild bird samples. More than half of the strains studied (58.2%) presented multidrug resistance, principally, to ampicillin, ciprofloxacin and tetracycline. The mechanisms involved in ampicillin and tetracycline resistance were not exclusively due to the presence of the blaOXA, tetO / tetA genes, but the Thr86Ile mutation in the gyrA gene was responsible for the resistance to ciprofloxacin. Also, in most cases, enzymes that modify aminoglycosides were responsible for the resistance observed to gentamicin, kanamycin and streptomycin. Strains analysis by Whole Genome Sequencing and the determination of cgMLST and wgMLST, enabled the establishment of a cut-off point to define the epidemiological relationships between strains more precisely. Moreover, the use of this tool together with analysis with different software allowed genes and point mutations responsible for antimicrobial resistance to be identified, which permitted the information obtained by more conventional techniques in this study to be verified or corroborated. The data obtained in this study, confirms that campylobacteriosis in humans is caused by the consumption of contaminated broiler meat, and that this contamination can occur outside of breeding farms, and is associated with transportation and slaughterhouse management. We also observed that C. jejuni in wild birds has high host-pathogen specificity, and that the presence of these birds in urban areas favors the dissemination of the pathogen, which represents a potential contamination risk for humans.

En aquesta tesis s’ha determinat l’epidemiologia dels principals virus respiratoris circulants en el nostre medi i s’ha avaluat l’aportació de la tecnologia molecular al diagnòstic de rutina de les infeccions respiratòries víriques. Es van recollir les dades dels virus respiratoris detectats entre gener de 1997 i desembre de 2013, a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Es va analitzar la freqüència, la distribució estacional i la relació entre els virus detectats amb l’edat i el sexe dels pacients. Les mostres incloses van ser mocs nasofaringis, exsudats nasals i faringis, rentades broncoalveolars i biòpsies pulmonars i es van analitzar mitjançant tècniques d’immunocromatografia, immunofluorescència (IF), cultiu cel·lular (CC) i detecció d’àcids nucleics dels virus gripals. De les 36.744 mostres estudiades, 13.201 (35,9%) van resultar positives per un o més virus. En total es van detectar 13.630 virus respiratoris, dels quals el RSV (29,4%) va ser el virus més detectat, el FLUAV (28,7%) el segon i l’AdV (14,7%) el tercer. La resta de virus respiratoris es van detectar amb una freqüència inferior al 10%: EV (9,3%), FLUBV (6,7%), hMPV (5,1%), RV (4,4%), PIV-3 (3%), PIV-1 (1,1%) i PIV-2 (, The present thesis aimed to determine the epidemiology of the main respiratory viruses circulating in our geographical area. The contribution of molecular techniques to the routine diagnosis of the infections caused by these viruses was also evaluated. Data of the respiratory viruses detected at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau between January 1997 and December 2013 were collected. The circulation of respiratory viruses, including frequency and seasonal distribution, was analysed. The relationship between the viruses detected and the age and sex of the patients was also evaluated. The clinical specimens analysed included nasopharyngeal aspirates, nasal and pharyngeal exudates, bronchoalveolar lavages and lung biopsies. The virological studies were performed by cell culture (CC), immunochromatography and immunofluorescence (IF); a nucleic acid amplification technique (NAAT) for detection of Influenza viruses was also used. A total of 36,744 clinical specimens were studied. Of these, 13,201 (35.9%) were positive for one virus or more than one. Overall 13,630 respiratory viruses were identified: RSV (29.4%) was the most frequently detected, followed by FLUAV (28.7%) and AdV (14.7%). The other viruses were detected in a frequency under 10%: EV (9.3%), FLUBV (6.7%), hMPV (5.1%), RV (4.4%), PIV-3 (3%), PIV-1 (1.1%) and PIV-2 (

