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International audience; Seed heteromorphism can influence germination and ultimately seedling establishment, particularly in disturbed habitats. This study compared seed and seedling traits across three distinctly colored seed morphs (viz. light-brown, brown, and dark-brown) of the forage legume, Teramnus labialis (L.f.) Spreng. The best quality seeds (i.e., un-parasitized, filled and un-cracked) were brown: 389.3 quality seeds per 1000 units compared with

Acacia spirorbis is a leguminous tree from New Caledonia naturally found on a wide range of soils (calcareous, ultramafic and volcano-sedimentary) and able to establish symbioses with soil microorganisms, including nitrogen-fixing bacteria. The contribution of this symbiosis in the plant adaptation to contrasted edaphic environments, sometimes extremes, has been investigated according to i) the nitrogen-fixing potential of A. spirorbis in its natural ecosystems, ii) the characterization of its rhizobia and iii) the plant adaptive response to heavy metals inside its roots tissues, especially in nodules.Therefore, we revealed that the nitrogen-fixing symbiosis provided more than 80% of the plant total nitrogen in natural population naturally occurring on calcareous, ultramafic and volcano-sedimentary soils. This value is top notch among other Acacia species, where A. mangium, A. melanoxylon and A. mucronata presented mean values of 50%, 43% and 58%, respectively. Acacia spirorbis established nitrogen-fixing symbioses with alpha- and bêta-proteobacteria, genus Bradyrhizobium and Paraburkholderia, respectively, thus revealing a wide range of symbiotic partner and a low selectivity. Noteworthy, the taxonomy and phenotypes of these symbionts are structured and adapted to edaphic parameters. Finally, chemical signatures of internal nodules tissues presented similarities with soils chemical properties, thus indicating a potential management of heavy metals inside these tissues.Altogether, these data suggest that the nitrogen-fixing symbiosis might significantly contributes to Acacia spirorbis adaptation towards contrasted soils with strong edaphic conditions as an extreme polymetallic toxicity.; Acacia spirorbis est une légumineuse endémique de Nouvelle-Calédonie se développant sur des sols calcaires, métallifères et volcano-sédimentaires, établissant des symbioses avec des bactéries fixatrices d’azote. Pour comprendre la contribution de la symbiose dans l’adaptation de la plante à des milieux contrastés et parfois extrêmes, nous avons évalué la fixation d’azote en conditions naturelles, caractérisé les rhizobia associés à cette plante et analysé la réponse adaptative de la plante aux éléments traces métalliques dans ses tissus racinaires, notamment au niveau des nodules.Nous avons mis en évidence que la symbiose rhizobienne fournissait plus de 80% de l’azote total chez des populations naturelles d’A. spirorbis se développant sur des sites d’études présentant des sols calcaires, métallifères et volcano-sédimentaires. Cette valeur est remarquable puisque chez A. mangium, A. melanoxylon et A. mucronata, les valeurs moyennes sont respectivement de 50%, 43% et 58%. Les rhizobia symbiotiques associés à A. spirorbis appartiennent aux alpha- et bêta-protéobactéries, genres Bradyrhizobium et Paraburkholderia, révélant ainsi une très large gamme de symbiontes et une faible sélectivité de partenaire. De manière remarquable, la taxonomie et la phénotypie de ces souches sont structurées et adaptées aux conditions édaphiques. Enfin, les signatures chimiques des tissus internes des nodules reflètent les propriétés chimiques des sols dans lesquels ils se sont développés, indiquant une potentielle gestion des éléments traces métalliques dans ces tissus.Tous ces éléments suggèrent que la symbiose fixatrice d’azote contribue de manière significative dans l’adaptation d’Acacia spirorbis à des sols contrastés et pouvant présenter une toxicité polymétallique extrême.

