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Los patógenos fúngicos representan una grave amenaza para la salud humana y la seguridad alimentaria. Fusarium oxysporum es un hongo filamentoso que causa marchitez vascular en más de cien cultivos diferentes y es conocido por su amplia distribución ecológica a nivel mundial. A pesar de carecer de reproducción sexual conocida, posee una extraordinaria plasticidad genética. Reconocido como primer modelo fúngico de patógeno multihospedador, tiene la capacidad de infectar organismos tanto del reino vegetal como animal, en este último caso como patógeno oportunista. Esta gran variabilidad le permite adaptarse y colonizar nichos muy diferentes convirtiéndolo en un organismo ideal para estudiar mecanismos genéticos adaptativos. En este estudio se llevaron a cabo experimentos de evolución experimental de F. oxysporum en tres condiciones distintas: infección de plantas, placas de medio mínimo y placas de medio completo. Con ello se pretendía estudiar, como la presión selectiva ejercida por estas condiciones ambientales impulsara cambios genéticos que pudieran manifestarse a nivel fenotípico. A partir de la cepa original clónica 4287 de F. oxysporum f. sp lycopersici se obtuvieron 5 líneas independientes evolucionadas en cadas condición mediante diez pasajes seriados. La re-secuenciación del genoma de las poblaciones evolucionadas tras el último pasaje reveló la presencia de grandes duplicaciones segmentarias y deleciones en regiones accesorias del genoma, incluida la pérdida parcial de cromosomas. Además, se detectaron numerosas inserciones de transposones, así como algunos cambios de un solo nucleótido (SNPs) y pequeñas inserciones o deleciones (Indels). El seguimiento de estos eventos a lo largo del experimento, a través de diversas técnicas moleculares, permitió establecer la dinámica evolutiva dentro de las poblaciones, relacionada con la competitividad relativa de las mutaciones múltiples propagadas simultáneamente. Algunas de las poblaciones evolucionadas mostraron notables diferencias fenotípicas con respecto al aislado inicial, incluyendo cambios en la sensibilidad a estreses, crecimiento invasivo y virulencia en plantas y animales. En las poblaciones evolucionadas en medio completo se encontraron dos mutaciones recurrentes, seleccionadas en múltiples líneas de manera independiente. Los genes afectados fueron FOXG_21009 de función desconocida y FOXG_00016 (velB) que codifica un componente de Velvet, un complejo proteico regulador del desarrollo y metabolismo secundario. La caracterización de aislados monospóricos portadores de estas mutaciones, además de la generación de mutantes nulos, reveló un incremento significativo en la velocidad de crecimiento y en la capacidad de conidiación bajo las condiciones de evolución experimental. Además, se ha estudiado el papel de uno de los metabolitos secundarios regulados por Velvet, el ácido fusárico, en la infección de plantas de tomate y del hospedador invertebrado Galleria mellonella. En resumen, los resultados del presente trabajo sugieren que la plasticidad del genoma, particularmente mediante el efecto de los transposones, actúa como un importante impulsor evolutivo en F. oxysporum, y que la adaptación al huésped implica ajustes compensatorios entre distintos programas de desarrollo que promueven la infección frente a la proliferación. Fungal pathogens represent a serious threat to human health and food security. Fusarium oxysporum is a filamentous fungus that causes vascular wilt disease in more than a hundred different crops and is known for its wide ecological distribution worldwide. Although it lacks a known sexual cycle, F. oxysporum displays a striking genetic plasticity. Recognized as the first fungal multi-host pathogen model, it infects organisms from both the plant and the animal kingdom, in the latter case as an opportunistic pathogen. Its variability allows it to adapt and colonize a wide range of different niches, making it an ideal organism to study genetic mechanisms underlying adaptation. In this study we conducted experimental evolution experiments with F. oxysporum under three different conditions: plant infection, growth on minimal and on complete medium. The goal was to understand how the selective pressure exerted by these different environmental conditions drives genetic change and affects phenotype. Starting from the clonal isolate F. oxysporum f. sp lycopersici 4287, we obtained 5 independent lines evolved in each condition through ten serial passages. Genome re-sequencing of the evolved populations after the last passage revealed the presence of large segmental duplications and deletions in accessory regions of the genome, including partial loss of chromosomes. We also detected numerous transposon insertion, as well as single nucleotide polymorphisms (SNPs) and small insertions or deletions (Indels). Monitoring these events throughout the experiment by various molecular techniques allowed to establish the evolutionary dynamics within the populations as a function of the relative competitiveness of the multiple mutations propagated simultaneously. Some evolved populations showed remarkable phenotypic differences