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FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Acinetobacter baumannii é um cocobacillo Gram-negativo que adquiriu um vasto repertório gênico de resistência à diversos antimicrobianos. Esse fato propiciou o protagonismo dessa bactéria em surtos epidemiológicos ao redor de todo o mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) agrupa A. baumannii com outros microrganismos multirresistentes (Multi Drug Resistant -MDR), formando o grupo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp.), microrganismos de alta relevância clínica. Bactérias do gênero Acinetobacter também representam um grande problema para a Saúde Única (One Health) por também serem capazes de causar mastite em animais de produção, infecções severas em humanos e por vezes se apresentarem como contaminantes ambientais. Deste modo, para a reconstrução da resistência da espécie, foi necessário entender o desenvolvimento da problemática ao longo do tempo. Considerando a problemática exposta e a amplitude global de multirresistência e patogenicidade deste microrganismo, este trabalho tem como objetivo comparar in silico os genomas de 206 linhagens de A. baumannii com o intuito de realizar um estudo de metanálise da espécie e caracteriza-la por meio de análises de pangenoma e evolução. Como etapa inicial deste trabalho um estudo de metanálise foi desenvolvido para a prospecção literária de relatos clínicos de linhagens multi-resistentes de A. baumannii nas plataformas NCBI (National Center for Biotechnology Information) e Cochrane. Já para os estudos comparativos foram utilizados os dados genômicos de A. baumannii contra o banco de dados Compreensive Antibiotic Resistance Database (CARD) para a formação do resistoma da espécie. Em seguida foi analisada a distribuição filogenética das espécies dentro do gênero com base em genes housekeeping e a reconstrução filogenômica da espécie A. baumannii com base em genes e proteínas pertencentes ao genoma central. As linhagens bacterianas foram separadas com base em Sequência Tipo e Identidade Média de Nucleotídeos (Average Nucleotide Identity - ANI). Posteriormente, foi realizada a análise da plasticidade genômica utilizando o software Genomic Island Prediction Software (GIPSy) e a análise do repertório total genético da espécie utilizando o software OrthoFinder. Com isso, os principais resultados obtidos foram: (i) basendo em Odds Ratio, A. baumannii possui cerca de 355% a chance de resistência à carbapenem quando comparada à chance de outras bactérias; (ii) o repertorio de genes de resistência da espécie é formado por 171 genes; (iii) há uma maior proporção de genes relacionados à resistência contra β-lactâmicos no geral, aminoglicosídeos, tetraciclinas; (iv) a quantidade de genes de resistência à gliciclina e às polimixinas encontrada foi inferior à das demais classes relevantes contra a espécie, como β-lactâmicos; (v) a distribuição global das linhagens de A. baumannii é homogênea e apresenta baixa clonalidade por isolamento geográfico considerando as Sequencias Tipo da espécie; (vi) o pangenoma da espécie é aberto, tendo um genoma central formado por 1.999 genes, e um genoma acessório formado por 12.336 genes. Portanto, conclui-se que o repertório de genes de resistência da espécie é vasto e complexo, além de condizer com os diversos casos clínicos relatados, o que indica que sua presença é crucial para a resistência bacteriana e seu sucesso como patógeno. Com isso, foi possível sumarizar os resultados de diferentes épocas e compreender melhor a origem e evolução da resistência da espécie. Análises futuras podem ser elaboradas para comparar os resultados aqui apresentados com outros microrganismos igualmente problemáticos. Além disso, é possível aplicar os resultados encontrados na análise pangenômica para a prospecção de candidatos vacinais e alvos terapêuticos contra infeções por A. baumannii. Acinetobacter baumannii is a Gram-negative coccobacillus that has acquired a vast resistance gene repertoire against several antimicrobials. This fact led to the prominence of this bacterium in epidemiological outbreaks around the world. The World Health Organization (WHO) groups A. baumannii with other Multi-Drug Resistant (MDR) microorganisms, forming the ESKAPE group of clinical relevance with Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp. Bacteria of the genus Acinetobacter also represent a significant problem for One Health because they are also capable of causing mastitis in farm animals, severe infections in humans, and sometimes are identified as environmental contaminants. Thus, for the reconstruction of the species' resistance, it was necessary to understand the development of the problem over time. This work aims to compare in silico the genomes of 206 A. baumannii strains to carry out a study of the meta-analysis of the species and characterize it through analysis of pan-genome and evolution Considering the exposed problem and the global amplitude of multidrug resistance and pathogenicity of this microorganism. As an initial stage of this work, a meta-analysis study was developed for the literary prospection of clinical reports of multi-resistant strains of A. baumannii on the NCBI (National Center for Biotechnology Information) and Cochrane platforms. For the comparative studies, the genomic data of A. baumannii was used against the Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) for the formation of the species' resistome. Then, the phylogenetic distribution of the species within the genus was analyzed based on housekeeping genes and the phylogenomic reconstruction of the species A. baumannii based on genes and proteins belonging to the central genome. The bacterial strains were separated based on Type Nucleotide Sequence and Average Nucleotide Identity (ANI). Subsequently, the genomic plasticity analysis was performed using the Genomic Island Prediction Software (GIPSy) and the analysis of the total genetic repertoire of the species using the OrthoFinder software. Thus, the main results obtained were: (i) based on Odds Ratio, A. baumannii has about 355% chance of resistance to carbapenem when compared to the chance of other bacteria; (ii) the repertoire of resistance genes of the species is formed by 171 genes; (iii) there is a higher proportion of genes related to resistance against β-lactams in general, aminoglycosides, tetracyclines; (iv) the amount of glycine and polymyxin resistance genes found was lower than that of the other relevant classes against the species, such as β-lactams; (v) the global distribution of A. baumannii strains is homogeneous and has low clonality due to geographic isolation considering the Type Sequences of the species; (vi) the pan-genome of the species is open, having a central genome formed by 1,999 genes, and an accessory genome formed by 12,336 genes. Therefore, it is concluded that the repertoire of resistance genes of the species is vast and complex, in addition to matching the various clinical cases reported, which indicates that its presence is crucial for bacterial resistance and its success as a pathogen. With that, it was possible to summarize the results of different times and better understand the origin of the evolution of the species' resistance. Future analyses can be carried out to compare the results presented here with other equally problematic microorganisms. In addition, it is possible to apply the results found in the pangenomic analysis to search for vaccine candidates and therapeutic targets against A. baumannii infections.