The success of mixed-species tree plantations depends on the balance between positive and negative interactions. Mixtures of Acacia mangium and Eucalyptus urophylla × grandis out-yield their respective monocultures in term of wood production on the Congolese coastal plain, suggesting that facilitation and/or competitive reduction surpass interspecific competition. We investigated how these interactions affected biomass production and N accumulation during the early growth stage of a second rotation of a mixed-species stand of these two species. We used the 15N dilution method to estimate symbiotic nitrogen fixation and its contribution to N accumulation in acacia monoculture and mixture, and we assessed how much N derived from the atmosphere is transferred to the eucalypt trees in the mixed-species stand. Eucalypts grew taller and acacias grew larger in the mixture compared to the monocultures. N mineralomass was greater in the mixture relative to the average values in the two monocultures, with both species contributing to this enhanced N mineralomass. The amount of N derived from the atmosphere in the mixture was 60% higher than that expected given the amount found in acacia monoculture, and 16% of the nitrogen accumulated in eucalypt trees and aboveground eucalypt litterfall was derived from the atmosphere. Reduced competition for light and soil water also contributed to the increased growth of acacias in the mixture, showing that both species benefit from growing in a mixed stand. (Resume d'auteur)

Bradyrhizobium sp. strain DOA9 contains two copies of the nifDK genes, nifDKc, located on the chromosome, and nifDKp, located on a symbiotic megaplasmid. Unlike most rhizobia, this bacterium displays nitrogenase activity under both free-living and symbiotic conditions. Transcriptional analysis using gusA reporter strains showed that both nifDK operons were highly expressed under symbiosis, whereas nifDKc was the most abundantly expressed under free-living conditions. During free-living growth, the nifDKp mutation did not affect nitrogenase activity, whereas nitrogenase activity was drastically reduced with the nifDKc mutant. This led us to suppose that nifDKc is the main contributor of nitrogenase activity in the free-living state. In contrast, during symbiosis, no effect of the nifDKc mutation was observed and the nitrogen-fixation efficiency of plants inoculated with the nifDKp mutant was reduced. This suggests that nifDKp plays the main role in nitrogenase enzyme activity during symbiosis. Together, these data suggest that Bradyrhizobium sp. strain DOA9 contains two functional copies of nifDK genes that are regulated differently and that, depending on their lifestyle, contribute differently to nitrogenase activity.

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance., Nitrogen is the most abundant element in the Earth's atmosphere with a percentage of 78 %. This element is essential for the biosynthesis of cellular organic material and is unusable in its stable diatomic form (N2) by most organisms. Only bacteria called diazotrophs such as Rhodobacter capsulatus are able to fix molecular nitrogen N2 through the synthesis of the nitrogenase enzyme. The latter catalyzes the reduction of N2 to NH4 which can then be absorbed by other organisms. The synthesis and activity of nitrogenase consumes a lot of energy and therefore implies a strict regulation and its inhibition when a sufficient amount of ammonium is available. Among the proteins involved in this regulation, is the membrane transporter AmtB which is responsible for the sensing and transportation of ammonia. In R. capsulatus, it was shown that following the addition of ammonium, AmtB reversibly inhibits (switch off / switch on) nitrogenase activity by sequestering the PII protein GlnK accompanied by the addition of an ADP ribose group onto the Fe subunit of the enzyme by DraT. In addition, the formation of this complex alone would not be sufficient for this inactivation, suggesting the sequestration of a third protein, DraG is required to inhibit its action of removing the ADP ribose from the nitrogenase and therefore its reactivation. To better understand the role of the AmtB in the fixation of nitrogen, regulation and transport of ammonium at the molecular level, the first part of this study was to introduce a point mutation by directed mutagenesis in the conserved residue W237 of AmtB . Hydrogen production is another property of R. capsulatus that has been studied for a long time. This bacterium is capable of producing hydrogen from organic compounds following photofermentation and the exclusive enzymatic intervention of nitrogenase. Several studies have been undertaken to improve the production of hydrogen. Some of them were involved in determining the optimum conditions that give maximum gas production while others were interested in improving the growth of the bacterium itself. Thus, since the bio-production of H2 by fermentation is catalyzed by the nitrogenase, it is important to study the regulation of the activity of this enzyme by different mechanisms such as the switch off by ADP ribosylation. Therefore, a mutant of R. capsulatus (DG9) lacking AmtB was studied in the second part of this thesis for its nitrogenase activity, its modification by GlnK-DraG, and to see the effects of different amino acids used in the growth medium on the regulation and therefore the future use of this strain for the production of H2. The results showed a continuous and uninterrupted activity of the nitrogenase when AmtB was absent with a maximum activity when proline was used as a nitrogen source for bacterial growth. In addition, Western blots were used to demonstrate the effect of ADP ribosylation on regulation and that the expression of GlnK and DraG were unchanged between the wild –type and mutant R. capsulatus. In conclusion, nitrogenase is not modified or inhibited when mutated amtB what makes the R. capsulatus strain DG9 an ideal candidate for biohydrogen production especially when glucose and proline are respectively used as source carbon and nitrogen for growth.

