Search

The hepatitis B virus core protein takes over a variety of functions during HBV infection and is regulated by posttranslational modifications. Here, we report SUMO modification as novel PTM, which represents a functional switch in core protein regulation. Core protein SUMO PTM is essential for viral DNA import and establishment of the viral persistence reservoir, the cccDNA. Inhibition of SUMOylation interfered with HBV infection and provides a new target for inhibiting HBV replication. Das Hepatitis B Virus Core Protein übernimmt eine Vielzahl von Aufgaben während der HBV Infektion und wird über posttranslationale Modifikationen reguliert. In dieser Arbeit wird die Modifikation mit SUMO als neue PTM beschrieben, die einen funktionalen Schalter der Core Protein Regulation darstellt. Core Protein SUMO PTM ist essentiell für den Kernimport der viralen DNA und die Etablierung der cccDNA als virale Persistenzform. Die Hemmung der SUMOylierung beeinträchtigte die HBV Infektion und bietet neue Ansätze zur Inhibierung der HBV Replikation.

This study focused on the molecular mechanisms of HBV, with the goal to identify a possible treatment. We revealed PML-NBs and post-translational modifications by SUMO have a fundamental impact on HBx protein and the whole HBV infection. Moreover, the association of HBV components to PML-NBs permitted the successful treatment of HBV via ATO administration. Thus, ATO represents a promising novel antiviral therapy against acute and chronic HBV infections, which is urgently required. Diese Arbeit untersuchte die molekularen Mechanismen von HBV mit dem Ziel einer möglichen Behandlung. Hier wurde gezeigt, dass die Lokalisation und posttranslationale Modifikation durch SUMO essenziell für das HBx Protein sowie die gesamte HBV Infektion ist. Des Weiteren ermöglichte die Assoziation von HBV Faktoren mit PML-NBs die erfolgreiche Behandlung von HBV durch ATO. Dies stellt eine vielversprechende und dringend erforderliche neue Therapie gegen akute und chronische HBV Infektionen dar.

In this thesis, mechanisms of immune suppression in tumors were studied. MDSCs transferred the reactive dicarbonyl methylglyoxal in direct cell-contact to CD8+ T cells, thereby inducing functional and metabolic paralysis. In further experiments it was shown that circulating acute myeloid leukemia cells suppressed NK cell effector functions via prostaglandin E2 secretion. The experiments presented in this thesis offer new therapeutic approaches that can be implemented into future immunotherapies. In dieser Arbeit wurden Mechanismen der Immunsuppression in Tumoren untersucht. MDSCs übertrugen das Dicarbonyl Methylglyoxal in direktem Zell-Kontakt auf CD8+ T Zellen und induzierten dadurch funktionelle und metabolische Paralyse. In weitergehenden Experimenten wurde gezeigt, dass zirkulierende Zellen der AML durch Sekretion von PGE2 die Effektor-Funktionen von NK Zellen supprimieren. Die in dieser Arbeit gezeigten Experimente eröffnen neue therapeutische Ansätze für künftige Immuntherapien.

After resolved viral liver infection, virus-specific liver CD8+ T cells separated into liver-resident CXCR6hi and circulating CX3CR1+ memory T cells. CXCR6hi T cells were present also during persistent viral liver infection, in contrast to absent CX3CR1+ TEM cells. However, these CXCR6hi T cells were dysfunctional, and their gene expression dominated by the transcription factor CREM/ICER. Enhanced cAMP signaling upstream of CREM/ICER hampered functionality, which was partially restored in ICER-deficient T cells. Hence, targeting cAMP signaling may be a promising strategy to reinvigorate dysfunctional resident T cells. Nach einer ausgeheilten viralen Leberinfektion teilen sich die Virus-spezifischen CD8+ T-Gedächtniszellen in Leber-residente CXCR6hi und zirkulierende CX3CR1+ T-Zellen. CXCR6hi T-Zellen waren auch während einer persistierenden Leberinfektion vorhanden, im Gegensatz zu CX3CR1+ TEM Zellen. Allerdings waren diese CXCR6hi T-Zellen dysfunktional und wiesen eine CREM/ICER-dominierte Genexpression auf. Erhöhtes cAMP-Signaling oberhalb des Transkriptionsfaktors CREM/ICER beeinträchtigte die Funktionalität, welche in ICER-defizienten T-Zellen teilweise wiederhergestellt war. Daher könnte der cAMP-Signalweg ein vielversprechendes therapeutisches Ziel zur Stärkung der Funktionalität dysfunktionaler residenter T-Zellen darstellen.

Die hier vorgestellte Precision-cut Liver Slice-Technik eignet sich zur Untersuchung von zellautonomer Immunität in murinen und humanen Leberzellen bei Lebererkrankungen wie Virushepatitiden, Steatohepatitis oder Leberzhirrose. Es wurde die nicht-kanonische CD8 T-Zell-Effektorfunktion untersucht, die einen zell-autonomen Abwehr-Mechanismus beschreibt, der unabhängig von der klassischen Antigenpräsentation in virus-infizierten Zellen zur spezifischen Eliminierung von infizierten Hepatozyten führt. The Precision-cut Liver Slice technique introduced here is suitable to study the mechanisms of cell-autonomous immunity in liver cells and bears the potential for translational research by using human liver tissue to characterize cell-autonomous immunity in human liver cells, in particular for liver diseases such as viral hepatitis, alcoholic or non-alcoholic steatohepatitis and liver fibrosis or cirrhosis, or for situations of therapeutic liver targeting such as gene therapy.