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A sífilis é causada pela bactéria Treponema pallidum subespécie pallidum, uma espiroqueta Gram negativa, e é causada uma das Infecções Sexualmente Transmissíveis (IST) humanas mais prevalentes e sistêmicas. Em geral, esta doença é desenvolvida através do contato sexual (venéreo), especialmente em homens em relações sexuais com outros homens (MSM) e em alguns casos o recém-nascido pode contrair a doença da mãe através da transmissão transplacentária (sífilis congênita). Algumas espécies de Treponema pallidum são responsáveis pela sífilis sem contato sexual (não venérea), como a subespécie endemicum responsável por causar bejel e a subespécie pertenue responsável por causar bouba. Este patógenos são relativamente similares entre eles e eles podem ser distinguidos morfologicamente e sorologicamente. Todos os anos, a distribuição global reportada de sífilis está crescendo em torno de seis milhões de novos casos em indivíduos de 15 a 49 anos em todo o mundo. Mais de 300.000 mortes fetais e de recém-nascidos estão associadas a sífilis, com 215.000 bebês em alto risco de morte nos estágios iniciais do nascimento. A despeito do esforço realizado nos países desenvolvidos para a eliminação da sífilis, a diminuição dos investimentos em saúde pública e programas de controle das ISTs têm sobrepujado os esforços anteriores de controle e exclusão. Além disso, em países desenvolvidos como os Estados Unidos, a China e a Europa Ocidental, a sífilis tem sido reportada em populações específicas nas quais as relações entre homens estão crescendo. Em países em desenvolvimento ou subdesenvolvidos, a sífilis continua prevalente. A prevalência da sífilis combinada com a falta de alvos de vacina efetivos e o aparecimento de linhagens-resistentes a antibióticos enfatizam a necessidade de desenvolvimento de novas estratégias. Neste estudo, nós focamos em estudos de genômica comparativa, pangenoma, genômica subtrativa e vacinologia reversa para a identificação de alvos de drogas e identificação de alvos de vacinas. Nos estudos de pangenoma, nós utilizamos 53 linhagens de Treponema pallidum para identificar o genoma pan, genoma central e os genes únicos a nível de subespécie para revelar as diferenças de pastificade genômica entre a sífilis venérea (Subsp. pallidum) e não-venérea (Subsp. endemicum and Subsp. pertenue), o qual pode esclarecer a relação próxima entre as linhagens de Treponema pallidum. Nós também utilizamos vacinologia reversa, genômica subtrativa e docking molecular para a identificação de drogas alvos de vacina. Nas abordagens de genômica subtrativa e na vacinologia reversa nós comparamos 13 linhagens de Treponema pallidum em cada uma. Nós identificamos 837 genes no genoma central e, considerando o humano como hospedeiro, nós identificamos 567 proteínas conservadas não homólogas ao hospedeiro. Além disso, usando genômica subtrativa e vacinologia reversa, 15 proteínas antigênicas e seis alvos para drogas essenciais para a bactéria foram identificados. Os alvos para drogas identificados foram sujeitos à screening virtual utilizando uma biblioteca de 28 compostos naturais. As moléculas de drogas propostas que mostraram interações favoráveis, baixa energia e alta complementaridade também foram reportadas no presente estudo. Nossa abordagem provê uma seleção rápida e eficiente de proteínas putativas de Treponema pallidum para o desenvolvimento de um amplo espectro de novos alvos e vacinas, as quais podem ser utilizadas como candidatas para alvos terapêuticos contra a sífilis. Syphilis is caused by the Gram negative spirochete Treponema pallidum subspecies pallidum and is considered as one of the most imperious and systemic human Sexually Transmitted Infection (STIs). In general, this disease is developed by sexual contact (venereal) especially men (men having sexual relationship with men, MSM) and in some cases a new born may get it from effected mother (congenital syphilis) by transplacental transmission. There are some subspecies of Treponema pallidum that are responsible for syphilis without sexual contact (non-venereal), such as, T. pallidum subspecies endemicum responsible for bejel and T. pallidum subspecies. pertenue responsible for yaws. These pathogens are quite similar to each other and they cannot be distinguished serologically and morphologically. Every year, the global distribution of syphilis is increasing, reportedly, about six million new cases of syphilis arises around the globe in individuals aged 15 to 49 years. More than 300,000 fetal and newborn deaths are associated to syphilis, with 215,000 further infants placed at high risk of death at early stage of birth. Despite the effort made in developed countries for the elimination of syphilis, the decrease in investment towards public health and STIs control program has over shadowed previous exclusion and control efforts. Furthermore, in developed countries like USA, China and Western Europe, syphilis has been reported in key populations where men are developing sexual relationship with men. In developing or poor countries, syphilis has remained prevalent. The current worldwide prevalence of syphilis combined with the lack of effective vaccine targets and the appearing of antibiotic-resistant strains emphasizes the need for the development of new strategies. In this study, we focused on the comparative genomics studies, Pan-genome, subtractive genomics and reverse vaccinology analysis for the drug and vaccine target identification. In the pan-genomic study, we used 53 strains of Treponema pallidum to identify the pan-genome, core genome, and singletons based on subspecies level to reveal the differences in genome plasticity between venereal (Subsp. pallidum) and non-venereal (Subsp. endemicum and Subsp. pertenue) syphilis, which can disclose the close connection among all strains of Treponema pallidum. We also used reverse vaccinology, subtractive genomics and molecular docking analysis for the drug and vaccine target identification. In subtractive genomics and reverse vaccinology approaches, we compared 13 strains of Treponema pallidum for analysis. We identified 837 core genes and, considering human as host, we identified 567 conserved non-host homologous proteins. Further, using subtractive genomics and reverse vaccinology, 15 putative antigenic proteins, and 6 drug targets were identified which were essential for the bacteria. Identified drug targets were subjected to virtual screening using 28 Natural compounds library. The proposed drug molecules showing favorable interactions, lower energy and high complementarity with predicted targets have also been reported in the present study. Our proposed approach expedites the rapid and efficient selection of Treponema pallidum putative proteins for developing a broad spectrum of novel drugs and vaccines, which can be used as candidate therapeutic targets in the future against syphilis disease.