Within the framework of the High Frequency Flux (HFF) experiment (MATER programme), time-series sediment traps have been deployed for two months on the continental slope off Marseilles to measure downward particle fluxes at a high frequency sampling rate (two and six days). Combined isotopic analyses of carbon and nitrogen have been performed on selected samples. Both isotopic tracers have been used for the first time on organic material of the Mediterranean Sea (Gulf of Lions) to determine the main biological sources and to address the biogeochemical processes that affected this material. Settling particles were characterised by very low values of delta N-15 (near 0 parts per thousand) and delta C-13 (near -24.5 parts per thousand) that indicate the existence of a mixed material with two sources that differ according to the considered element (C or N). The terrestrial source slightly dominates the carbon pool because of its higher C:N ratio, whereas the nitrogen pool may mostly originate from N-2-fixing cyanobacteria (delta N-15 = 0 parts per thousand, low C:N ratio). These preliminary data suggest that dissolved atmospheric N, may act as a significant new nitrogen source in the Mediterranean Sea., Dans le cadre de l’expérience ‘High Frequency Flux’ (HFF, programme MATER), des pièges à particules ont été déployés sur la pente continentale au large de Marseille pendant deux mois (16 mars–2 mai 1997) afin de mesurer avec une fréquence d’échantillonnage élevée les flux descendants de particules. Des analyses isotopiques combinées du carbone (13C/12C ou δ13C) et de l’azote (15N/14N ou δ15N) ont été effectuées sur les échantillons comportant suffisamment de matériel. Ces deux isotopes stables sont utilisés pour la première fois sur du matériel organique collecté par piège à particules en Méditerranée, afin de déterminer les principales sources biologiques qui le composent et de mieux cerner les processus biogéochimiques qui l'affectent. Le matériel collecté se caractérise par de faibles valeurs de δ15N (proches de 0‰) et δ13C (proches de –24‰) qui s’écartent des distributions typiques rencontrées en milieu tempéré et se rapprochent de celles observées en Antarctique. Les processus responsables d’une telle distribution isotopique sont cependant différents entre ces deux écosystèmes. Dans le Golfe du Lion, les résultats semblent indiquer deux sources prépondérantes, distinctes selon l’élément considéré (C ou N). Ainsi, la source biologique terrigène dominerait légèrement dans le pool de carbone du fait de sa forte proportion en carbone (rapport C:N élevé), tandis que le pool d’azote serait essentiellement constitué de cyanobactéries (δ15N ≃ 0‰, faible rapport C/N) fixatrices d’azote atmosphérique dissous. Ces données préliminaires suggèrent ainsi un rôle important de cette source azotée inorganique (N2) dans le fonctionnement d'un écosystème oligotrophe tel que la Méditerranée.

