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Coconut is both socially and economically important crop in tropical and subtropical countries, thus the conservation of existing diversity of its germplasm is vital to maintain biodiversity, sustain crop production and utilisation of germplasm for crop improvement strategies. The recalcitrant storage behavior and large size of the coconut seed make it impossible to use as a germplasm storage material. Cryopreservation is an ideal means of long-term storage of germplasm which offers long-term storage capability with minimal storage space and maintenance requirements. The coconut embryo has been now adapted by various researchers for the purpose of germplasm exchange and it is now being routinely applied in germplasm collection and exchange activities with sufficient germination rates. The aim of the present study was to determine the effect of different coconut embryo transport/ storage methods [as solid endosperm plugs under cold temperature, embryos cultured in Solidified Agar Medium (SAM) or KCI solution under room temperature] on cryopreservation of plumules using encapsulation/dehydration method. The results revealed that plumules excised from embryos transported/stored in SAM and pretreated with 1.0M sucrose could by cryopreserved with 71.8% survival and 56% recovery rates. The survival and recovery could be further increased up to 77.5% and 65% respectively by supplementation of 1.0M sucrose with 20 µM ABA.

Protocols are proposed for the low (-20°C) and ultra-low (-80°C) temperature storage of coconut (Cocos nucifera L.) embryos. A tissue dehydration step prior to storage, and a rapid warming step upon recovery optimized the protocol. The thermal properties of water located within the embryos were monitored using differential scanning calorimetry (DSC). In the most efficient version of the protocol, embryos were dehydrated under a sterile air flow in a dehydration solution containing glucose (3.33 M) and glycerol (15%) for16 hours. This protocol decreased the embryo water content from 77 to 29% FW and at the same time reduced the amount of freezable water down to 0.03%. The dehydrated embryos could be stored for up to 3 weeks at -20°C (12 % producing normal plants upon recovery) or 26 weeks at -80°C (28% producing normal plants upon recovery). These results indicate that it is possible to store coconut germplasm on a medium term basis using an ultra-deep freezer unit. However for more efficient, long term storage, cryopreservation remains the preferred option.

Corresponding author. Present address: The Muhammadiyah University of Purwokerto, Biology Education Department, Kampus Dukuhwaluh, Purwokerto 53182, Indonesia. Fax: +61 62281637239. E-mail address: Sisunandar@ump.ac.id (Sisunandar). Present address: Indonesian Oil Palm Research Institute, Jl Brigjen Katamso 51, Medan, North Sumatera, Indonesia; International audience; Cryopreservation of coconut can be used as a strategy to back up the establishment of living collections which are expensive to maintain and are under constant threat from biotic and abiotic factors. Unfortunately, cryopreservation protocols still need to be developed that are capable of producing a sizeable number of field-grown plants. Therefore, we report on the development of an improved cryopreservation protocol which can be used on a wide range of coconut cultivars. The cryopreservation of zygotic embryos and their recovery to soil-growing plants was achieved through the application of four optimised steps viz.: (i) rapid dehydration; (ii) rapid cooling; (iii) rapid warming and recovery in vitro and (iv) acclimatisation and soil-supported growth. The thermal properties of water within the embryos were monitored using differential scanning calorimetry (DSC) in order to ensure that the freezable component was kept to a minimum. The feasibility of the protocol was assessed using the Malayan Yellow Dwarf (MYD) cultivar in Australia and then tested on a range of cultivars which were freshly harvested and studied in Indonesia. The most efficient protocol was one based on an 8-h rapid dehydration step followed by rapid cooling step. Best recovery percentages were obtained when a rapid warming step and an optimised in vitro culture step were used. Following this protocol, 20% (when cryopreserved 12 days after harvesting) and 40% (when cryopreserved at the time of harvest) of all MYD embryos cryopreserved could be returned to normal seedlings growing in soil. DSC showed that this protocol induced a drop in embryo fresh weight to 19% and significantly reduced the amount of water remaining that could produce ice crystals (0.1%). Of the 20 cultivars tested, 16 were found to produce between 10% and 40% normal seedlings while four cultivars generated between 0% and 10% normal seedlings after cryopreservation. This new protocol is applicable to a wide range of coconut cultivars and is useful for the routine cryopreservation of coconut genetic resources.