Pasteurella multocida é um patógeno comensal e oportunista que causa várias doenças como pneumonia, rinite atrófica, cólera aviária e septicemia hemorrágica em diferentes hospedeiros. Essas doenças causam um alto índice de morbidade e mortalidade, resultando em grandes prejuízos econômicos a nível mundial. No Peru, P. multocida é o principal agente causador de pneumonias, possuindo alta taxa de mortalidade em neonatos e filhotes de alpacas na época das geladas, o qual representa uma grande problemática, uma vez que a produção de alpacas é um dos principais recursos econômicos da região dos Andes. Nesse contexto, é essencial o conhecimento de características genômicas da espécie P. multocida para o desenvolvimento de estratégias futuras para controle e prevenção dessas doenças. Por esse motivo, foi sequenciada a linhagem UNMSM isolada de uma alpaca com pneumonia e 22 linhagens de P. multocida foram recuperadas da base de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI). Com o objetivo de decifrar a diversidade genética e o processo adaptativo de P. multocida, este trabalho realizou análises filogenômicas e pangenômicas de isolados de distintas doenças e hospedeiros dessa espécie. Análises de seleção positiva, predição de ilhas genômicas e de genes componentes do genoma acessório foram realizadas nos grupos fenotípicos estabelecidos. Como resultado, comprovou-se a patogenicidade da linhagem UNMSM devido à presença dos principais genes de virulência da espécie e da presença de ilhas de patogenicidade. Entretanto, a análise filogenética demostrou que a linhagem UNMSM diverge das demais linhagens do grupo que causam a pneumonia. A análise da diversidade baseada na filogenia de nucleotídeos, aminoácidos e presença e ausência de genes demonstrou a concordância do agrupamento de linhagens aos grupos fenotípicos estabelecidos. A análise da diversidade por filogenia baseada na presença e ausência de genes, mostrou uma maior variabilidade no mesmo grupo. Em relação aos estudos de pangenoma, os genes acessórios codificam proteínas associadas ao metabolismo e transporte de carboidratos, aminoácidos, biogênese e membrana de parede celular e proteínas hipotéticas. A presença desses grupos funcionais como parte do genoma acessório sugere a importância no processo adaptativo, indicando a fixação no genoma através da pressão seletiva. Análises de seleção positiva no genoma identificaram genes submetidos a seleção, relevantes na interação com hospedeiro, mas não estão implicados no processo de adaptação em patogenias. Finalmente, a presença de ilhas genômicas e determinadas linhagens teriam um papel crucial na preferência por determinado hospedeiro e/ou doença. Análises genômicas e transcricionais poderão fornecer novas informações acerca do papel essencial de eventos de transferência horizontal e polimorfismos de nucleotídeo único envolvidos na diversificação e compreensão dos mecanismos de adaptação de P. multocida. Pasteurella multocida is a commensal and opportunistic pathogen that causes several diseases such as snuffles, pneumonia, atrophic rhinitis, fowl cholera and hemorrhagic septicemia in different hosts. These diseases cause a high rate of morbidity and mortality, causing important economic loss worldwide. In Peru, P. multocida is a mean agent of pneumonic infection, with a high mortality rate in neonatal alpacas in the seasons of icy. This represents a major problem since the production of alpacas is one of the main economic resources from the Andes region. In this context, knowledge of genomic characteristics from P. multocida species is essential for the development of future strategies for the control and prevention of these diseases. For this reason, the UNMSM strain isolated from an alpaca with pneumonia was sequenced and 22 P. multocida strains were retrieved from the NCBI database. In this case, to decipher the genetic diversity and adaptive process of P. multocida, this work aimed to perform phylogenomic and pan genomic analyses of isolates from distinct diseases and hosts. Analysis of positive selection, prediction of genomic islands and accessory genome were performed in the phenotype established phenotypic groups. As a result, the pathogenicity of the UNMSM strain was evidenced due to the presence of the main virulence genes of the species and the presence of pathogenicity islands. However, phylogenetic analysis has shown that the UNMSM strain diverges from other lineages in the pneumonia group. Analysis of the diversity based on the nucleotide/aminoacid phylogeny and presence and absence of genes show the agreement of the clustering of lineages from established phenotypic groups. Analysis of diversity by phylogeny based on the presence and absence of genes showed greater variability in the same group. Notably, the accessory genes encode proteins associated with metabolism and transport of carbohydrates, aminoacids, cell wall and membrane biogenesis, and hypothetical proteins. The presence of these functional groups as part of the accessory genome suggest the importance in the adaptation process, suggesting their fixation in the genome through selective pressure. Positive selection analysis identified genes under selection, relevant in host interaction but are not involved in the pathogen adaptation process. In conclusion, the presence of genomic islands and determinate strains would play a crucial role in host/disease predilection. Transcriptional and genomic analyzes may provide new information about the essential role of horizontal transfer events and single nucleotide polymorphisms involved in the diversification and understanding of the mechanisms of P. multocida adaptation.