with respect to the initial isolate including changes in sensitivity to stresses, invasive growth and virulence on plant and animal hosts. In the populations evolved on complete medium, two recurrent mutations were selected independently in several lines. The affected genes were FOXG_21009 with unknown function and FOXG_00016 (velB) encoding a component of Velvet, a protein complex that regulates development and secondary metabolism. The characterization of monosporic isolates carrying these mutations, as well as the generation of deletion mutants, revealed a significant increase in growth speed and conidiation capacity under the conditions of experimental evolution. In addition, we analyzed the role of fusaric acid, one of the secondary metabolites regulated by Velvet, during infection of tomato plants and of the invertebrate host Galleria mellonella. In summary, the results of this work suggest that genome plasticity, in particular associated with transposons, acts as a potent evolutionary driver in F. oxysporum, and that host adaptation implies trade-offs between different development programs promoting infection versus proliferation.

El pH juega un papel clave en el control de la patogénesis fúngica. En el patógeno del suelo Fusarium oxysporum, causante de la marchitez vascular, el pH actúa como regulador maestro de Fmk1, una MAPK altamente conservada, esencial para el crecimiento invasivo y patogénesis en raíces de tomate. Estudios previos demostraron que el pH también regula las MAPKs Mpk1 y Hog1, de manera opuesta a Fmk1. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares de la respuesta al pH. En el presente trabajo se ha investigado, si el pH del medio afecta las rutas MAPK a través de un cambio en el pH intracelular (pHi). Se ha determinado que el pHi funciona como una señal para la regulación de las rutas MAPK en F. oxysporum. El tratamiento de las células con diethylstilbestrol (DES), un inhibidor especifico de Pma1, la principal bomba de protones de la membrana plasmática, conlleva una rápida y sostenida bajada del pHi, acompañada de una rápida y transitoria activación de las MAPKs Mpk1 y Hog1, y la inactivación de Fmk1. Esta respuesta esta conservada en la levadura panadera Saccharomyces cerevisiae, lo que indica que está conservado en hongos. Por ello se ha utilizado la levadura como modelo para investigar el mecanismo de activación de Mpk1 por acidificación del pHi. Se identificaron: una ruta alternativa de la respuesta a stress de pared, mediada por la quinasa Ypk1/2; la rama Sln1 de la ruta Hog1; y la MAPK fosfatasa Msg5 cuya abundancia es afectada por el pHi. En segundo lugar, un escrutinio realizado con mutantes knockout sensibles a ácido identificó un gran número de proteínas candidatas implicadas en la activación de Mpk1 inducida por DES. Muchos de ellos poseen ortólogos en F. oxysporum. Las funciones celulares más relevantes en este proceso son tráfico celular, homeostasis de iones (principalmente V-ATPase) y metabolismo de lípidos. Los resultados revelan que el pHi es un nuevo mecanismo de regulación de MAPKs en hongos, y sugieren que existe una compleja interacción entre rutas de señalización y funciones celulares en la regulación de este proceso. pH is as a key player in the control of fungal pathogenicity. In the soilborne vascular wilt fungus Fusarium oxysporum, ambient pH acts as a master switch for regulation of the conserved Fmk1 MAPK cascade, essential for invasive growth and pathogenicity toward tomato roots. Previous studies indicated that pH also modulates the activity of the two other MAPKs, Mpk1 and Hog1, in an opposite way to Fmk1. The molecular events underlying the pH response are currently unknown. Here we investigated whether ambient pH modulates MAPK signaling by affecting the intracellular pH (pHi). We found that pHi acts as a signal regulating MAPK activity in F. oxysporum. Diethylstilbestrol (DES), a specific inhibitor of the plasma membrane H+-ATPase Pma1, induced a rapid and sustained decrease of pHi accompanied by rapid and transitory phosphorylation of the MAPKs Mpk1 and Hog1, and inactivation of Fmk1. Analogously, pHi also regulates MAPK signaling in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, suggesting that this mechanism is conserved in fungi. We initially investigated the mechanism of pHi-induced Mpk1 activation in the yeast model, using a candidate gene approach. Our studies revealed three potential mechanisms: an alternative branch of the canonical cell wall integrity pathway mediated by the Ypk1/2 kinase; the Sln1 branch of the Hog1 cascade; and the dual specificity MAPK phosphatase Msg5 whose abundance is affected by pHi. Moreover, a screen with a subset of acid-sensitive yeast mutants identified a number of candidates affected in DES-triggered Mpk1 activation, many of which have predicted orthologues in F. oxysporum. These candidate proteins have conserved cellular functions including cellular trafficking, ion homeostasis (mainly V-ATPase function) and lipid metabolism. Our results discover pHi as a new mechanism for MAPK signaling in fungi and reveal a complex interplay between signaling pathways and cellular functions in the regulation of this process.