Les betalactamases AmpC plasmídiques (pACBL) es varen descriure a finals de la dècada dels 80 i es caracteritzen per presentar un patró fenotípic indistingible a la hiperproducció d’una betalactamasa AmpC cromosòmica, sent per tant resistents a les penicil·lines, cefalosporines de primera, segona i tercera generació, monobactàmics i combinacions amb inhibidors, mantenintse únicament sensibles a cefalosporines de quarta generació i carbapenèmics. La detecció de les pACBL suposa tot un repte per als laboratoris de microbiologia clínica degut a la falta de mètodes fenotípics estandarditzats. En l’estudi nacional de control de qualitat que hem realitzat, s’observa que la capacitat dels centres espanyols per a detectar i informar la producció de betalactamases d’espectre ampliat (BLEA) en aïllats de Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli és molt superior a la capacitat per a detectar i informar la producció d’enzims AmpC en aquestes espècies. Recentment s’han desenvolupat mètodes comercials per a la detecció fenotípica de pACBL al laboratori. El problema és que aquests mètodes no són vàlids per a detectar pACBL en microorganismes productors d’una AmpC cromosòmica natural. No obstant, la presència de colònies situades a la proximitat dels halos d’inhibició de cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima i aztreonam s’ha descrit com un possible indicador de la presència d’aquests enzims en Escherichia coli. Aquesta va ser l’única eina fenotípica que ens ha permès sospitar la presència d’una pACBL en una soca productora d’una AmpC cromosòmica natural, descrivint per primer cop una pACBL en una soca de Serratia marcescens. En aquest estudi, s’ha suggerit també la transferència horitzontal in vivo d’un plasmidi de 70 kb portador dels gens blaDHA-1 i qnrB entre aïllats de S. marcescens i d’E. coli. L’increment del nombre de soques productores de pACBL i els escassos estudis de prevalença d’aquests enzims a l’Estat Espanyol va propiciar la realització d’un estudi per a determinar la prevalença de pACBL en enterobacteris sense AmpC cromosòmica induïble. Les soques d’estudi foren aïllades entre 1999 i 2007 a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Encara que la prevalença global ha estat del 0,4%, s’observa un increment significatiu del 0,06% el 1999 a l’1,3% el 2007. Proteus mirabilis ha sigut l’espècie productora de pACBL més prevalent (1%). Del total de 117 pACBL caracteritzades durant aquest període, CMY-2 és l’enzim majoritari (67%), seguit de DHA-1 (26%). Altres pACBL aïllades amb menor proporció són ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 i CMY-40, sent les tres últimes variants de CMY-2 descrites per primer cop. El continu augment de la prevalença d’aquests enzims es deu principalment a la disseminació dels gens ampC per transferència horitzontal. A dia d’avui, encara existeix poca informació disponible sobre el tipus de vectors implicats en la seva expansió. És per aquest motiu que es va procedir a la caracterització dels vectors que mobilitzen els gens ampC en la col·lecció de soques del present estudi. Els resultats han mostrat que els gens ampC estan mobilitzats per plasmidis en el 84% (98/117) de les soques mentre que en el 6% (7/117) dels casos es mobilitzen via Integrative conjugative elements (ICE) de la família SXT/R391. L’anàlisi plasmídica mostra una estreta relació entre el gen ampC i el plasmidi implicat. En el 6% dels casos on els gens ampC han estat mobilitzats per ICE, es tracta de soques de P. mirabilis productores de blaCMY-2. El fet que un ICE sigui el responsable de la mobilització dels gens blaCMY-2 en el 37% de les soques de P. mirabilis i que recentment s’hagi aïllat una soca de P. mirabilis portadora de blaCMY-2 al Japó fa pensar que aquests elements juguen un paper molt important en la disseminació de blaCMY-2, almenys en aquesta espècie en els darrers anys. El transposó Tn10 sembla ser el responsable de la mobilització de blaCMY-2 a l’interior de l’ICE. Els entorns genètics dels gens blaCMY-2,-4,-25,-27 i -40 i blaACC-1 explorats són molt conservats, relacionant-se en tots els casos amb l’element mòbil ISEcp1. En canvi, els entorns genètics dels gens blaDHA-1 presenten una major variabilitat, relacionant-se principalment amb els gens conservats de l’extrem 3’CS d’un integró de classe 1, qacEΔ1 i sul1, i l’element mòbil IS26. De la mateixa manera que ocorre amb les soques portadores de BLEA, els plasmidis que vehiculen els gens