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International audience; Compartmentalization is one of the fundamental principles which underly nuclear function. Numerous studies describe complex and sometimes conflicting relationships between nuclear gene positioning and transcription regulation. Therefore the question is whether topological landmarks and/or organization principles exist to describe the nuclear architecture and, if existing, whether these principles are identical in the animal and plant kingdoms. In the frame of an agroBI-INRA program on nuclear architecture, we set up a multidisciplinary approach combining biological studies, spatial statistics and 3D modeling to investigate spatial organization of a nuclear compartment in both plant and animal cells in their physiological contexts. In this article, we review the questions addressed in this program and the methodology of our work.; Modéliser l'architecture tri-dimensionnelle du noyau dans des cellules animales et végétales. L'organisation en comparti-ments est un des principes fondamentaux qui gouverne le fonctionnement du noyau. De nombreuses études montrent des relations complexes et parfois contradictoires entre la position d'un gène dans le noyau et son état transcriptionnel. Deux questions se posent : existe-t-il des principes généraux gouvernant l'organisation nucléaire, et, si oui, ces principes sont-ils analogues dans les règnes animal et végétal ? Dans le cadre d'un programme agroBI-INRA sur l'architecture nucléaire, nous avons développé une ap-proche multidisciplinaire combinant expériences biologiques, statistiques spatiales et modélisation en 3 dimensions pour analyser l'organisation spatiale d'un compartiment nucléaire dans des cellules animales et végétales, dans leur environnement physiolo-gique. Dans cet article, nous faisons une revue autour des questions posées dans ce programme et présentons la méthodologie de ce travail

Background: Embryonic development proceeds through finely tuned reprogramming of the parental genomes to form a totipotent embryo. Celis within this embryo will then differentiate and give rise to ali the tissues of a new individual. Early embryonic development thus offers a particularly interesting system in which to analyze functional nuclear organization. When the organization of higher-order chromatin structures, such as pericentromeric heterochromatin, was first analyzed in mouse emb1yos, specifie nuclear rearrangements were observed that correlated with embryonic genome activation at the 2-cell stage. However, most existing analyses have been conducted by visuai observation of fluorescent images, in two dimensions or on z-stack sections/projections, but only rarely in three dimensions (3D). Results: ln the p1*esent study, we used DNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to localize centromeric (minor satellites), pericentromelic (major satellites), and telomeric genomic sequences throughout the preimplantation pe1iod in naturally fertilized mouse embryos (from the 1-cell to blastocyst stage). Their distribution was then analyzed in 3D on confocal image stacks, focusing on the nucleolar precursor bodies and nucleoli known to evolve rapidly throughout the first developmental stages. We used computational imaging to quantify various nuelear parameters in the 3D-F ISH images, to analyze the organization of compa1tments of intNest, and to measure physical distances between these compartments. Conclusions: The results highlight differences in nuclear organization between the two parental inherited genomes at the 1-cell stage, i.e. just after fertilization. We aIso found that the reprog1*amming of the embryonic genome, which starts at the 2-cell stage, undergoes other remarkable changes during preimplantation development, particularly at the 4-cell stage.

International audience; Specific nuclear domains are nonrandomly positioned within the nuclear space, and this preferential positioning has been shown to play an important role in genome activity and stability. Well-known examples include the organization of repetitive DNA in telomere clusters or in the chromocenter of Drosophila and mammalian cells, which may provide a means to control the availability of general repressors, such as the heterochromatin protein 1 (HP1). We have specifically characterized the intranuclear positioning of in vivo fluorescence of the Caenorhabditis elegans HP1 homologue HPL-2 as a marker for heterochromatin domains in developing embryos. For this purpose, the wavelet transform modulus maxima (WTMM) segmentation method was generalized and adapted to segment the small embryonic cell nuclei in three dimensions. The implementation of a radial distribution algorithm revealed a preferential perinuclear positioning of HPL-2 fluorescence in wild-type embryos compared with the diffuse and homogeneous nuclear fluorescence observed in the lin-13 mutants. For all other genotypes analyzed, the quantitative analysis highlighted various degrees of preferential HPL-2 positioning at the nuclear periphery, which directly correlates with the number of HPL-2 foci previously counted on 2D projections. Using a probabilistic 3D cell nuclear model, we found that any two nuclei having the same number of foci, but with a different 3D probabilistic positioning scheme, can have significantly different counts in the 2D maximum projection, thus showing the deceptive limitations of using techniques of 2D maximum projection foci counts. By this approach, a strong perinuclear positioning of HPL-2 foci was brought into light upon inactivation of conserved chromatin-associated proteins, including the HAT cofactor TRAPP.