Sinusoidale Leberendothelzellen bilden eine der größten, funktionellen Leberzellpopulationen und übernehmen wichtige Aspekte der Leberfunktion, wie die Begrenzung des sinusoidalen Lumens oder der Antigen Prozessierung und Präsentation gegenüber von Immunzellen. In dieser Arbeit präsentieren wir Hinweise auf eine weitere Funktion, bei der die Antigenpräsentation zu CD8 T-Zellen im Rahmen von IL-6 trans-signaling zu der Produktion und Aktivierung des für die Leberregeneration notwendigen Hepatozyte Growth Factors führt. Sinusoidal Endothelial cells are the second largest liver cell population and are responsible for major tasks within the liver. They form the sinusoids and are able to process and present antigens towards cells of the immune system. Here we present data for an additional function where the Antigen presentation towards CD8 T-cells and the subsequent IL-6 trans-signaling lead to the production and activation of the Hepatocyte Growth Factor which is paramount for Liver regeneration.

In dieser Arbeit wurden Daten zur IgE-Reaktivität bzgl. rekombinanter Allergene und kreuzreaktiver Kohlenhydratseitenketten (CCD) von 269 Patienten mit Bienen- und/oder Wespengiftallergie ausgewertet. Hierdurch konnte u.a. die hohe Sensitivität und CCD-unabhängige Spezifität der Komponentendiagnostik mit rekombinanten Allergenen bei der Diagnose einer Insektengiftallergie bestätigt und eine bisher unterschätzte Rolle der Hyaluronidasen bei Kreuzreaktionen auf Bienen- und Wespengift gezeigt werden. Jedoch zeigte sich eine Abhängigkeit der IgE-Reaktivitäten vom angewendeten Testsystem: mittels Immulite-System wurden durchschnittlich höhere Werte als mit ImmunoCAP erzielt. In this study, IgE-reactivity to recombinant allergens and cross-reactive carbohydrate determinants (CCD) of 269 patients allergic to bee and/or wasp venom was analyzed. A high sensitivity and CCD-independent specificity of component-resolved diagnosis with recombinant allergens could be confirmed and the so far underestimated role of the major allergen hyaluronidase in cross-reactivity to bee and wasp venom could be pointed out. However, the extent of IgE-reactivity was dependent on the used diagnostic assay: values measured with the Immulite system were found to be higher than with the CAP system.

Im Rahmen der Dysregulation des Immunsystems nach Trauma sind die exakten immunologischen Mechanismen bis dato nicht final geklärt. In dieser experimentellen Arbeit wurde in einem murinen Traumamodell unter dem Einsatz von gendefizienten Tieren gezeigt, dass Thrombozyten und regulatorische CD4+ T-Zellen posttraumatisch über direkte Zell-Zell-Signalübertragung via CD40L und P-Selektin interagieren und somit ein neuer Aspekt im Verständnis potenziell protektiver immunologischer Prozesse generiert. In the context of the dysregulation of the immune system after trauma, the exact immunological mechanisms have not yet been finally determined. In this experimental study, employing gene-deficient animals in a murine trauma model, platelets and regulatory CD4+ T cells were shown to posttraumatically interact through direct cell-cell signaling via CD40L and P-selectin, thus generating a new aspect in understanding potentially protective immunological processes.

This project studied the outcome of liver sinusoidal endothelial cell (LSECs) crosstalk with natural killer T-cell (NKT). We have identified an important so far unknown role of LSECs to present lipid-antigens on CD1d molecules to NKT cells, which leads to an indirect activation of CXCR6+ CD8 memory T-cells and NK cells. We believe that our findings raise the prospect of harnessing the interplay between ECs and NKT cells as well as immune effector cells locally in liver sinusoids and may help to design future immune therapies to increase intrahepatic immunity against infection or cancer. Dieses Projekt untersuchte das Ergebnis des Übersprechens von sinusförmigen Leberendothelzellen (LSECs) mit natürlichen Killer T-Zellen (NKT). Wir haben eine wichtige bisher unbekannte Rolle von LSECs bei der Präsentation von Lipidantigenen auf CD1d-Molekülen für NKT-Zellen identifiziert, was zu einer indirekten Aktivierung von CXCR6 + CD8 Speicher T-Zellen und NK Zellen führt. Wir glauben, dass unsere Ergebnisse die Aussicht auf eine Nutzung des Zusammenspiels zwischen ECs und NKT Zellen sowie Immuneffektorzellen lokal in Lebersinusoiden erhöhen und dazu beitragen können, zukünftige Immuntherapien zu entwickeln, um die intrahepatische Immunität gegen Infektionen oder Krebs zu erhöhen.