Staphylococcus aureus é o maior agente etiológico de mastite em pequenos ruminantes de todo o mundo. Mastite consiste em uma infecção na glândula mamária que é de difícil cura e possível reincidência, levando a grandes perdas econômicas na produção de leite e na criação de animais de rebanho. Pouco se sabe sobre características genômicas de linhagens de S. aureus isoladas de mastite em pequenos ruminantes, principalmente em ovinos. Estudos dos genomas desse microrganismo podem contribuir para melhor compreensão de traços envolvidos na especialização por hospedeiro e além disso, contribuir para novas estratégias de tratamento e controle da mastite ovina. Neste estudo, análises de genômica comparativa entre 12 linhagens isoladas de mastite de ovelhas da França e 11 genomas isolados de diferentes hospedeiros, disponíveis no banco de dados do NCBI, foram realizadas. Como resultado, 3,964 diferentes genes foram encontrados nos genomas e 2,969 genes são compartilhados entre eles, destes, 859 são genes acessórios. Os 2,110 genes que fazem parte do genoma central estão envolvidos no metabolismo celular, de acordo com as análises de distribuição de COG. Além disso, os grupos de genes acessórios e genes exclusivos encontrados nas linhagens de ovinos estão incluídos na categoria de sinalização celular. Profagos, ilhas de patogenicidade e ilhas genômicas foram preditas e carreiam importantes fatores de virulência bacteriano. Um agrupamento de linhagens ovinas pode ser observado na análise de Identidade Média de Nucleotídeos. Além disso, as análises de Tipagem de Sequências Multilocus revelaram dois grandes grupos clonais de S. aureus ovino, exceto por três linhagens que podem ser consideradas atípicas. Este resultado está de acordo com as análises filogenéticas. Em adição, algumas linhagens isoladas de ovelha e vaca podem estar evolutivamente relacionadas. Estas análises de genômica comparativa podem contribuir para a identificação dos genes adquiridos por transferência horizontal, bem como o papel destes na adaptação do hospedeiro e virulência bacteriana, e caracterização das linhagens que acometem ovinos. Staphylococcus aureus is the major etiological agent of mastitis in small ruminants, worldwide. Mastitis is a mammary gland inflammation that is difficult to cure and prone to resurgence, leading to great economical losses in milk production and herd animals. To date, little is known about the genomic features specific to S. aureus strains isolated from mastitis in small ruminants, such as ovines. The study of the genomes of these microorganisms might contribute to a better understanding of the bacterial traits involved in the host specialization, supporting the development of new treatment and control strategies for ovine mastitis. In this study, comparative genomic analyses between 12 strains isolated from ovine mastitis in France and 11 genomes, isolated from various hosts, retrieved from the NCBI database, were performed. Results revealed 3,964 different genes found in the genomes and 2,969 genes shared between the groups, out of these, 859 are accessory genes. The 2,110 genes, which comprise the core genome, are involved in the cellular metabolism, according to the COG distribution analysis. Beyond the cellular metabolism category, the groups of accessory genes and genes exclusively found in the ovine strains include the cell signaling category. Prophages, pathogenicity and genomic island were predicted and carries important bacterial virulence factors. A cluster of ovine strains was formed in the Average Nucleotide Identity analysis. Besides that, the Multilocus Sequence Typing analysis revealed two big clonal- related group of S. aureus ovine, except for three strains that can be considered atypical. This result is in agreement with the phylogenetic analysis. In addition, some sheep and cattle strains can be evolutionary related. These comparative genomic analyses may contribute to the identification of traits acquired through lateral gene transfer, as well as the roles of these traits in host adaptation and virulence, and characterization of S. aureus ovine strains.

Outra Agência Within the human colon, the genus Faecalibacterium is the main member of the Clostridium leptum cluster and comprises the second-most common representative genus in fecal samples, after Clostridium coccoides. It has been recognized as an important bacterium promoting the intestinal health and today is considered as a potential next generation probiotic. Until recently, it was believed that there was only one species in this genus, but since 2012, some studies have begun to suggest the existence of two phylogroups into the genus. This new proposition of reclassification into this genus increases the importance of new studies, with all strains, to better understand the diversity, the interactions with the host and the safety aspects in its use as probiotic. Briefly, in this work we introduce the comparative genomics analyzes to the genus Faecalibacterium performing a deep phylogenetic study and evaluating the safety aspects for its use as a probiotic. The phylogenetic analyzes included not only the classical use of 16S rRNA gene, but also the utilization of 17 complete genomes and techniques like whole genome Multi-Locus Sequence Typing (wgMLST), Average Nucleotide Identity (ANI), gene synteny, and pangenome. Also, this is the first work to combine an analysis of pangenome development with ANI analysis in order to corroborate the assignment of strains to new species. The phylogenetic analyzes confirmed the existence of more than one species into the genus Faecalibacterium. Moreover, the safety assessment involved the (1) prediction of horizontally acquired regions (Antibiotic resistance islands, Metabolic islands and phage regions), (2) prediction of metabolic pathways, (3) search of genes related to antibiotic resistance and (4) search of bacteriocins. These analyzes identified genomic islands in all genomes, but none of than are exclusive to one strain or genospecies. Also, were identified 8 genes related to antibiotic resistance mechanisms distributed among the genomes. 126 metabolic pathways were predicted and among than some were highlighted: Bisphenol A degradation, Butanoate metabolism and Streptomycin biosynthesis. In addition, we studied the genomic context of one protein (Microbial Anti-inflammatory Molecule - MAM) first described by our group. This investigation shows that MAM appears close to genes related to sporulation process and, in some strains, close to an ABC-transporter.

Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive, facultative intracellular bacterium of veterinary and medical importance with a global distribution. It infects a variety of mammals, such as sheep, goats, horses, buffalo and humans, and causes economic losses in animal production. Biovar Equi is nitrate positive and has horse and buffalo as exclusive hosts. Biovar Ovis is nitrate negative and has preference for sheep and goats. Antibiotic treatments have reduced efficiency due to the protection provided by bacteria sequestered in abscesses, and current vaccines have different protection efficiency in different hosts. In order to know more about the mechanisms of pathogenicity as well as the evolution of the species, we performed comparative genome and genome-scale positive selection analysis. Genomes isolated from buffalo hosts in the same disease outbreak were compared to each other and other C. pseudotuberculosis strains. The characteristic that differentiated buffalo isolates from others was a prophage containing the diphtheria toxin inserted into a pathogenicity island, suggesting this as a requirement for this host infection. Phylogenomic analysis of 29 genomes of different hosts and biovars suggested that Ovis is a monophyletic group derived from Equi. Positive selection analysis identified 27 genes involved in adaptations of specific branches of C. pseudotuberculosis, some of them are drug or vaccine targets. The results were combined with data form literature to explain the genetic structure and evolution of C. pseudotuberculosis based on an ecological diversification model. Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva e intracelular facultativa de importância médica e veterinária. A espécie infecta uma variedade de mamíferos, como ovelhas, cabras, cavalos, búfalos e humanos, e causa perdas econômicas na produção animal. O biovar Equi é nitrato positivo e tem o cavalo e o búfalo como hospedeiros exclusivos. O biovar Ovis é nitrato negativo e tem preferência por ovinos e caprinos. Os tratamentos com antibióticos reduziram a eficiência, devido à proteção proporcionada pelos abscessos, e as vacinas atuais apresentam eficiência de proteção diferente em diferentes hospedeiros. Com o objetivo de conhecer melhor os mecanismos de patogenicidade e a evolução das espécies, realizamos análises de genômica comparativa e seleção positiva em escala genômica. Genomas isolados de hospedeiros bubalinos no mesmo surto da doença foram comparados entre si e com outras cepas de C. pseudotuberculosis. A característica que diferenciou isolados de búfalos de outros isolados foi um prófago contendo a toxina da difteria inserida em uma ilha de patogenicidade, sugerindo este prófago como um requisito para essa infecção deste hospedeiro. Análise de análise filogenômica de 29 genomas de diferentes hospedeiros e biovares sugeriu que Ovis é um grupo monofilético derivado de Equi. A análise de seleção positiva identificou 27 genes envolvidos em adaptações de ramos específicos de C. pseudotuberculosis, alguns deles são alvos de drogas ou vacinas. Os resultados foram combinados com a literatura de forma de dados para explicar a estrutura genética e evolução de C. pseudotuberculosis com base em um modelo de diversificação ecológica.

A tilapia do Nilo é o peixe mais produzido no Brasil e a expansão de seu cultivo é afetada pelo patógeno Streptococcus agalactiae. Os objetivos dessa dissertação foram realizar uma revisão de literatura sobre estreptococose por S. agalactiae e sua epidemiologia, e analisar a população brasileira desse micro-organismo, estabelecer uma ferramenta para rastrear surtos de estreptococose e distinguir amostras geneticamente próximas. Um total de 39 amostras foram obtidas de surtos e seus genomas foram sequenciados e anotados para análises comparativas de tipagem multilocus (MLST), similaridade genômica, MLST de genoma inteiro (wgMLST) e uma análise evolutiva com inferência Bayesiana da espécie. Os isolados brasileiros de S. agalactiae apresentaram dois STs, dentre os quais um novo descrito pela primeira vez nesse trabalho, e também uma linhagem não tipável. O wgMLST diferenciou cada isolado como um clone único e estabeleceu correlações temporais e geográficas entre as amostras, sendo que os STs 260 e 927 prevaleceram no Nordeste e as amostras não tipáveis, na região Centro-Sul. A análise evolutiva Bayesiana mostrou que a população brasileira de S. agalactiae tem uma emergência muito recente, de cerca de 585 anos. A população brasileira de S. agalactiae se mostrou genomicamente heterogênea e distribuida em diferentes regiões do país conforme seu genótipo, e o wgMLST pode rastrear cada evento de surto individualmente. Nile tilapia is the most produced fish in Brazil and the evolution of its cultivation is affected by the pathogen Streptococcus agalactiae. The aims of this thesis were to review the literature about streptococcosis by S. agalactiae and its epidemiology and to analyze genetic structure of the Brazilian isolates, to establish a method to track outbreaks of streptococcosis and to distinguish closely related strains. A total of 39 strains were obtained from outbreaks and their whole genomes were sequenced and annotated for comparative analysis of multilocus sequence typing (MLST), genomic similarity, whole genome MLST (wgMLST) and a Bayesian evolutionary analysis of the species. The Brazilian strains of S. agalactiae presented two STs, among which a new one just described, and also a non-typeable lineage. The wgMLST could differentiate each strain in a single clone and establish temporal and geographical correlations among strains, wherein STs 260 and 927 predominated in Northeast, and non-typeable strains, on Central-South region. The Bayesian evolutionary analysis revealed that the Brazilian population of S. agalactiae has a remarkably recent emergence, about 585 years ago. Brazilian strains of S. agalactiae showed to be heterogeneous in its genome sequence, distributed in different regions of the country according to the genotype, and wgMLST analysis could track each outbreak event individually.