In this paper, the efficiency of three techniques (two-step freezing, vitrification, encapsulation-dehydration) for freezing in vitro shoot tips was compared and the effect of conditioning of mother-plants was investigated. Cold-hardening mother plants for 3 weeks at 5°C improved regrowth rate and pattern of shoot tips whatever the cryopreservation technique employed. Increasing the time during which mother-plants were maintained on standard medium without subculture before sampling of apices decreased the water content of shoot tips from about 85-88% to 63-66% (fresh weight basis) and increased regrowth rate and pattern whatever the cryopreservation technique employed. The best results (up to 86% regrowth after cryopreservation without any callusing) were obtained with the encapsulation-dehydration technique. Using apices sampled on mother-plants which had not been subcultured for 26 weeks allowed to reduce the duration of the sucrose pregrowth treatment of encapsulated apcies, thus simplyfying the protocol. This simplified encapsulation-dehydration protocol was successfully applied to 11 out of the 12 cultivars tested. (Résumé d'auteur)

Shoot tips sampled on in vitro cultured apple plantlets of 6 accessions of #M. domestica$ and one accession of #M. robusta$ were successfully cryopreserved using the encapsulation-dehydration technique. Shoot tips were excised from plantlets which had been submitted to 3 weeks of cold-acclimation at 5°C, 70 d after their last subculture. After preculture at 5°C in media with progressively increased sucrose concentration (0.1 M, 0.3 M and 0.7 M), shoot tips were encapsulated and pregrown in medium with 1.0 M sucrose for 1 d, dehydrated for 4 h under the air current of the laminar flow cabinet, thus reaching a moisture content of around 30% (fresh eight basis) and directly immersed in liquid nitrogen. The regeneration rate of cryopreserved apices varied between 70 and 90%, depending on the accession. Using apcies sampled on plantlets which had been maintained on standard medium without subculture for 6 months, sucrose preculture became unnecessary to achieve regrowth after cryopreservation and the dehydration period was shortened. These experiments showed that the physiological state of the plant material directly affects the results and procedures for cryopreservation of apple shoot tips. (Résumé d'auteur)

Shoot tips sampled on in vitro plantlets of 5 apple cultivars were successfully cryopreserved using the droplet freezing method. After 3 weeks of cold-hardening at 5°C, the shoot tips were precultured in liquid medium with 1.0% DMSO for 24 h at 5°C, treated for 75 min. at room temperature with 0.3 M sucrose and 15% DMSO, placed in 5 micrometer droplets of cryoprotectant medium containing 0.3 M sucrose and 15% DMSO on aluminium foil and cooled to -40°C at 0.2°C/min before immersion in liquid nitrogen. Recovery rates of cryopreserved shoot tips ranged between 70 and 92%, depending on the cultivar. Regrowth of frozen shoot tips was direct, without callus formation. (Résumé d'auteur)

Cryopreservation is defined as the viable freezing of biological material and their subsequent storage at ultra-low temperatures, preferably at that of liquid nitrogen. The development of cryopreservation strategy for plant cells and organs has followed the advances made with mammalian systems, albeit several decades later. Even for mammalian systems, the discovery of chemicals with cryoprotective properties was a significant step towards the development and refinement of cryopreservation technology. A major breakthrough in this context was the finding that glycerol was capable of protecting avian spermatozoa from freezing injury (Polge et al., 1949). This generated widespread enthusiasm and renewed interest among people interested in low temperature preservation in such fields as biology and medicine. Since the early 1950’s a number of low molecular weight neutral solutes have been identified as potential cryoprotectants, the most commonly recognized ones being dimethylsulfoxide (DMSO or Me2SO) and glycerol. Dimethylsulfox-ide, originally used to prevent freezing damage to human and bovine red blood cells and bull spermatozoa (Lovelock and Bishop, 1959), has become a universal cryoprotectant. In recent years, considerable progress has been made in the low temperature preservation of red cells and platelets, leucocytes, bone marrow cells, protozoa, and helminth parasites of man and animals, insects and their cells and microorganisms (Ashwood-Smith and Farrant, 1980). Despite all these advances, unlike plants, most attempts to preserve animal organs at ultra-low temperature have met with limited success.