Intrahepatic myeloid-cell aggregates form in response to Toll-like receptor 9 (TLR9) signaling in a TNF-dependent fashion and provide a unique anatomic structure that drives local proliferation of cytotoxic CD8 T cells (iMATEs) and confers protection against viral infection. Yet, the identity and functional profile of the iMATE-defining myeloid cell population remained elusive. The current study was undertaken to identify the iMATE-forming myeloid cell population to gain mechanistic insights into iMATE-formation and T cell expansion and to characterize a molecular marker that predicts iMATE-formation. The phenotype of myeloid cells in the murine liver after TLR9 activation was analyzed systematically using a set of different methodologies. Initial flow cytometric phenotypic characterization and tSNE analysis revealed a complex composition of monocytes and newly differentiating macrophages that hinted towards a sequential replacement of liver-resident macrophages followed by repopulation through bone marrow derived inflammatory monocytes. Laser-capture microdissection and genome wide analysis of gene expression identified a set of marker proteins that were validated by flow cytometry and led to the definition of a particular phenotype of CD40-expressing monocyte-derived macrophages that are exclusively found in iMATEs but not elsewhere in the host. Further genomic characterization employing RNA sequencing revealed substantial differences to liver-resident Kupffer cells and identified specific metabolic properties relevant for local induction of immunity. Functional assays of these iMATE-defining monocyte-derived macrophages revealed metabolic competence with high-level glycolysis and revealed that these cells are highly potent in the induction of CD8 T cell proliferation, in the differentiation towards GzmB expression rendering them efficient killer cells and in cross-presenting soluble antigens to CD8 T cells. Liver macrophages, in contrast, displayed a low glycolytic rate and failed to provide any support for T cell proliferation and did not show significant cross-presentation capacity. The transient presence of iMATE-defining monocyte-derived macrophages in the liver indicates that protective hepatic T cell immunity is determined by the dynamics of the changes in inhibitory vs stimulatory macrophage populations, that do not fall into the conventional M1/M2 categories but are related to iMATE formation. Intrahepatischer myeloider Zellaggregate (iMATEs) bilden sich auf Grund des durch Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) induzierten TNF Signalings. Sie stellen einzigartige anatomische Strukturen da, die die lokale Proliferation zytotoxischer T Zellen fördern und Schutz gegen virale Infektionen darstellen. Die Identität und das funktionale Profil der iMATE-bildenden Zellen sind bis jetzt noch unbekannt. Sie sollten mit Hilfe der vorliegenden Studie identifiziert werden, um Einblicke in die mechanistischen Vorgänge der iMATE Bildung und T Zellexpansion zu gewinnen. Des Weiteren sollte ein molekularer Marker für die Prognostik der iMATE Formation bestimmt werden. Der Phänotyp der myeloiden Zellen in der murinen Leber nach der Anwendung des Liganden für TLR9 wurde mit Hilfe verschiedener Methoden systematisch analysiert. Die initiale phänotypische Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und tSNE Analyse offenbarte eine komplexe Zusammensetzung von Monozyten und neu differenzierten Makrophagen. Alles wies darauf hin, dass leberresidente Makrophagen nach und nach durch inflammatorische Monozyten aus dem Knochenmark ersetzt werden. Eine Gruppe von Markerproteinen wurden mit Laser-Mikrodissektion und anschließender genomweiter Analyse der Genexpression bestimmt und durchflusszytometrisch validiert. Dabei konnte ein bestimmter Phänotyp CD40 exprimierender von Monozyten abstammender Makrophagen definiert werden, der nur in iMATEs auftaucht. Weiterführende genomische Charakterisierung durch RNS Sequenzierung konnte zeigen, dass substanzielle Unterschiede zwischen CD40 exprimierender von Monozyten abstammender Makrophagen und leberresidenten Kupfferzellen bestehen. Des Weiteren wurde spezifische metabolische Fähigkeiten identifiziert, die für die Induktion lokaler Immunität von großer Bedeutung sind. Die metabolische Kompetenz der iMATE definierenden von Monozyten abstammender Makrophagen wurde mit Hilfe funktioneller Assays untersucht und zeichnete sich vor allem durch eine hohe glykolytische Aktivität aus. Darüber hinaus sind diese Zellen äußerst potent in der Kreuzpräsentation löslicher Antigene zu T-Zellen und der Induktion von T-Zellproliferation und Differenzierung hin zur Granzyme B Expression, was diese Zellen zu effizienten Killerzellen macht. Im Gegensatz dazu konnte bei Lebermakrophagen nur eine geringe glykolytische Rate festgestellt werden. Die T-Zellproliferation wurde nicht unterstützt und eine signifikante Kreuzpräsentationskapazität konnte nicht festgestellt werden. Die transiente Präsenz iMATE-definierender von Monozyten abstammenden Makrophagen in der Leber spricht dafür, dass die protektive hepatische T-Zellimmunität durch die dynamischen Veränderungen in den Populationen der inhibitorischen und stimulatorischen Makrophagen, die nicht in die konventionellen M1/M2 Kategorien fallen, bestimmt wird und mit der Bildung von iMATEs zusammenhängt.