Ecole Doctorale: Des génomes aux organismes Diplôme : Dr. d'Université; La reprogrammation au cours de la fécondation et du développement pré-implantatoire de l’embryon fécondé in vitro (IVF) chez les mammifères est un processus complexe qui permet le retour à un état indifférencié des cellules hautement spécialisées que sont les gamètes lors de la syngamie, puis leur différenciation progressive en différent lignages cellulaires dans l’embryon. Ces processus comprennent des changements dans la structure de la chromatine, dans les modifications épigénétiques et dans l’architecture nucléaire des noyaux embryonnaires. L’objectif de cette étude était de mettre en place des approches pour la compréhension de ces processus dans les embryons précoces. Nous avons tiré parti de la comparaison entre embryons normaux (IVF) et issus de transfert de noyau ( NT) dans l’espèce bovine où le développement pré-implantatoire s’étant sur une période suffisamment longue pour caractériser la dynamique des événements de reprogrammation nucléaire avant la mise en route de l’activation majeure du génome embryonnaire. Dans une première approche, nous avons étudié la mise en place de l’hétérochromatine spécifique à l’embryon au cours de la période de reprogrammation dans les embryons bovins issus de fécondation et de NT. Nous avons utilisé deux marqueurs de l’hétérochromatine péricentrique : la protéine hétérochromatine 1(HP1-beta) et l’histone H3 tri-méthylée (H3K9me3) ; et un marqueur des centromètres (CENP A/B), de façon à caractériser les paramètres structuraux de l’hétérochromatine constitutive dans les premiers stades de développement embryonnaire. En utilisant des techniques d’immunofluorescence, nous avons pu observer les changements dynamiques dans l’organisation de l’hétérochromatine en relation avec l’origine des embryons. Dans les embryons IVF et une partie des embryons NT, l’hétérochromatine apparaît dans un état dispersé, et ceci jusqu’au stade 8-cellule ; puis sous une forme condensée qui correspond à l’association bien caractéristique de blocs d’hétérochromatine et d’H3K9me3 avec les centromètres, connues sous le nom de chromocentres. Cependant, une partie significative des embryons NT montrent une altération de la dynamique d’hétérochromatinisation révélée par une condensation précoce, dès le stade 2-cellule, de HP1 et H3K9me3. Dans une seconde approche, nous avons utilisé des cellules somatiques au stade de la sénescence comme cellules donneuses de noyau de façon à tester l’influence de l’organisation structurale du noyau donneur sur l’organisation structurale des noyaux dans les embryons clonés. Les arrangements tridimensionnels à large échelle de l’hétérochromatine dans les noyaux sénescents NT récapitulent la dynamique observée sans les embryons IVf ou NT issus de noyau de cellules non sénescentes. Notamment, les pourcentages d’embryons avec une hétérochromatine dispersée ou condensée prématurément sont comparables avec les études précédentes. Ces résultats suggèrent l’existence d’un processus de reprogrammation épigénétique robuste piloté par l’ovocyte dans les embryons précoces de bovins. Les cinétiques de restructuration du génome altérées dans une partie des embryons NT pourraient être liées à l’activation précoce de la transcription et l’augmentation du taux de méthylation qui ont été rapportées dans d’autres études. Le présent travail nous a permis de mettre en évidence une distinction entre des embryons NT avec une reprogrammation normale et des embryons NT avec une anomalie, au moins temporelle, de la reprogrammation épigénétique. Egalement, nous avons démontré que l’impact de l’organisation nucléaire de la cellule donneuse au niveau de l’hétérochromatine sur l’organisation structurale du noyau dans l’embryon NT est relativement modéré.