As espécies de Francisella são caracterizadas por serem bactérias intracelulares facultativas que causam uma variedade de infecções em animais terrestres e aquáticos. Nesse gênero, Francisella noatunensis subsp. orientalis (FNO) apresenta uma grande importância por ser um patógeno emergente de peixes, associado a surtos em fazendas de cultura de tilápia-do-nilo. Apesar de a doença causada por FNO apresentar uma alta taxa de mortalidade durante os surtos e ter sido relatada em diversos países, as relações filogenômicas entre os isolados de diferentes países, a história evolucionária deste patógeno e diversos outros aspectos acerca da sua caracterização genômica ainda são pouco conhecidas. Neste contexto, análises de genômica comparativa foram realizadas afim de auxiliar no maior conhecimento dessa espécie de claro interesse epidemiológico. Para tanto, foram sequenciadas, montadas e curadas manualmente 18 linhagens de F. noatunensis subsp. orientalis isoladas de surtos em fazendas de cultivo de tilápia-do-nilo no Brasil. Em seguida, foram utilizados os softwares Gegenes, Mauve, BRIG, Gipsy e o módulo Genome Comparator do banco de dados BIGSdb para a realização de análises de filogenia, sintenia, plasticidade genômica e polimorfismo. Em todas essas análises foram incluídas outras subespécies de Francisella e linhagens de FNO disponíveis no NCBI. Além disso, foram feitas buscas por genes possivelmente envolvidos na resposta a estresses ambientais. Desse modo, foi observado que as linhagens de FNO são altamente clonais e que provavelmente a chegada da doença ao país se deu pela entrada de uma única linhagem. Foram também preditas oito ilhas genômicas, sendo seis consideradas ilhas de patogenicidade. Por fim, a busca por genes potencialmente envolvidos na resposta a estresses ambientais indicou uma série de genes candidatos a um estudo mais aprofundado para o desenvolvimento de drogas. The Francisella species are intracellular facultative bacteria that cause a variety of infections in terrestrial and aquatic animals. In this genus, F. noatunensis subsp. orientalis (FNO) has a remarked importance as an emergent fish pathogen associated with outbreaks in Nile tilapia farms. Although the disease caused by FNO presents a high mortality rate during outbreaks and has been reported in several countries, the phylogenomic relationships among isolates from different countries, the evolutionary history of this pathogen and other aspects still are poorly characterized. In this context, comparative genomic analyzes were performed in order to assist in better understanding this species of great epidemiologic interest. Thus, 18 strains of F. noatunensis subsp. orientalis isolated from outbreaks in Brazilian Nile tilapia farms were sequenced, assembled and manually curated. Then, the Gegenes, Mauve, BRIG and Gipsy softwares, and the Genome Comparator module of the BIGsdb database were used to perform phylogeny, synteny, genomic plasticity and polymorphisms analyzes. Other Francisella subspecies and FNO strains available in the NCBI were included in all of these analyzes. Additionally, searches were made for genes possibly involved in the response to environmental stresses. Therefore, it was observed that the FNO strains are highly clonal and that the arrival of the disease in Brazil is probably due to the entrance of a single strain. Eight genomic islands were also predicted, six being considered pathogenicity islands. Finally, the search for genes potentially involved in the response to environmental stresses indicated a number of candidate genes for a more detailed study for the development of drugs.

As bactérias láticas (BL) compõem um dos grupos bacterianos mais importantes da área biotecnológica. Nele, Lactococcus lactis se destaca pelo seu uso na produção de produtos fermentados, macromoléculas e na sua aplicação de benefícios à saúde, uma vez que são espécies geralmente reconhecidas como seguras (GRAS do inglês: generally recognized as safe). Neste cenário, Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118 (NCDO 2118) se sobressai como uma linhagem fermentadora de xilose e produtora de ácido gama-aminobutírico (GABA) isolada de ervilha congelada, além de sua capacidade anti-inflamatória, comprovada recentemente. O GABA pode contribuir no relaxamento muscular, além de apresentar atividade hipotensora. Entretanto, apesar destas características importantes, pouco ainda se conhece sobre os mecanismos envolvidos nos efeitos probióticos da linhagem. Neste contexto, a área da genômica pode auxiliar esclarecendo estas questões. A genômica comparativa tem revolucionado os novos estudos, por meio da determinação da plasticidade genômica entre diferentes espécies. Neste trabalho, o genoma da linhagem NCDO 2118 foi sequenciado e curado manualmente. Além disso, comparamos o seu genoma com outras linhagens, onde 5 são de L. lactis subsp. Lactis, 6 Lactococcus lactis subsp. cremoris e 2 Lactococcus garvieae. Foram utilizados os softwares Gegenees, Mauve e BRIG para: análises filogenômicas, sintenia gênica e comparações de genomas entre as espécies anteriormente mencionadas. Foram trabalhadas em conjunto, as ferramentas GIPSy e Phast, para predição de ilhas genômicas (GEI) e fagos, respectivamente. Para predição de proteínas secretadas, o genoma foi analisado por meio da ferramenta SurfG+. Nas análises filogenômicas, uma alta similaridade foi observada entre NCDO 2118 e Lactococcus lactis subsp. lactis KF147 (KF147), ambas isoladas de plantas. Além das análises de sintenia terem mostrado claramente o alto grau de conservação da ordem gênica entre ambas linhagens. Foram preditas também, 15 ilhas genômicas, onde 4 delas são ilhas metabólicas (MI) e 7 são ilhas simbióticas (SI). As quatro MI são compartilhadas em comum com todas as linhagens analisadas aqui, enquanto duas das SI são compartilhadas pelas NCDO 2118 e KF147. Dentre os 98 genes relacionados a bacteriocinas (que podem auxiliar a regulação e secreção destas), identificamos 3, uma de cada classe (classes I, II e III); além disso, identificamos 5 regiões de fago, sendo 3 delas preditas como intactas. As proteínas preditas como secretadas em NCDO 2118 foram comparadas com as proteínas de Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403, considerada, em estudos recentes, como uma linhagem que não possui atividade probiótica. Assim, foram preditas 34 proteínas exclusivas de NCDO 2118, e neste conjunto, alguma(s) dela(s) pode(m) estar relacionadas com a sua capacidade probiótica. No geral, o alto grau de similaridade entre todas as linhagens apontam que as SI compartilhadas em comum entre NCDO 2118 e KF147 foram responsáveis pela relação próxima nas análises filogenômicas e também pela adaptação destas linhagens a plantas. As MI, por outro lado, são altamente conservadas entre as linhagens, como esperado, dado o uso destas em vários processos metabólicos industriais. Finalmente, as três classes de bacteriocinas podem ter um papel de grande importância contra invasão de linhagens competitivas ou influência no sistema imune do hospedeiro, além de poder estar envolvidas na característica probiótica desta linhagem. Lactic Acid Bacteria (LAB) compose one of the most biotechnologically important group