This study aimed at deciphering, whether RNF43 has a tumor suppressive function in the stomach and by which signaling pathway it acts as a tumor suppressor. We found that RNF43 has a tumor suppressive function in the stomach and negatively regulates stemness in gastric cells. Furthermore, we showed that RNF43 is involved in DNA damage response and regulates susceptibility to DNA damage-inducing radio- and chemotherapy. Thus, we propose RN43 as a new potential biomarker to stratify gastric cancer patients for therapy selection. Diese Studie zielte darauf ab, zu entschlüsseln, ob RNF43 im Magen als Tumorsuppressor fungiert und über welchen Signalweg es als solcher wirkt. Wir fanden heraus, dass RNF43 eine tumorunterdrückende Funktion im Magen hat und Stammzelleigenschaften in den Magenzellen negativ reguliert. Darüber hinaus zeigten wir, dass RNF43 an der DNA Schadensantwort beteiligt ist und die Anfälligkeit für DNA-Schäden verursachende Radio- und Chemotherapie reguliert. Daher schlagen wir RN43 als neuen potenziellen Biomarker vor, der Magenkrebspatienten für die Therapiewahl stratifiziert.

Diese Arbeit zeigt, dass CXCR6+CD8+ T-Zellen innerhalb einer nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) ohne die Erkennung eines Antigens Leberschäden verursachen. Für die Pathogenität dieser Zellen ist die deutliche Herunterregulation des Transkriptionsfaktors Foxo1, die Umsetzung der kurzkettigen Fettsäure Acetat sowie die metabolische Aktivierung des purinergen Rezeptors P2XR7 entscheidend. Durch diese Mechanismen können metabolisch-aktivierte von antigen-spezifischen CD8 T-Zellen unterschieden werden und erklären wie Leberschäden während einer sterilen Entzündung zustande kommen. This study shows that CXCR6+ CD8+ T cells cause antigen-independent liver damage during non-alcoholic steatohepatitis (NASH). The pathogenicity of these cells is governed by significant downregulation of the transcription factor Foxo1, utilization of the short-chain fatty acid acetate and activation of the purinergic receptor P2XR7. These mechanisms discriminate metabolically-activated CD8+ T cells from antigen-activated CD8+ T cells and explain how these cells mediate liver damage under sterile, chronic inflammation.

In vielen Karzinomen findet sich ein Funktions- oder Expressionsverlust des putativen Metastasierungssuppressors, des Tetraspanins KAI1. In metastasierten Mammakarzinomzellen konnte zudem eine Splice-Variante des KAI1-Proteins nachgewiesen werden. In dieser Dissertation wurden die tumorbiologischen Effekte der beiden KAI1-Proteine auf die zelluläre Proliferation, Adhäsion sowie deren Wechselwirkungen mit dem Integrin alpha v beta 3 und dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor untersucht. Hierfür wurde ein vermeintliches Mammakarzinommodell der Zelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435 kreiert und stabile Transfektanten generiert, die eine erhöhte Expression von entweder KAI1-WT oder KAI1-SP zeigten. Die Daten unterstreichen die differentiellen molekularen Wechselwirkungen und die damit einhergehenden funktionellen Effekte der beiden KAI1-Varianten und deuten darauf hin, dass durch die Expression von KAI1-SP die metastasierungssuppressiven Funktionen von KAI1-WT nicht nur außer Kraft gesetzt werden, sondern dessen Splicen sogar tumorbiologische Effekte auslöst, welche die Tumorprogression und Metastasierung stimulieren. The putative metastasis suppressor and tetraspanin KAI1 is downregulated or lost in many cancers. In metastatic breast cancer, a splice variant of KAI1 has been identified, going along with poor prognosis. This dissertation examines the tumor biological effects of both KAI1-proteins on cellular proliferation, adhesion and their interaction with the integrin alpha v beta 3 and the epidermal growth factor receptor. Therefore, we created a presumed breast cancer cell model, consisting of MDA-MB-231 and MDA-MB-435, and generated stable transfected cells showing either an overexpression of KAI1-WT or KAI1-SP. These data underline the different molecular interactions and functional effects of the two KAI1 variants and indicate that the splice variant of KAI1 does not only abrogate its metastasis suppressive functions. In fact, KAI1-SP rather promotes tumor biological effects that stimulate cancer progression and metastasis.

Metastasis is the most common cause of cancer-related death. However, current treatment options are very limited. This thesis shows a clear correlation between lymphotoxin (LT) expression, LTßR signaling and liver metastasis. Hepatic stellate cells (HSCs) are identified as critical integrators of LT signals in the liver and, furthermore, two potential downstream mechanisms enabling increased liver metastasis formation through increased expression of MMP-9 and MAdCAM1 in HSCs are described. Metastasierung ist die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten sind jedoch sehr begrenzt. Diese Dissertation zeigt eine klare Korrelation zwischen Lymphotoxinexpression (LT), LTßR-Signalgebung und Lebermetastasierung. Hepatische Sternzellen (HSCs) werden als kritische Integratoren von LT-Signalen in der Leber identifiziert und darüber hinaus werden zwei mögliche nachgeschaltete Mechanismen beschrieben, welche eine erhöhte Lebermetastasierung durch eine erhöhte Expression von MMP-9 und MAdCAM1 in HSCs ermöglichen.