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2013-2014. Molecular and Cellular, Biotechnology and Genetics. El pH extracelular juega un papel clave en los niveles de fosforilación de las MAP quinasas de Fusarium oxysporum. Además, existen evidencias significativas de que la virulencia de distintos patógenos fúngicos se ve alterada directamente por el pH extracelular. Actualmente se desconoce como el pH extracelular afecta al pH intracelular. En este trabajo, hemos hecho uso de una proteína fluorescente sensible al pH, la pHluorin. Dicha proteína posee la misma estructura que la GFP, pero con modificaciones que permiten medir el pH en el interior celular como valor radiométrico a dos longitudes de excitación y una de emisión. Esta proteína ha sido ampliamente utilizada en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El objetivo de este trabajo ha sido la construcción de cepas de F. oxysporum que expresan de forma constitutiva el gen de la pHluorin, y la optimización de las condiciones experimentales para la medida del pH intracelular. Una vez optimizada la metodología, se identificaron cambios significativos en el pH intracelular cuando la célula fue sometida a cambios drásticos de pH extracelular. Cuando las germínulas se sometieron a pH 9 se observó una subida rápida, seguida por una bajada gradual hasta alcanzar el valor homeostático entre 5.5 y 6.5. Por el contrario, cuando las germínulas se sometieron a pH 4 se detectó una bajada seguida por una subida muy lenta, siendo aún desconocido el mecanismo por el cual la homeostasis de pH es llevada a cabo. Además se observó una acidificación en presencia de glucosa, de forma opuesta a lo anteriormente descrito en levadura. Esta acidificación puede deberse a la entrada de glucosa en el interior celular, mediada por un sinporte con protones. Futuros experimentos serán necesarios para determinar los mecanismos de regulación de la homeostasis del pH intracelular cuando las germínulas se someten a pH 4 y pH 9 y su papel en la señalización y la virulencia de este patógeno.

Hemos querido presentar en este libro una extensa información sobre las enfermedades que afectan a nuestros agrios durante la postrecolección, o sea, a lo largo de todo el período de la comercialización de los frutos. La necesidad de una publicación de esta clase, ha sido puesta a nuestra atención reiteradamente por los técnicos de los almacenes acondicionadores, de las inspecciones fitosanitarias, de las empresas fitosanitarias así como por numerosos interesados en el cultivo de los agrios. Los objetivos propuestos en este libro, como son: a) conocer e identificar cuales son las enfermedades de los agrios en España después de ser recolectados; b) diagnosticar al agente o agentes micóticos causales; c) aplicar las medidas más idóneas para su control; son amplios e importantes y pueden servir no solo de guía a los técnicos mencionados sino también a estudiantes e investigadores que se inician en la patología de los agrios. Necesidad que es muy requerida, ya que -por lo general- la patología de la postrecolección tiende a ser olvidada u omitida en los libros de texto y es, practicamente, desconocida en castellano.