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Objective Salivary cortisol measurement plays an important role in the evaluation of adrenal function. Its high correlation with free serum cortisol, the easy of sampling and the limited presence of interfering steroids, generated multiple recent studies of its application, in special in the screening of adrenal hyperfunction. In this paper we present our experience in the development of a high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method for salivary cortisol and cortisone measurement. Materials and methods For this study we used 181 saliva samples from our routine diagnostic laboratory. The HPLC-MS/MS method was based on a Waters Quattro Premier tandem mass spectrometer with an electrospray probe. After derivatization with hydroxylamine transitions monitored included cortisol and cortisone. An in-house radioimmunoassay (RIA) was used for salivary cortisol results comparison. Results Functional sensitivity was 24 ng/dL for cortisol and linearity from 24 to 1929 ng/dL. Saliva cortisol values obtained in the 181 samples presented a median of 52 ng/dL with 5‐95% percentile of 24 and 374 ng/dL. With the RIA the results were 86, 25 and 436 ng/dL, respectively, with values for RIA being significantly higher (P

A dosagem de testosterona sérica, total ou fração livre, é metodologia de alto valor diagnóstico e encontra-se disponível na maioria dos laboratórios clínicos. Esta disponibilidade foi possível pelo desenvolvimento de metodologias simples e diretas, adaptáveis a plataformas de dosagem automatizada. Uma série de publicações recentes tem alertado quanto às limitações destas metodologias, em especial em amostras com baixas concentrações, como mulheres e crianças. Neste trabalho serão apresentados os resultados do emprego de uma metodologia de referência, fundamentada em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS), e sua comparação com uma dosagem de rotina (ensaio eletroquimioluminescente - ECLIA). Os métodos são comparados tanto na dosagem de testosterona total (n = 213) quanto na determinação de testosterona livre calculada com base na determinação da testosterona total e da proteína carregadora de hormônios sexuais (SHBG) (n = 135). Os valores obtidos com o ECLIA são significativamente mais elevados, sendo a dispersão mais nítida em soros com baixas concentrações. Tal fenômeno fica mais claro quando apresentado na forma de gráficos de Bland-Altman. Neste trabalho são discutidas as dificuldades de implementação de uma metodologia de referência, como a apresentada, e a convivência com as metodologias de rotina, bem como a literatura recente sobre o assunto.

Quantitation of endogenous steroids is important in the diagnosis of several endocrine disorders. In this study we present a new method for simultaneous quantitation of cortisol, cortisone, 11-desoxycortisol, 21-desoxycortisol, corticosterone, 17-hydroxyprogesterone and 11-desoxycorticosterone in human serum by on-line extraction and LC-MS/MS. Analytes extraction was performed on-line using a 2-position and 6-port valve equipped with a monolithic silica cartridge. After chromatographic separation of all analytes, detection was performed in the multiple reaction monitoring mode using positive atmospheric pressure chemical ionization mode. Total imprecision of the assay ranged from 5.5 to 15.5%. Comparison with immunoassays yielded coefficients of 0.893 for cortisol, 0.848 for 11-desoxycortisol and 0.924 for 17-hydroxyprogesterone. The sensitivity of this method provides meaningful data for patients within normal and elevated range and it may be useful for the diagnosis of a variety of adrenal dysfunctions.

A dosagem dos esteróides hormonais tem apresentado evolução técnica significativa, sendo os principais esteróides de interesse clínico dosados, atualmente, por métodos simples, rápidos e automatizados. Existe, no entanto, um compromisso em detrimento da exatidão, que é mais evidente na determinação de esteróides de menor concentração relativa e maior número de interferentes potenciais, como a 17-hidroxiprogesterona (17OHP), a diidrotestosterona (DHT) e outros. Nestes casos, um processo preparativo versátil e robusto é fundamental para garantir resultados com alto grau de exatidão. Apresentamos a padronização de um processo preparativo baseado em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) comparado à cromatografia em coluna de celite para a dosagem de 17OHP e DHT. Os anticorpos empregados nos respectivos radioimunoensaios apresentam especificidade semelhante aos descritos na literatura. As amostras foram inicialmente extraídas em éter etílico e em seguida submetidas ao processo cromatográfico. Amostras de soro provenientes da rotina foram dosadas em paralelo pelos dois métodos, sendo 57 amostras para 17OHP e 84 para DHT. Não houve diferença significativa entre os resultados, e os índices de correlação foram elevados (R= 0,95 e 0,97). Os resultados comprovam que a aplicação do HPLC é válida, além de ser mais reprodutível, versátil e menos operador-dependente. Sua aplicação mais ampla permitirá uma melhora de exatidão na dosagem de esteróides de baixa concentração relativa, onde os métodos mais simples resultam em valores falsamente elevados. Measurement of steroid hormones has undergone a significant technical evolution so that steroids with greater clinical interest are, nowadays, measured with methods that are simple, fast and prone to automation. Nevertheless, a compromise is made in detriment of accuracy, which is more evident with steroids with lower concentration and more potential interferents, as 17-hydroxyprogesterone (17OHP), dihydrotestosterone (DHT), and others. In such cases, a robust and versatile preparative process is of utmost importance to warrant results with the highest degree of accuracy. In this paper we present the results obtained with the use of a preparative process based on high-pressure chromatography (HPLC) for the measurement of 17OHP and DHT, as compared with a process based on celite column chromatography. The antibodies used in the radioimmunoassays have similar specificity to those previously described for these kinds of assays. Samples were initially extracted in ethyl ether and then submitted to HPLC. Routine samples (57 for 17OHP and 84 for DHT) were measured in parallel with both methods. The differences between results were not statistically significant, and the correlation indexes were high (R= 0.95 and 0.97). Our results confirm that systems based on HPLC are valid, besides being more robust, versatile and operator independent. A more pervasive application of HPLC preparation systems will allow an improvement in the accuracy of steroid measurements, specially those with low concentrations, where simple preparative processes result in falsely elevated results.