Um Mechanismen der Viruspersistenz in der Leber zu untersuchen, wurden zwei experimentelle Systeme für hepatotrope Virusinfektionen etabliert. Es zeigte sich, dass die Antigenmenge und Antigenverteilung über einen chronischen oder akuten Verlauf entscheiden. Darüber hinaus wurde eine neue Form der Immunevasion von infizierten Zellen identifiziert, bei der Hepatozyten mit niedriger viraler Antigenexpression einer zytotoxischen CD8 T-Zell-Effektorfunktion entgehen To unravel factors responsible for viral persistence in the liver, two different experimental systems for hepatotropic virus infections have been established. Antigen levels and distribution have been identified as determining factors for development of chronic infection. Moreover, a novel mechanism of immune evasion was identified, whereby infected hepatocytes expressing low levels of viral antigen could escape CD8 T cell effector function.

There are around 260 million people suffering from chronic Hepatitis B infection. There is no immunotherapy for a functional cure of chronic HBV infection so far. Here we have shown that the combination of therapeutic vaccination and injection of a TLR9-ligand (CpG) increased the efficacy of vaccination to overcome HBV-specific immune tolerance even in high-viremic preclinical HBV infection models. This approach enhanced immune control of HBV in preclinical models of persistent HBV infection. Insgesamt leiden etwa 260 Millionen Menschen an einer chronischen HBV Infektion. Eine wirksame Immuntherapie gegen eine chronische HBV-Infektion ist derzeit noch nicht verfügbar. Wir konnten hier zeigen, dass die Kombination aus therapeutischer Vakzinierung und CPG-Injektion eine erhöhte Wirksamkeit der Impfung zur Folge hatte. Die HBV-spezifische Immuntoleranz konnte selbst in präklinischen Infektionsmodellen mit hoher Viruslast überwunden werden, was zu einer verbesserten Immunkontrolle führte.

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection represents a major health concern and is associated with a high risk of developing hepatocellular carcinoma (HCC). More than 800,000 people die from HBV-associated diseases every year. In this thesis, immunotherapeutic strategies based on therapeutic vaccination and adoptive T-cell transfer have been demonstrated to have great potential towards cure of chronic HBV infection. New mouse models for chronic HBV infection as well as HCC were generated and evaluated and might represent powerful tools to study other therapeutic interventions. Die chronische Hepatitis B Virus (HBV) Infektion stellt ein großes Gesundheitsproblem dar und ist mit einem hohen Risiko verbunden, an hepatozellulärem Karzinom (HCC) zu erkranken. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass immuntherapeutische Strategien, die auf therapeutischer Vakzinierung und adoptivem T-Zell-Transfer basieren, großes Potential zur Heilung chronischer HBV Infektionen besitzen. Neue Mausmodelle für chronische HBV Infektion sowie HCC wurden entwickelt und evaluiert und repräsentieren leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung unterschiedlicher therapeutischer Ansätze.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die TNF-vermittelte Signalweiterleitung in Hepatozyten, welche spezifisch in virus-infizierten Zellen Apoptose induziert. Die Induktion der Apoptose wird über eine Calcium-induzierte mitochondriale Permeabilitätstransition ausgelöst und ist unabhängig von einer Caspase 8 Aktivierung. Die Spezifität kommt durch eine Virus-vermittelte Minderung der Belastbarkeit der Mitochondrien zustande. HBV hingegen kann die TNF-vermittelte Induktion der Apoptose inhibieren. The present thesis specifies the TNF-mediated signal transduction in hepatocytes that induces apoptosis specifically in virus infected cells. Thereby the apoptosis induction is mediated by calcium leading to mitochondrial permeability transition, independent of caspase 8 activation. The specificity is mediated via increased vulnerability of mitochondria upon virus infection. Interestingly HBV can inhibit the TNF-mediated apoptosis induction.

Der Prozess der Leberschaden-vermittelten Immunregulation tritt nur in CD8 T-Zellen auf, die ihr spezifisches Antigen in der Leber erkennen. Da die Eliminierung viraler Infektionen zwangsläufig mit Leberschaden einhergeht, liefert die vorliegende Arbeit Grund zur Annahme, dass eine bisher unbekannte negative Rückkopplungsschleife, durch Abschalten von CD8 T-Zellen, zur Gewebeprotektion und gleichzeitig zur Entwicklung einer chronischen Infektion in der Leber beiträgt. Our findings may reveal a negative regulatory feed-back loop with tissue-protective properties in the tolerogenic liver micro-environment where liver damage impairs further anti-viral CD8 T cell immunity – which in consequence would result in persistent infection. The findings may help to develop new immunotherapeutic strategies for the treatment of chronic viral infections or may improve already existing immunotherapeutic therapies.

Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der Umgebungsbedingungen einer Wunde auf die an der Wundheilung beteiligten Zellen zu untersuchen. Mesenchymale Stammzellen (MSC's) wurden in einem Modell verschiedenen Wundbedingungen, wie etwa einer Hypoxie und verschiedenen Temperaturen, ausgesetzt, und auf Viabilität und Stoffwechsel untersucht. Um den in einer Wunde vorhandenen Sauerstoffmangel zu simulieren, wurde Vollblut verschiedenen Hypoxie-Stufen ausgesetzt mittels variierender Blutzellkonzentrationen. Aus den Plasma der hypoxischen Blutkulturen wurden pro- und antiangiogenetische Proteine bestimmt. The aim of this study was to analyze the effects of a wound microenvironment on the living cells involved in the wound healing process. For this purpose, mesenchymal stem cells (MSC's) were studied under varying wound conditions (hypoxia, different temperatures) and the cellular response and viability was analyzed. To simulate the hypoxia in a wound, full blood samples were exposed to different levels of hypoxia through varying blood cell concentrations. The synthesis of pro- and anti-angiogenic factor production under cell-mediated hypoxia was studied.

In dieser Arbeit wurde der PI3K-Signalweg, eine Hauptsignalkaskade des Kras Onkogens, anhand von Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) analysiert. Verglichen wurden MEFs mit alleiniger und kombinierter PIK3CAH1047R/+- bzw. KrasG12D/+-Mutation. Es zeigte sich, dass eine PI3K-Signalweg-Aktivierung in MEFs zu reduzierter Seneszenz, Stimulation von Proliferation und Phosphorylierung von Effektorproteinen führt. Durch Behandlung mit den Inhibitoren GDC-0941 und MK-2206 waren diese Effekte blockierbar. This thesis focused on the analysis of the PI3K signalling pathway, one of the main pathways downstream of Kras onkogene, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In the trials MEFs with exclusive and combined PIK3CAH1047R/+- or KrasG12D/+-mutation were compared. Activation of the PI3K signalling pathway in MEFs was associated with reduced senescence, stimulation of proliferation and phosphorylation of downstream effectors. The inhibitors GDC-0941 and MK-2206 were able to block this effects.

In 91 Stimulations-Zyklen für IVF wurden bei 71 rekrutierten Kinderwunsch-Patientinnen Hormon- und Knochenstoffwechselparameter zu 4 Zeitpunkten analysiert. Der zyklische Verlauf von FSH hatte im Repeated Measures Model positiven Einfluss auf den Verlauf des Knochenabbauparameters CTX (p=0,0001), was die These eines direkten Einflusses von FSH auf den Knochenstoffwechsel unterstützt. Zudem waren CTX und OC im generalisierten Modell sign. höher, wenn ein anovulatorischer Zyklus vorausging. Die Stimulation mit rFSH führte in der Lutealphase nach Stimulation zu höheren Knochenstoffwechselparametern, als die Stimulation mit HMG (n.s.). In 91 IVF-cycles we analysed hormonal- and bone turnover markers of 71 patients undergoing hormonal stimulation with either HMG(LH/FSH) or rFSH alone at 4 timepoints per cycle. The course of FSH positively influenced the course of bone resorption parameter CTX (p=0,0001), supporting the thesis of FSH increasing bone turnover. Furthermore, in the generalized model CTX and OC were significantly higher in cycles following anovulatory cycles. Stimulation with rFSH mono lead to higher bone turnover markers in the luteal phase after stimulation than the stimulation with HMG.

Die onkolytische Virotherapie stellt ein vielversprechendes Therapiekonzept für das Blasenkarzinom dar. Die Replikation unserer onkolytischen Adenoviren ist von der nukleären Lokalisation des multifunktionalen Onkoproteins YB-1 abhängig. Beim Blasenkarzinom korreliert die YB-1-Expression mit der Invasivität, dem Tumorstadium und der Prognose. Die Daten zeigen eine effektive Replikation der onkolytischen Adenoviren in Harnblasenkarzinomzellen und eine starke Zelllyse. Zudem wurde das immunogene Potenzial der YB-1 abhängigen Viren aufgezeigt, welches ein bedeutender Faktor für einen Therapieerfolg sein könnte. Oncolytic virotherapy is a promising concept to treat bladder cancer. The replication of our oncolytic adenovirus depends on the nuclear localization of the multifunctional oncoprotein YB-1. In bladder cancer high YB-1 expression is associated with tumor growth, invasion and decreased overall survival. The results of this work show strong oncolytic activity and effective replication of the oncolytic adenovirus in bladder cancer cell lines. Furthermore, we analyzed the immunogenic potential of YB-1 based virotherapy, which might be a crucial factor for therapeutic success.