Les caféiers peuvent facilement être conservés sous forme de collections au champ, mais cette méthode est onéreuse et représente des risques élevés de perte de matériel par cause biotique ou abiotique. Nous avons donc recherché la possibilité de conserver des embryons zygotiques et clonaux (somatiques) dans de l'azote liquide ("LN"; à une température de -196°c). Tout d'abord, plusieurs prétraitements destinés à éviter les dégâts dûs au froid ont été essayés à la fois sur les embryons somatiques et zygotiques de #C. arabica$ var. catimor et #C. canephora$ var. Robusta. Ces génotypes ont été choisis pour leur bonne capacité embryogène. Les cultures sont initiées en plaçant des sections foliaires de 1.5 cm2 sur un milieu d'induction. Les embryons somatiques apparaissent après 10 semaines. Par exemple, une culture prolongée sur de fortes concentrations en saccharose a permis un meilleur développement des embryons. Trois protocoles de cryoconservation ont été essayés. Les traitements ont consisté en, d'une part, une congélation rapide par immersion directe dans LN, ou, d'autre part en une congélation lente à des rythmes de 0.5, 0.8 ou 1°c/mn jusqu'à -40°c avant immersion dans LN. Les échantillons ont été soit décongelés lentement pendant 30mn, soit rapidement par trempage dans un bain-marie à 40°c. Les résultats de certaines de ces expériences sont très prometteurs. Les embryons ont survécu à la congélation, mais n'ont pas germé directement. Au contraire, ils produisent des cals embryogènes, puis des embryons somatiques. Les embryons de Robusta ont montré le meilleur pourcentage de survie (71 %). (Résumé d'auteur)

Les méristèmes apicaux de 3 variétés de canne à sucre (B34104, C8751, C26670), prélevés sur des vitroplants, peuvent supporter la congélation dans l'azote liquide (-196°C) grâce à la technique d'encapsulation/déshydratation, basée sur la technologie des semences artificielles. Après dissection, les méristèmes, encapsulés dans des billes avec un milieu MS modifié et 3% d'alginate, sont déshydratés par une préculture de 24H en milieu liquide avec une forte concentration en saccharose (0.75M) puis une exposition pendant 4H dans le courant d'air d'une hotte à flux laminaire. La congélation est effectuée rapidement, par immersion directe dans l'azote liquide, ou lentement, avec un congélateur programmable. La survie des méristèmes congelés varie entre 26 et 100%, selon la variété et les conditions expérimentales. Une augmentation progressive de la concentration en saccharose pendant le prétraitement induit une diminution importante de la survie. (Résumé d'auteur)

Pour la conservation des graines, le caféier est classifié comme récalcitrant puisque les semences de cette espèce ne restent viables que pendant les durées très limitées. Les ressources génétiques de cette espèce sont donc conservées sous forme de collections en champ. Des vitrothèques sont en cours de mise en place afin de permettre leur conservation à moyen terme. Pour la conservation à long terme, la cryoconservation (azote liquide, -196°c) est la seule méthode disponible actuellement. Avec les apex, les essais ont été réalisés en utilisant la méthode d'encapsulation/déshydratation. Des apex prélevés sur des vitroplants de #Coffea racemosa$ ont été encapsulés dans des billes d'alginate, prétraités en milieu liquide à forte concentration en saccharose pendant des durées variables, partiellement déshydratés puis immergés rapidement dans l'azote liquide. La survie d'apex cryoconservés a été obtenue pour différentes durées de prétraitement et de dessiccation. Ces essais préliminaires indiquent que la cryoconservation d'apex de caféiers est possible. Les conditions optimales de chaque étape du procédé sont actuellement recherchées. Elles seront ensuite expérimentées avec d'autres espèces de caféiers. (Résumé d'auteur)