of bacteria. In this group, Lactococcus lactis is highly important for its use in the production of many fermented products and macromolecules and its application in health improvement it is a Generally Regarded As Safe (GRAS) species. Since this scenario, Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118 (herein, NCDO2118) stands out as a xylose fermenter and GABA (gamma-aminobutyric acid) producer strain isolated from frozen peas. GABA can contribute to smooth muscle relaxation and present a hypotensor activity. However, despite of those important characteristics, few is known about the mechanisms involved in probiotic effects of this strain. In this context, the genomic area can help elucidating unresolved issues. The comparative genomics has revolutionized the recent studies, through determining the genome plasticity between different species and/or strains, helping in driving experimental studies. In this work, we have sequenced and manually curated the genome of NCDO2118. Besides, we have compared the genome of NCDO2118 with those of 5 additional L. lactis subsp. lactis, 6 Lactococcus lactis subsp. cremoris and 2 Lactococcus garvieae strains. We used the software Gegenees, Mauve and BRIG to perform phylogenomics, gene synteny and circular genome comparisons between the above mentioned species. Additionally, we have used GIPSy and Phast to predict genomic islands (GEIs) and phages, respectively. We have predicted secreted proteins using SurfG+ tool. In phylogenomics analyses, a high similarity was observed between NCDO 2118 and L. lactis subsp. lactis KF147 (herein, KF147), both isolated from plants. Besides, the gene synteny analyses have clearly shown a highly conserved gene order between both strains. We have also predicted 15 putative GEIs, where four are metabolic islands (MIs) and seven are symbiotic islands (SIs). The four MIs are commonly shared by all strains analyzed here, whereas two of the SIs are only shared by NCDO2218 and KF147. Finally, we have identified five phage regions and 3 bacteriocins, one of each class(classes I, II and III), along with 98 bacteriocin-related genes, which may support the regulation and secretion of the bacteriocins. The predicted secreted proteins of NCDO 2118 were compared with Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 proteins, considered recently as a non-probiotic strain. Therefore, 34 proteins were present exclusively in NCDO 2118 and some of them can have relationship with its probiotic ability. Altogether, the high degree of similarity between all strains point that the SIs commonly shared by both NCDO2118 and KF147 were responsible for the close relationship in phylogenomic analyses and also for the adaptation of those strains to plants. The MIs, on the other hand, are highly conserved between all strains, which is a expected feature given the use of those strains in metabolic processes in industry. Finally, the three classes of bacteriocins may have an important role against invasion of competing strains or influencing the host immune system, which may be involved in the probiotic characteristic of this strain.

Tecnologias de sequenciamento de nova geração têm o potencial para decifrar a diversidade genômica a um custo moderado. Corynebacterium pseudotuberculosis, é um parasita intracelular facultativo, responsável por causar enfermidades infecto-contagiosas de caráter crônico. A doença se apresenta de diferentes formas, de acordo com o hospedeiro acometido. Linhagens de C. pseudotuberculosis mostram alta adaptabilidade para diversos nichos ecológicos e são capazes de crescer em algumas fontes de carbono, bem como existem linhagens capazes de realizar a redução de nitrato. O objetivo deste trabalho é analisar e propor a via de redução de nitrato de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar Equi e identificar as enzimas que constituem a cadeia de transporte de elétrons através de análises in silico. Foram analisados 15 genomas completos de C. pseudotuberculosis, para identificação in silico da cadeia respiratória e da via de redução de nitrato. Genes constituintes destas vias foram identificados. Validação experimental foi realizada por fenotipagem e PCR. Com este trabalho inédito para a espécie pretende-se utilizar a genômica comparativa e validação experimental para tentar entender e caracterizar via metabólicas associadas a respiração ainda não conhecidas em C. pseudotuberculosis. Para se adaptar a uma ampla variedade de condições de crescimento e estresse ambiental, as bactérias possuem sistemas respiratórios modulares que as permitem aperfeiçoar a produção de energia em ambientes variáveis e que podem ser hostis. A composição do sistema respiratório é ajustada de acordo com condições específicas em que se encontram, por meio de uma complexa rede de regulação que as permitem sobreviver e prosperar em um determinado ambiente, tais como compartimentos intracelulares fagossomais de macrófagos humanos. Uma maior compreensão do metabolismo respiratório de C. pseudotuberculosis será de grande importância para o discernimento das interações patógeno-hospedeiro e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas futuras. Technologies for sequencing new generation have the potential to decode the genomic diversity at a moderate cost. Corynebacterium pseudotuberculosis is a facultative intracellular parasite, responsible for causing chronic infect-contagious illnesses. The disease presents itself in different ways, in accordance with the affected host. Lineages of C. pseudotuberculosis show high adaptability to different ecological niches and are able to grow in some carbon sources, besides the fact that some specific lineages are capable of achieving the nitrate reduction. The objective of this study is to analyze and propose the route of nitrite reduction of Corynebacterium pseudotuberculosis biovar Equi and to identify the enzymes that constitute the electron transport chain, through analysis in silico. A total of 15 complete genomes of C. pseudotuberculosis were analyzed, in order to identify the respiratory chain and the route of nitrate reduction in silico. Constituent genes of these routes have been identified. Experimental validation was performed through phenotyping and PCR. With this yet unpublished work for the species, comparative genomics and experimental validation are intended to be used, in order to try to understand and characterize metabolic routes associated with breathing still not known in C. pseudotuberculosis. To adapt to a wide range of growing conditions and environmental stress, bacteria have modular respiratory systems that allow them to improve energy production in variable environments, which can be hostile. The respiratory system composition is adjusted according to specific conditions in which they find themselves, by means of a complex network of regulation that allow them to survive and thrive in a particular environment, such as fagossomics intracellular compartments of human macrophages. A greater understanding of the respiratory metabolism of C. pseudotuberculosis will be of great importance to perceive the interactions between pathogen and host and for the development of therapeutic strategies in the future.