ampC solen contenir altres gens que confereixen resistència a altres famílies d’antibiòtics, limitant encara més les opcions terapèutiques. L’estudi de sensibilitat mostra un elevat grau de resistència a la majoria dels antibiòtics no betalactàmics testats en les soques clíniques. La resistència a àcid nalidíxic s’ha transferit per conjugació en el 62% de les soques productores de DHA-1. Des de fa uns anys s’ha constatat una clara associació entre blaDHA-1 i els gens qnr (gens que confereixen resistència de baix nivell a quinolones). En la majoria de casos ambdós gens s’han trobat al mateix plasmidi, associats a integrons o transposons compostos. La co-localització dels gens qnrB i blaDHA-1 en plasmidis d’ampli rang d’hostatger, principalment IncL/M, s’ha demostrat en totes les soques estudiades. L’anàlisi de l’entorn d’una d’elles revela que ambdós gens es troben mobilitzats per un transposó IS26 compost, sent el primer cop que es detalla aquesta estructura en una soca d’E. coli., Plasmid-mediated AmpC -lactamases (pACBL) were first described in the late 1980s. The phenotype of these enzymes is indistinguishable from the phenotype of hyperproducing chromosomal AmpC -lactamases. Thus, pACBL confer resistance to penicillins, first, second and third generation cephalosporins, monobactams and -lactamase inhibitors, and they are only susceptible to fourth generation cephalosporins and carbapenems. Detecting pACBL is a great challenge for microbiological laboratories because standardised phenotypic methods are lacking. The results of a proficiency study that we developed and conducted in Spain showed that the ability of microbiological laboratories to detect and report extended-spectrum -lactamases (ESBL) in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli was greater than the ability to detect and report AmpC enzymes in these isolates. Commercial methods have recently been developed to detect the pACBL phenotype in the laboratory. Their main problem is that they do not allow differentiation between chromosomal and acquired AmpC enzymes. Nevertheless, the presence of scattered colonies near the edge of the inhibition zones of cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime and aztreonam has been described as a possible indicator of the presence of these enzymes in Escherichia coli. This was the only phenotypic tool that led us to suspect the presence of a pACBL in a chromosomal AmpC producer, thus, allowing the detection of a pACBL in a S. marcescens for the first time. Findings in this study also suggested in vivo horizontal transfer of a 70 kb IncL/M plasmid coharbouring blaDHA-1 and qnrB resistance genes between S. marcescens and E. coli isolates. The increasing number of pACBL-producing isolates and the few studies of prevalence based on these enzymes in Spain led us to conduct a study to determine the prevalence of pACBL in Enterobacteriaceae isolates lacking inducible chromosomal ampC genes. These isolates were collected from 1999 to 2007 at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau in Barcelona, Spain (Annex III). Although the overall prevalence was 0.4%, we observed a significant increase, from 0.06% in 1999 to 1.3% in 2007. Proteus mirabilis showed the highest prevalence (1%). Among the 117 pACBL characterised during this period, CMY-2 was the most predominant enzyme (67%), followed by DHA-1 (26%). Less commonly found enzymes were ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 and CMY-40. The latter three CMY-2-variants mentioned are reported in this study for the first time. The continuous increase in the prevalence of AmpC enzymes is mainly due to the spread of ampC genes by horizontal transfer. Nowadays, there is little information available among the kind of vectors involved in their spread. For this reason, we characterized vectors mobilising ampC genes. Results show that ampC genes were mobilised by plasmids in 84% (98/117) of the strains, whereas 6% (7/117) of cases were mobilised through integrative conjugative elements (ICE) belonging to the SXT/R391 family. Plasmid analyses revealed a close relationship between the plasmid-mediated ampC gene and the specific plasmid family involved. In six percent of the cases in which ampC genes were mobilised by an ICE, all of them were CMY-2 