Medicago truncatula is a leguminous plant establishing a symbiotic interaction with the bacteria Sinorhizobium meliloti. This symbiosis leads to the de novo development of root nodules involved in biological nitrogen fixation. However, this symbiotic interaction is time limited and an early senescence appears in mature nodule entailing the formation of a senescence zone (zone IV). This degradation process occurs earlier in comparison to senescence of the whole plant. During nodule developmental senescence of plant host cells, a gradual degradation process induces a loss of vacuole and peribacteroid membrane (PBM). But this nodule degradation process still remains to be unravelled. To increase our understanding of the nodule senescence process, we developed new cytologic tools allowing an in vivo assessment of the viability and functioning of bacteroids within plant host cells. Therefore, these new tools provide a new insight of the nodule senescence process which may help for a finer characterization of the nodule senescence. In the M. truncatula model, a previous cDNA-AFLP analysis enlightens an upregulation of several cysteine proteinases during the transition from nitrogen fixing nodule to a senescent one; including an early expression of an SPG31-like peptidase known to be involved in leaf senescence (MtCP6) and a Vacuolar Processing Enzyme described as a plant caspase-like protein (MtVPE) involved in mechanisms similar to hypersensitive response in A. thaliana. In planta spatiotemporal analysis of the expression of these two cysteine proteinases using promoter:reporter gene GUS confirmed their expression during natural senescence at the junction between the nitrogen fixing zone (zone III) and the senescence zone (zone IV). Therefore, to acquire a better insight into the role of these cysteine proteases during the senescence program, we knocked down by RNAi the expression of each gene specifically at the interzone III-IV. Depletion of these transcripts induced a drastic increased of N2 fixation and nodule size. Conversely, overexpression of both genes in the zone III of nodule leads to an extension of the senescence zone. Confocal microscopy images of protein:GFP fusions showed that both proteinases are addressed to bacteroids within plant host cells. Our data revealed that MtCP6 and MtVPE are key players of the nodule senescence process and may be directly involved in symbiosome degradation.; Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l’organogénèse racinaire d’un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s’établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n’est pas pérenne, du fait de la mise en place d’un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l’heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l’implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l’activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L’analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L’analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l’induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu’induit par un traitement abiotique ou lors d’une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l’expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l’étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d’une dégradation des bactéroïdes.

Une expérience en pots a été conduite en serre pour estimer le potentiel fixateur d'azote d'Acacia tortilis subsp. raddiana par la méthode de dilution isotopique l5N en utilisant Parkia biglobosa comme arbre de référence. Le pourcentage d'azote dérivé de la fixation (% Ndfa) mesuré cinq mois après transplantation était élevé (58,1 %) comparativement à celui de A. senegal (27,2 %) ou A. albida (Syn. Faidherbia albida) (30,4 %). A. raddiana peut donc, avec A. seyal (% Ndfa = 59,7) être classé parmi les arbres à haut potentiel fixateur d'azote. AbstractA pot greenhouse-experiment has been conducted to assess nitrogen-fixing potential of Acacia tortilis subsp. raddiana through the isotopic dilution method l5N using Parkia biglobosa as tree of reference. The percentage of nitrogen derived from the fixation (% Ndfa) measured five months after transplantation was high (58.1 %) compared with that of A. senegal (27.2 %) or A. albida (Syn. Faidherbia albida) (30.4 %). Therefore A. raddiana may, with A. seyal (% Ndfa = 59.7), be classified among trees with high nitrogen-fixing potential.

L’efficacité fixatrice de souches de Rhizobium lupini a été mesurée en serre sur Lupinus albus, luteus et mutabilis. De fortes interactions se manifestent : 86 p. 100 des souches testées ont une bonne efficacité sur L. albus, 52 p. 100 sur L. mutabilis et 40 p. 100 sur L. luteus ; 22 p. 100 des souches ont une bonne efficacité fixatrice sur les trois espèces. Les interactions observées en serre se conservent au champ où les souches fixatrices augmentent le rendement en grain et la teneur en protéines des grains. Il apparaît aussi des interactions entre cultivars de L. albus et souches de R. lupini., Efficiency of Rhizobium lupini strains was evaluated in the greenhouse on Lupinus albus, L. luteus and L. mutabilis. Strong species x strain interactions were observed : 86 % of strains were fully effective on L. albus, 52 % on L. mutabilis and 40 % on L. luteus ; 22 % of strains were very effective on all three species. Species x strain interactions persisted in a field experiment where effective strains increased yield and protein level of grain. Interactions between L. albus cultivars and R. lupini strains were also observed.