Les techniques de cryoconservation (stockage à la température de l'azote liquide, - 196°C) permettent d'assurer le maintien des caractéristiques génétiques des espèces pendant une durée théoriquement infinie. Le palmier à huile (#Elaeis guineensis$ Jacq.) est multiplié in vitro à grande échelle par embryogenèse adventive. Une technique simple de cryoconservation des embryons somatiques a été mise au point et appliquée à 25 clones différents. Des embryoïdes de deux clones ont été conservés respectivement 12 et 15 mois dans l'azote liquide, sans modification du taux de reprise après leur réchauffement. Des vitroplants issus de deux clones cryoconservés sont actuellement en plantation ; leur développement est conforme jusqu'à présent. Ces résultats permettent d'envisager, dans un proche avenir, l'utilisation de ce procédé pour la conservation des clones d'embryoïdes existant dans les laboratoires qui produisent des vitroplants de palmier à huile à l'échelle industrielle. (Résumé d'auteur)

La technique de cryoconservation des embryons somatiques de palmier a huile, mise au point par l'ORSTOM et l'IRHO, a maintenant ete appliquee a 27 clones. Le taux de reprise moyen est de 12,5 % des embryoides congeles. Des embryoides de 2 clones ont ete stockes respectivement 12 et 15 mois dans l'azote liquide, sans que l'on observe de modification du taux de reprise. Des cultures provenant de 10 clones cryoconserves ont ete envoyees a la Station de Recherches IRHO/CIRAD de La Me en Cote d'Ivoire, pour produire des vitro-plants afin de realiser des essais au champ. Des plants de 2 clones ont ete plantes en champ en decembre 1987. Leur developpement vegetatif s'est avere comparable a celui des temoins provenant de materiel non congele et les premieres inflorescences mâles observees en avril 1989, sont normales. Des plantules de 8 nouveaux clones cryoconserves sont actuellement en prepepiniere. Elles seront plantees en champ afin de confirmer ces observations preliminaires. Ces premiers resultats ont conduit l'IRHO a installer des unites de cryoconservation dans les laboratoires produisant des vitro-plants de palmier selon le procede ORSTOM/IRHO. Les premieres congelations ont commence en 1989, simultanement en France, Cote d'Ivoire, Malaisie et Indonesie. La premiere serie d'experimentations porte sur environ 150 clones. Les resultats nous renseigneront sur la possibilite d'utiliser en routine la cryoconservation pour le stockage a long terme des clones d'embryoides de palmier a huile

ResumeLa cryoconservation des embryons d'especes vegetales peut etre utilisee pour la conservation d'embryons d'especes a semences recalcitrantes, d'embryons somatiques, d'embryons issus de croisements incompatibles et de materiel haploide, embryons polliniques ou antheres.Les donnees bibliographiques presentees font ressortir la tres grande heterogeneite des processus de cryoconservation mis au point: nature et concentration des substances cryoprotectrices, mode et vitesse de congelation, reponse du materiel. Cette diversite est illustree par la presentation des resultats obtenus pour la cryoconservation de deux materiels differents: les embryons somatiques de palmier a huile et les embryons zygotiques de colza.Pour la congelation des embryons somatiques de palmier a huile, le saccharose est employe comme agent cryoprotecteur. La vitesse de refroidissement peut varier de 0,5 a 200°C min.−1 sans repercussion sur la survie des embryons. Des differences n'apparaissent que lors de la reprise de l'embryogenes...

Deux protocoles de cryoconservation, l'un utilisant un processus classique de congélation et l'autre une technique simplifiée, ont été développés pour des cals embryogènes d'un clone commercialisé d'hévéa. Dans les deux cas, une préculture sur un milieu contenant 1 M de saccharose et 10% de DMSO a été réalisée. Dans le protocole classique, les cals embryogènes ont été congelés à 0,2°C/min jusqu'à -40°C à l'aide d'un congélateur programmable, tandis que la méthode simplifiée consiste à redroidir les cals dans un bain d'isopropanol, contenu dans une boite en polystyrène et placé dans un congélateur ménager à -20°C. Cette méthode simplifiée a permis de reproduire une vitesse de congélation de 0,2°C/min jusqu'à -40°C. Un taux de survie et une reprise de croissance élevés, ainsi que la régénération d'embryons zygotiques, ont été obtenus avec les deux techniques. La technique simplifiée a été utilisée avec succès pour un second clone. (Résumé d'auteur)