producing P. mirabilis. The fact that an ICE was responsible for mobilising blaCMY-2 genes in 37% of P. mirabilis isolates and that a CMY-2 producing P. mirabilis strain was recently described in Japan suggests that these elements play an important role in the dissemination of blaCMY-2, at least in this species in recent years. The Tn10 transposon seems to be responsible for mobilising blaCMY-2 inside the ICE. The regions surrounding blaCMY-2,-4,-25,-27,-40 and blaACC-1 were highly conserved. In all cases they were associated with the ISEcp1 mobile element. The regions surrounding blaDHA-1 were more variable and mainly associated with the conserved genes of the 3’CS of class 1 integrons, qacEΔ1 and sul1, and the IS26 mobile element. As occurs for ESBL-producing strains, plasmids carrying ampC genes usually contain other genes that confer resistance to other antibiotic families. This limits the therapeutic options even further. Susceptibility testing results displayed a high level of resistance to most non--lactam agents tested in clinical isolates. The nalidixic acid resistance determinant was transferred by conjugation in the 62% of DHA-1-producing Enterobacteriaceae. A clear association between blaDHA-1 and qnr genes (genes that confer a low level resistance to quinolones) have been reported in recent years. In most cases both genes are located on the same plasmid, associated with integrons or composite transposons. Co-localization of qnrB and blaDHA-1 genes on broadhost- range plasmids, all but one belonging to the IncL/M group, was demonstrated in all the studied isolates. Analysis of the genetic environment of one of the isolates revealed that both genes were mobilised through an IS26 composite transposon. This is the first time that this genetic structure is detailed in an E. coli strain.

Streptococcus pyogenes és un patogen humà responsable d'un ampli ventall d'infeccions que varien des d'infeccions superficials com faringitis i impetigen a formes sistèmiques greus com fascitis necrosant (FN) i síndrome del xoc tòxic estreptocòccic (SSTS). El ressorgiment i persistència de formes invasives greus descrit des de mitjans dels anys 1980 ha motivat una intensa recerca sobre els aspectes epidemiològics, microbiològics i clínics d'aquestes infeccions. S'ha realitzat un estudi retrospectiu de base hospitalària que inclou 126 soques de S. pyogenes (27 procedents d'infeccions invasives i 99 d'infeccions no invasives) aïllades entre gener de 1999 i juny de 2003. Les soques de S. pyogenes es van caracteritzar en base a la distribució de tipus i subtipus emm i els perfils genètics de superantígens (SAgs) (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa i smeZ). Tanmateix, es va determinar la prevalença i els mecanismes de resistència a macròlids, tetraciclina i levofloxacino. Les formes clíniques més freqüents d'infecció invasiva van ser les infeccions de la pell i teixits tous (40,7%). La SSTS es va registrar en quatre (14,8%) dels casos invasius i es va associar a FN en la meitat dels casos. La majoria dels pacients afectats de quadres invasius eren adults, en particular d'edat avançada i de mitjana edat, i una elevada proporció presentaven factors predisposants, destacant l'alteració de la barrera cutània, la infecció per HIV, l'ús de drogues per via parenteral, i les neoplàsies. En la col·lecció de 126 soques analitzada es van identificar un total de 29 tipus emm amb una distribució encapçalada pel tipus emm1 (17,5%), seguit d'emm3 (8,7%), emm4 (8,7%), emm12 (7,1%), emm28 (7,1%), emm11 (6,3%) i emm77 (6,3%). Aquests set tipus van constituir el 61,9% del total de soques. No es van observar diferències significatives en la distribució de tipus emm entre soques aïllades d'infeccions invasives i no invasives amb l'única excepció del tipus poc freqüent emm25 que es va trobar associat a infeccions invasives en addictes a drogues per via parenteral. Es va trobar una forta correlació entre el patró de SAgs i el tipus emm independentment del tipus d'infecció. La resistència a eritromicina va mostrar un increment anual progressiu del 16,6% (1999) al 38,8% (2003) i va estar causada per soques pertanyents a 11 tipus emm. Les soques mef(A) positives dels tipus emm4, emm12 i emm75 i erm(B) positives dels tipus emm11 i emm25 constituïren