The aim of this thesis is development and application of different miniaturized strategies for detection of biomarkers. The biomarker PSA (prostate specific antigen), which is prostate cancer specific, has been the main focus of the thesis. The papers present two miniaturized strategies for biomarker detection, developed at the department, an antibody microarray and the ISET platform. The antibody microarray, based on a micro- and nanoporous silicon surface, which increases the sensitivity of the assay, was utilized to quantitatively measure the prostate cancer biomarker PSA. The microarray was also developed to measure the two forms of PSA: total PSA and free PSA, which together gives a better indication of the prostate cancer disease. The second platform for proteomic analysis, the in-house developed platform ISET, which is a sample preparation platform for MALDI mass spectrometry, was first redesigned to be able to handle more viscous samples and larger volumes. Subsequent to the new configuration of the ISET platform, three new applications were developed and published within the framework of this thesis; digestion and detection of the biomarker PSA, protein validation of recombinant protein production, and aptamers as affinity ligand rather than antibody to reduce the background from the affinity probe when performing digestion of the captured protein. The ISET sample preparation was also automated using liquid handling robotics for faster analysis in for example screening procedures. In addition to the microarray, the porous silicon surface was utilized to capture PSA and analyse through the use of reporter mass tags ionized in the mass spectrometry. Prostatacancer är en av de vanligaste förekommande cancerformerna. Många äldre män har cancerceller i sin prostata, men som tur är behöver inte all cancer behandlas eftersom den inte växer. I USA får ungefär 27% av alla män prostatacancer och cirka 10% dör av det. Vi har utvecklat en ny miniatyriserad metod för att påvisa prostatacancer (Paper I). Genom att titta på PSA (prostata specifikt antigen) i blod från en patient kan vi med samma tillförlitlighet som sjukhusen säga om patienten har prostatacancer eller inte. PSA är en molekyl som vid cancer finns i större mängd i blodet. Men bara för att man har mer PSA i blodet behöver det inte betyda att man har prostata cancer. Tanken med vår metod är att den i framtiden ska kunna mäta olika molekyler, även kallat biomarkörer, i blodet för att ge en bättre bild av sjukdomstillståndet, till exempel påvisa den aggressiva formen av prostatacancer. För att fånga upp intressanta molekyler i blodet använder vi antikroppar som naturligt tillhör kroppens immunförsvar, där de lokaliserar inkräktare såsom bakterier och virus. Antikropparna sätts fast på en yta som är porös och lätt kan binda många antikroppar på en liten yta. Ytans egenskaper gör att metoden lättare kan hitta mindre mängder biomarkörer i blodet för att bättre kunna fastställa sjukdomstillståndet, dvs. ökad känslighet i mätmetoden. Den nya metoden är utvecklad för prostatacancer men kan med modifiering användas till andra sjukdomar i framtiden. Vi har även vidareutvecklat en annan metod (Paper II), kallad ISET, som likt den förra metoden kan bestämma sjukdomstillstånd men även leta efter nya biomarkörer i blodet som kan påvisa sjukdomstillstånd. ISET-metoden letar även den upp en specifik molekyl med hjälp av t.ex. antikroppar, bland miljontals andra. När målmolekylen är fångad tvättar man i ISET:en bort det man inte vill titta på och klipper sedan sönder molekylen i mindre bitar, vilket är nödvändigt för att kunna analysera den. Man klipper på speciella ställen så man vet vilka storlekar man letar efter. Därefter skjuter man med en laser på ISET:en så att molekylbitarna flyger iväg i analysinstrumentet (masspektrometern). De minsta fragmenten flyger snabbast, och med hjälp av det bestäms exakt hur stora molekylbitarna är. När man tittar på molekylbitarna som kommit fram kan man avgöra om den molekylen man letade efter som man klippt sönder fanns i det ursprungliga provet. ISET:en hanterar små volymer av prov. Från mindre än en droppe blod kan man få reda på om molekylen man söker finns i provet. För att underlätta är ISET:en gjord i ett format som robotar kan hantera. Vi har visat att genom att använda ISET:en i en robot, har vi förminskat tiden från 30 minuter per prov till 5 minuter per prov (Paper IV). Vi har använt ISET:en för att hitta en speciell biomarkör i ett prov med miljoner andra molekyler, dvs. till att hitta PSA (Paper III), men även för att kontrollera ett producerat protein, så att det har fått rätt struktur (Paper IV). Olika molekyler kan användas för att fånga ut det önskade proteinet. I Paper VI jämför vi två olika molekyler, antikroppar och aptamerer. Det visar sig att i ISET:en är det bra att använda aptamerer, eftersom de inte klipps sönder inför masspektrometer analysen. Vi har även använt masspektrometern utan ISET:en för att titta på PSA i blodprover (Paper V). Den första antikroppsbaserade metoden på porösa ytor (Paper I) kan hitta en mindre mängd molekyler i ett prov än ISET:en, men ISET:en kan med större säkerhet säga att vi har hittat rätt molekyl vilket gör att de kompletterar varandra väl som olika miniatyriserade strategier för att finna biomarkörer.