RIG-I/MAVS und cGAS/STING sind Signalwege des Immunsystems zur Erkennung von spezifischen RNS- oder DNS-Mustern. Die Arbeit zeigt, dass endogene und gezielte therapeutische Aktivierung dieser Signalwege den Darm vor Gewebeschaden nach Bestrahlung oder Chemotherapie und während der Graft-versus-Host-Krankheit nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation schützt. Die Aktivierung von RIG-I/MAVS und STING führt hierbei zu einer Typ I Interferon Antwort, welche die Barrierefunktion der Darmschleimhaut in vivo schützt und das Wachstum von intestinalen epithelialen Stammzellkulturen in vitro fördert. RIG-I/MAVS and cGAS/STING are innate recognition pathways that sense specific RNA or DNA patterns. The study shows that endogenous and targeted activation of these pathways reduces intestinal injury after irradiation or chemotherapy and during graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Activation of RIG-I/MAVS and STING results in a type I interferon response that protects intestinal mucosal barrier function in vivo and promotes growth of intestinal organoids in vitro.

In dieser Arbeit wurde bei 88 Patienten mit isoliertem Komplex-I-Defekt der mitochondrialen Atmungskette ein Hochdurchsatz-Mutationsscreen etabliert. Alle 45 Strukturuntereinheiten sowie die Assemblierungsfaktoren NDUFAF1, NDUFAF2 und ECSIT wurden mittels hochauflösender Schmelzpunktanalyse (HRMA, High Resolution Melting Analysis) untersucht. Bei zwölf Patienten wurden bekannte pathogene bzw. unbekannte wahrscheinlich pathogene Mutationen identifiziert (14%) und deren genetische Diagnostik damit erfolgreich abgeschlossen. Bei 25 Patienten wurden seltene Varianten unklarer Kausalität (29 %) gefunden. Die molekulargenetische Diagnostik für Patienten mit Komplex-I-Defekt konnte durch Etablierung dieses Mutationsscreens erweitert und verbessert werden. A large-scale mutation screen in 88 patients with isolated complex-I-deficiency of the mitochondrial respiratory chain was performed by high-resolution melting curve analysis (HRMA). All 45 subunits of complex I and the assemblyfactors NDUFAF1, NDUFAF2 and ECSIT were investigated. Known causative and unknown likely-causative mutations were detected in 12 patients. Thus, a molecular diagnosis related to complex I deficiency was established in 14% of patients. In further 25 patients variants of unknown significance (VUS) were found (29 %). Establishing this mutation screen has improved the moleculargenetic diagnostics for complex-I-patients.

The present study combines the benefits of transcript therapy with the principle of suicide cancer treatment by examining chemically modified mRNAs coding for the A-chains of two bacterial toxins (diphtheria toxin and subtilase cytotoxin) and of the plant toxin abrin-a for their anti-tumor efficacy. Applying two different cancer cell lines, toxin-related cytotoxicity is established in vitro, apoptotic characteristics of cell death examined and reduction in tumor growth demonstrated in vivo. Ziel der Studie ist die Verbindung der Vorteile der Transkripttherapie mit den Prinzipien der suizidalen Krebsbehandlung. Hierzu werden chemisch modifizierte mRNAs, die für die A-Ketten zweier bakterieller Toxine (Diphtherietoxin und Subtilase Zytotoxin) und des Pflanzentoxins Abrin-a kodieren, auf ihre Anti-Tumoreffektivität untersucht. Unter Verwendung zweier Krebszelllinien wird die toxin-bezogene Zytotoxizität in vitro festgestellt, apoptotische Charakteristika des Zelltods untersucht und eine Verminderung des Tumorwachstums in vivo nachgewiesen.

Die einzige kausale Therapie bei Typ-I-Allergien ist die allergenspezifische Immuntherapie (ASIT), an deren Wirkungsverbesserung beständig gearbeitet wird. In dieser Arbeit wurde die Rolle des Zytokins TNFα bei der ASIT im Mausmodell untersucht. TNFα wurde mit Hilfe eines Anti-TNFα-Antikörpers geblockt. Es erfolgte eine bronchoalveoläre Lavage mit Zelldifferenzierung und Messung von Zytokinen im BAL-Fluid. Im Serum wurden Antikörper bestimmt. Es zeigten sich im ersten Versuch deutliche Tendenzen, dass die Blockade von TNFα die Effizienz der ASIT mindert. Das Ergebnis konnte in den Folgeversuchen nicht mehr nachvollzogen werden, am ehesten aufgrund experimenteller Details, die zu einer insuffizienten Blockade von TNFα führten. The only curative treatment of type-I-allergy is allergen-specific immunotherapy (ASIT); therefore, recent research has focused on improving the outcome of this therapy. This thesis investigated the impact of the cytokine TNFα on allergen-specific immunotherapy in a murine model. TNFα was blocked by an anti-TNFα-antibody. After bronchoalveolar lavage, cells were counted and differentiated. Cytokine levels were determined, and serum antibodies were measured. The first trial showed a general trend towards impaired efficiency of ASIT in the absence of TNFα. This tendency could not be confirmed in the following trials, most likely due to experimental details resulting in the insufficient blockade of TNFα.