In the last decade, robust sequencing technologies have revolutionized the genomic science. As a result, comparative genomics is now recognized as a new discipline. Comparative microbial genomics exploits both similarities and differences in the genomes, proteome, trascriptome, and regulatory regions of different organisms to infer the evolutionary relations, along with conserved and unique characteristics of species. These analyses have resulted in some surprising biological discoveries in the recent past. This study presents comparative genomic analysis of multiple pathogenic and non-pathogenic bacteria from related species, to dissect the genomic information and to get insights into evolutionary relationships, conserved information and mechanisms of pathogenicity. Starting from genus Corynebacterium, 11 representative species are analysed and compared, resulting in 741 conserved Gene Families (GFs) in all of them, and significant intra-species proteome similarities (98-99%) were observed. Subsequently, the pan- (7059 GFs) and core genome (552 GFs) of genus Campylobacter is estimated. A detailed comparative pathogenomic study of Campylobacter fetus subspecies resulted in identification of common and novel regions associated with pathogenicity; and species specific virulence factors and vaccine candidates have been characterized. Furthermore, comparative genomics and pathogenomics analysis of the genus Helicobacter (46 genomes) is accomplished. 38 Helicobacter pylori were found to share 1,185 core gene families representing ~77% of the average genome size. The core essential genes families (EGFs) are ascertained, and explored for potential therapeutics against H. pylori. In conclusion, we propose that, these observed genomic variations, species specific features and core virulence factors will enhance understanding of the lifestyle of the organisms, and will contribute to the development of antibiotics, drugs and vaccines.

Foram depositadas no sítio do NCBI os genomas das linhagens 1002, C231, I19, PAT10 e FRC41 da Corynebacterium pseudotuberculosis, entre os anos de 2009 e 2011. Utilizou-se a pangenômica aliada à predição de proteínas exportadas, primeira etapa da Vacinologia Reversa (VR), sobre esses cinco genomas de C. pseudotuberculosis, uma metodologia que ao buscar alvos vacinais parte de um conjunto genomas completos, de predições in silico, ao invés de antígenos isolados por abordagens tradicionais. Dentre estas linhagens, adotou-se como modelos as linhagens 1002 e C231 que infectam caprinos e ovinos, respectivamente. Apesar da C. pseudotuberculosis causar outras doenças em animais como, por exemplo, equinos e bovinos, a escolha das linhagens 1002 e C231 como modelo baseou-se na importância da enfermidade linfadenite caseosa (LC). A LC é uma doença contagiosa crônica associada com perdas econômicas consideráveis e distribuída mundialmente. A inexistência de vacinas eficientes e métodos de diagnóstico contra a LC impulsionaram a pesquisa sobre os mecanismos moleculares da patogênese dessa bactéria. Para realizar a predição in silico de proteínas exportadas nas cinco linhagens de C. pseudotuberculosis, foi utilizado um pipeline com programas de predição de motivos proteicos de exportação combinados, no qual o resultado de processamento de um programa serve como parâmetro para iniciar o processamento de outros programas. De um total aproximado de 17 mil proteínas, nos cinco genomas, essa análise resultou em 750 proteínas preditas como secretadas. Dentre estas, foram preditas 139 e 149 proteínas secretadas nos genomas de C. pseudotuberculosis linhagens 1002 e C231, respectivamente. Dentre essas predições, foram confirmadas 87 e 77 proteínas como sendo secretadas, por meio de trabalhos de proteômica, nas linhagens 1002 e C231, respectivamente. Dentre essas proteínas, 55 são comuns a ambas as linhagens. Ao considerarmos a grande similaridade entre os genomas de C. pseudotuberculosis, supõemse que os resultados experimentais das linhagens modelos são válidos para as demais linhagens da espécie. Análises in silico sobre o potencial imunogênico do proteoma predito, juntamente com o proteoma comprovado experimentalmente, evidenciaram quinze proteínas detentoras de uma concentração maior de epitopos preditos por extensão da porção madura dessas proteínas. Dentre essas quinze proteínas, quatro se destacaram em termos de seus potenciais imunogênicos analisados in silico e estão em fase de testes experimentais na busca de vacinas, drogas e diagnósticos contra LC. Between the years of 2009 and 2011, the genomes of strains 1002, C231, I19, PAT10 and FRC41 of Corynebacterium pseudotuberculosis were deposited at the site of NCBI. We used pangenomics allied to the prediction of exported proteins on these five genomes as the first step of Reverse Vaccinology (RV), a methodology that aims at finding vaccines starting from in silico predictions of full genomes rather than isolated antigens by traditional approaches. Among all five strains, strains 1002 and C231, that infect goats and sheep respectively, were adopted as models. Although C. pseudotuberculosis also causes other diseases in animals, such as horses and cattle, the selection of strains 1002 and C231 as models was based on the importance of the disease caseous lymphadenitis (CLA) and also due to the high similarity degree between these genomes. CLA is a worldwide distributed chronic infectious disease associated with considerable economic losses. The absence of effective vaccines and diagnostics against CLA boosted research on the molecular mechanisms of pathogenesis of this bacterium. To predicted in silico exported proteins into five C. pseudotuberculosis strains, a combination of exportation motifs predicting programs were arranged in a pipeline, a schema were a program's processing result serves as initial parameter to initiate the processing of the other programs. We obtained 750 proteins predicted as secreted, out of approximately 17.000 proteins of the five genomes. Among these results, 139 and 149 were predicted as secreted proteins in strains 1002 and C231 respectively. Within these predictions, there were 87 and 77 proteins confirmed as secreted by proteomics studies in the strains 1002 and C231 respectively. Within these proteins, 55 are common to both model strains. The results obtained for the model strains were considered valid also for the other strains of this species. in silico analysis of the predicted immunogenic potential of the exoproteome, allied with the experimentally proven exoproteome demonstrated fifteen proteins owning a differential predicted epitope's concentration per protein's mature portion. Among these fifteen proteins, four stood out in terms of their in silico immunogenic potential and are currently under experimental tests in the search for vaccines, drugs and diagnosis against CLA.