el 80% de les soques resistents. La freqüència de resistència a tetraciclina va fluctuar durant el període estudiat (màxim 34,6% el 2002 i mínim 15,8% el 2001) i va ser superior en les soques resistents a eritromicina que en les soques sensibles (42,8% vs 18,7%). En les soques resistents a tetraciclina el gen tet(M) va ser el predominant i es va trobar en soques pertanyents a 14 tipus emm, mentre que el gen tet(O) només es va trobar en soques emm77. No es van observar diferències significatives en la prevalença de resistència a eritromicina ni a tetraciclina en el grup invasiu respecte del no invasiu. La prevalença de resistència a levofloxacino fou del 3,2%, incloent quatre soques amb sensibilitat reduïda o resistència intermèdia (CIM 2-4 µg/ml) i dues soques amb resistència d'alt nivell (CIM >32 µg/ml). La resistència de baix nivell es va associar a substitucions únicament en ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe i Ala121Val), mentre que la resistència d'alt nivell es va relacionar amb mutacions en ParC (Ser79Phe i Ala121Val) i GyrA (Ser81Tyr)., Streptococcus pyogenes (GAS) is a human pathogen responsible for a wide array of infections, ranging from pharyngitis and impetigo to severe invasive infections such as necrotizing fasciitis (NF) and streptococcal toxic shock syndrome (STSS). The resurgence and persistence of severe forms of GAS diseases reported since the mid 1980s have motivated intensive research on epidemiological, microbiological and clinical aspects of these diseases. A retrospective hospital-based study was conducted including 126 GAS isolates (27 from invasive infections and 99 from non-invasive infections) collected from January 1999 to June 2003. GAS isolates were characterized by emm type and subtype and superantigen (SAg) gene profile (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa and smeZ). The prevalence and mechanisms of macrolide, tetracycline and levofloxacin resistance were also determined. The most common clinical presentations of invasive cases were skin and soft-tissue infections (40.7%). SSTS occurred in four cases (14.8%) and was associated to NF in half of the cases. Most invasive cases were found in adults, in particular among the elderly and the middle-aged, and a large proportion had underlying conditions, the most frequent being skin lesions, HIV infection, injection drug use, and malignancy. A total of 29 emm types were identified among the 126 isolates; the most prevalent were emm1 (17.5 %), followed by emm3 (8.7 %), emm4 (8.7 %), emm12 (7.1 %), emm28 (7.1 %), emm11 (6.3 %) and emm77 (6.3 %). These seven emm types accounted for 61.9 % of isolates. There were no differences in the emm type distribution between invasive and non-invasive infections, except for emm25 isolates, which were associated with invasive infections in injecting drug users. The SAg gene profiles were closely associated with the emm type and were independent of the disease type. The prevalence of erythromycin resistance showed an annual progressive increase from 16.6% (1999) to 38.8% (2003) and was caused by isolates belonging to 11 emm types. mef(A)-positive emm types 4, 12 and 75, and erm(B)-positive emm types 11 and 25 were responsible for up to 80% of the erythromycin-resistant isolates. The prevalence of tetracycline resistance fluctuated over the period studied (maximum 34.6% in 2002 and minimum 15.8% in 2001) and was higher in erythromycin-resistant isolates than in susceptible isolates (42.8% vs 18.7%). Among the tetracycline-resistant isolates, the tet(M) determinant was the most prevalent and was distributed in isolates belonging to 14 emm types, whereas tet(O) was only found in emm77 isolates. No significant differences in resistance rates to erythromycin or tetracycline were found between invasive and non-invasive isolates. The rate of resistance to levofloxacin was 3.2%, encompassing four isolates with reduced susceptibility or intermediate resistance (MIC 2-4 µg/ml) and two isolates with a high level of resistance (MIC >32 µg/ml). Low-level resistance was associated with alterations in ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe and Ala121Val), while high-level resistance was associated with alterations involving both ParC (Ser79Phe and Ala121Val) and GyrA (Ser81Tyr).