Effiziente und flexible Systeme zur Überexpression und zum Knockdown von Genen in murinen Hepatozyten in vivo sind essenziell für translationale Mausmodelle. Hier wird ein neues induzierbares Transfektionsmodell basierend auf der hydrodynamischen Schwanzveneninjektion in Kombination mit dem Sleeping Beauty-Transposon-System vorgestellt, das die konstitutive Expression einer CreER mit der Doxycyclin-induzierbaren Expression eines Transgenes oder einer miR-shRNA kombiniert. Efficient and flexible systems for overexpression and knockdown of genes in murine hepatocytes in vivo are essential for translational mice models. Here, we present a novel inducible transfection model based on the hydrodynamic tail vein injection in combination with the sleeping beauty transposon system that combines the constitutive expression of a CreER with the doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA.

Brustkrebs bei Frauen bzw. Prostatakarzinom beim Mann sind die jeweils häufigsten Tumorentitäten weltweit. Die perkutane Strahlentherapie spielt in der Tumorbehandlung in definitiver Form, in adjuvanter Form nach der Operation und/oder Chemotherapie sowie in der Rezidiv-Therapie eine wichtige Rolle. Ich habe im peripheren Blut von insgesamt 40 Brustkrebspatientinnen und ca. 35 Prostatakrebspatienten die Veränderung der Gesamtlymphozyten und ihrer Subgruppen vor, während und nach lokaler Strahlentherapie untersucht und verglichen. Breast cancer in women and prostate cancer in men are the most common cancer entities worldwide. Local radiotherapy forms one of the most important columns in cancer treatment. In first line, in form of adjuvant therapy after surgery and/or chemotherapy, or even in the therapy of tumor relapse. In this work I analyzed lymphocytes and their subpopulations in peripheral blood of 40 breast cancer patients and ca. 35 prostate cancer patients before, during and after local radiotherapy.

In dieser Arbeit wurde der koff-rate-Assay vom murinen auf das humane System übertragen. Der Assay ist eine neue Methode zur Messung der Dissoziationskinetiken von monomeren pMHCI-Molekülen von T-Zell-Rezeptoren (TCR) an lebenden CD8+ T-Zellen. Reversibel polymerisierte, fluoreszenzmarkierte pMHC-Moleküle binden stabil an TCR. Nach schlagartiger Monomerisierung diffundieren die pMHC-Moleküle mit messbaren Kinetiken von den TCR ab. Da der Assay nicht analog übertragen werden konnte, wurden die Probleme analysiert und ein Lösungsansatz entwickelt. In this work the koff-rate-assay has been transferred from the murine to the human setup. The assay is a new method to measure dissociation kinetics of monomeric pMHCI molecules from T cell receptors (TCR) on living CD8+ T cells. Reversibly polymerized, fluorescence-marked pMHC molecules bind stably to TCR. After sudden monomerization the pMHC molecules dissociate from the TCR with distinct kinetics that can be measured. Since an analogous transfer to the human system was not possible, the problems were analyzed and a new approach was developed.

NBIA – Neurodegeneration mit Eisenablagerung im Gehirn – ist eine Gruppe seltener progressiv verlaufender, zum Großteil autosomal-rezessiv vererbter Erkrankungen. Neben Mutationen in PANK2 (Pantothenatkinase-2) verursachen auch Mutationen in dem bislang unbekannten Gen C19orf12 einen NBIA-Phänotyp. Als Grundlage für funktionelle Studien wurde in dieser Arbeit ein polyklonaler Anti-Kaninchen-anti-C19orf12-Antikörper generiert. Mit Hilfe des Antikörpers konnte C19orf12 subzellulär in Fibroblastenmitochondrien detektiert werden. NBIA – Neurodegeneration with brain iron accumulation – is a group of orphan diseases with a progressive clinical course predominantly inherited in an autosomal-recessive way. Beside mutations in PANK2 (Pantothenatkinase-2), mutations in the recently identified gene C19orf12 lead to a NBIA phenotype. An anti-rabbit anti-C19orf12 antibody was created to enable functional studies. Using the antibody, C19orf12 was localized to mitochondria in fibroblasts.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Blutproben von Karzinompatienten auf den Hsp70 Protein- und Antikörpergehalt untersucht. Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist ein zytoprotektives, intrazellulär in gesunden Zellen vorkommendes Protein. Es gelang, Serum von Karzinompatienten mittels ELISA Technik zu messen und ein erhöhtes Hsp70 Protein Level (Knochentumoren, HNO-Tumoren, Prostatakarzinome) im Vergleich zu Gesunden aufzuzeigen. Mittels Hsp70 spezifischem Monitoring können in Zukunft Studien um einen potentiell prognostischen Marker ergänzt werden. This study looked at blood samples (serum) from cancer patients and their heat shock protein 70 (Hsp70) protein and antibody levels. Hsp70, which in healthy cells is an intracellular occurring protein that fulfills cytoprotective functions, was analyzed via ELISA. Our results show that the serum of cancer patients (bone, ENT, prostate cancers) has increased Hsp70 protein levels compared to healthy donors. Hsp70-specific monitoring may help in future studies as a potential prognostic or therapy guiding biomarker. This opens new perspectives and advance the field of clinical oncology.