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Orientador: Alessandra Alves de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas apresentam receptores de membrana que são capazes de reconhecer padrões moleculares associados ao patógeno/microrganismo (PAMPs/MAMPs), os quais são cruciais para a ativação do sistema imune. O receptor EFR, restrito a família das Brassicaceae, é um dos receptores de reconhecimento de padrões (PRR) mais bem estudado. Esse receptor quinase com repetições ricas em leucina em seu domínio extracelular (LRR-RK) é capaz de perceber a proteína ET-Tu das bactérias e seu epítopo elf18. A transferência desse receptor para outras espécies revelou a possibilidade de aumentar a resistência a bacterioses em culturas como tomate, arroz, trigo e batata. Diante disso, foram desenvolvidas variedades de laranja doce superexpressando o gene EFR para conferir resistência em amplo espectro a duas das principais doenças bacterianas de citros, cancro cítrico e clorose variegada dos citros (CVC). As linhagens transgênicas foram capazes de reconhecer os peptídeos elf18Xcc e elf26Xf derivados das bactérias Xanthomonas citri e Xylella fastidiosa, respectivamente, ativando o sistema imune da planta. Além da ativação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indução de MAPK e de genes de defesa, foi possível verificar gradual aumento da resistência ao cancro cítrico e CVC em alguns eventos em comparação com o wild-type (WT). Nesse trabalho, também foram realizadas análises in silico de um candidato a receptor LRR-RK altamente expresso em Citrus reticulata (resistente a CVC). Os resultados mostraram que o receptor putativo CrLRR-RK e seu ortólogo em Citrus sinensis (espécie suscetível) codificam proteínas com domínios conservados. Contudo, existem substituições de aminoácidos entre elas que sugerem mudanças conformacionais na estrutura tridimensional das proteínas, de acordo com a predição do modelo proteico gerado pelo I-Tasser. Isso poderia explicar as diferenças no reconhecimento de patógeno por laranja doce e tangerina, sendo um indicativo de que CrLRR-RK está associado ao reconhecimento de PAMPs derivados de X. fastidiosa. Para provar essa hipótese, foram produzidas plantas de Arabidopsis expressando CrLRR-RK e receptores quiméricos entre CrLRR-RK e o receptor FLS2. Essas plantas darão suporte a estudos futuros para comprovar empiricamente a funcionalidade desse receptor e buscar por PAMPs capazes de se ligarem ao domínio extracelular da proteína. Também foram produzidas variedades comerciais de laranja doce expressando o gene CrLRR-RK na tentativa de se obter maior nível de tolerância a patógenos bacterianos de citros. Juntos, esses resultados indicam que a utilização de receptores LRR-RK é uma estratégia que possui grande potencial para aumentar a resistência em amplo espectro em citros e futuramente poderão suportar os programas de melhoramento genético Abstract: Plants employ cell surface receptors that recognize pathogen (or microbe)-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs), which are crucial for immune system activation. The EFR receptor, restrict to the Brassicaceae family, is one of the well-studied pattern recognition receptors (PRR). This leucine-rich repeat receptor kinase (LRR-RK) is capable to recognize the widely conserved bacterial PAMP EF-Tu and its derived peptide elf18. The interfamily transference of the EFR receptor revealed the possibility to increase crop disease resistance in species such as tomato, rice, wheat and potato. Here, we developed sweet orange varieties expressing EFR to confer broad-spectrum resistance, focused on the to two major citrus bacterial diseases citrus canker and citrus variegated chlorosis (CVC). The transgenic lines were able to sense elf18Xcc and elf26Xf derived peptides from Xanthomonas citri and Xylella fastidiosa, respectively, activating the immune system of the plant. A quick oxidative burst was detected, followed by MAPK activation and induction of defense marker genes. In addition, it was possible to verify a gradual increase of resistance to citrus canker and CVC and a greater capacity to control bacterial growth in some transgenic lines compared to the wild type (WT). Here, we also performed in silico analyzes of an overexpressed LRR-RK receptor on Citrus reticulata (CVC resistant). The results showed that the putative receptor CrLRR-RK and its ortholog in Citrus sinensis (susceptible species) encode conserved domain proteins. However, there are amino acid substitutions between them that led to conformational changes in the 3D structure of proteins, according to the protein model generated by I-Tasser. This would explain the differences in pathogen recognition by sweet orange and mandarin, indicating that CrLRR-RK is associated with the recognition of X. fastidiosa-derived PAMPs. To prove this hypothesis, Arabidopsis plants expressing CrLRR-RK and chimeric receptors between CrLRR-RK and the FLS2 receptor were produced. These plants will support future studies to empirically prove the receptor functionality and seek for PAMPs capable of binding in the extracellular domain. We also produced commercial varieties of sweet orange expressing the CrLRR-RK gene in order to obtain a higher level of tolerance against citrus bacterial pathogens. Together, these results indicate that the use of LRR-RK receptors is a strategy that has great potential for increasing broad-spectrum resistance in citrus and hereafter support breeding programs Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES CNPQ 208406/2017; 142014/2015-0

Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio Takita Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) apresentam grande importância na defesa das plantas contra microrganismos pela capacidade de reconhecerem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) em início de infecção e desencadearem respostas de imunidade inata (PTI). A ativação de PTI permite conferir resistência contra uma ampla gama de microrganismos e, assim, a identificação e compreensão do papel das PRRs é de grande relevância em estudos que visam resistência contra patógenos. As espécies de Citrus apresentam elevado interesse comercial, porém seu cultivo tem sido severamente prejudicado devido às inúmeras doenças causadas por fitopatógenos, como por exemplo, a clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidiosa. Assim, considerando que a maioria das PRRs identificadas em plantas pertence à família de quinases com repetições ricas em leucina (LRR-RLKs), um dos objetivos desse trabalho foi analisar os aspectos evolutivos das LRR-RLKs no genoma de espécies de Citrus de grande importância econômica, Citrus clementina e Citrus sinensis. O alinhamento múltiplo de sequências conservadas de quinase e a reconstrução de árvores filogenéticas estimadas por máxima verossimilhança permitiu identificar 300 e 297 LRR-RLKs nos proteomas preditos de C. clementina e C. sinensis, respectivamente. As LRR-RLKs de ambas as espécies foram classificadas em 16 subgrupos (I a XVI) e a partir de uma análise mais detalhada do subgrupo XII, que inclui os principais PRRs identificados em plantas, foi verificada uma grande expansão e clusterização nos genomas de Citrus, o que demonstra a importância de eventos de duplicação em tandem na evolução das LRR-XII em Citrus. Além das análises in sillico, neste trabalho também foi avaliado o papel do receptor de EF-Tu (EFR) no reconhecimento de X. fastidiosa. Mutantes de Arabidopsis thaliana com EFR silenciado (efr-1) foram inoculados com X. fastidiosa e, a partir de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), foi verificado um aumento significativo da população bacteriana em efr-1 durante todo o experimento, quando comparado com as plantas selvagens (WT). Em 15 dias após inoculação (DAI), foi observada uma população bacteriana quase dez vezes maior nos tecidos das plantas efr-1. Análises por microscopia de fluorescência confirmaram a elevada colonização bacteriana nos tecidos das plantas efr-1. A importância do EFR no reconhecimento de X. fastidiosa foi avaliada também pela superexpressão de AtEFR em plantas hospedeiras de tabaco, as quais apresentam susceptibilidade a X. fastidiosa. Vinte plantas transgênicas foram identificadas por PCR convencional e a expressão do transgene EFR foi confirmada em seis eventos por qRT-PCR. Análises por western blot confirmaram a presença da proteína heteróloga e a maior produção de ROS verificada em presença dos epítopos elf18 de X. fastidiosa, E. coli e Xanthomonas citri subsp. citri indicam ativação de PTI nas plantas transgênicas de tabaco. A redução significativa na incidência de sintomas nas plantas transgênicas inoculadas com X. fastidiosa demonstra que EFR conferiu ao tabaco maior resistência à infecção bacteriana. Os resultados obtidos em Arabidopsis e tabaco indicam que EFR pode ser uma boa estratégia para transformar espécies susceptíveis de Citrus visando resistência contra X. fastidiosa e X. citri Abstract: Pattern recognition receptors (PRRs) are very important in plant defense against microorganisms because they are able to recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) in early infection process triggering innate immune responses (PTI). Activation of PTI confers resistance against a wide range of microorganisms and studies involving the identification and functional role of PRRs are of great importance. Citrus crops have great commercial importance worldwide; however, the productivity has decreased due to several diseases that affect this culture, such as citrus variegated chlorosis, caused by Xylella fastidiosa. Since most identified PRRs in plants belong to the leucine-rich repeat receptor-like kinases family (LRR-RLKs), one of the goals of this study was to analyze the evolutionary aspects of LRR-RLKs in economically important citrus species, Citrus clementina and Citrus sinensis. The multiple alignment of conserved kinase sequences and the reconstruction of phylogenetic trees estimated by maximum-likelihood identified 300 and 297 LRR-RLKs in the predicted proteomes of C. clementina and C. sinensis species, respectively. The LRR-RLKs from both species were classified into 16 sub-groups (I to XVI) and further analysis in the subgroup XII, which includes the main PRRs identified in plants, showed a large expansion and clustering in the Citrus genome, which demonstrates the importance of tandem duplication in the evolution of LRR-XII in Citrus. In addition to the in silico analysis, in this study we also evaluated the role of EF-Tu receptor (EFR) in the recognition of X. fastidiosa. Arabidopsis thaliana efr-1 mutants were inoculated with X. fastidiosa, and using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) we verified a significant increase of bacterial population in efr-1, during the time-course of infection, compared to the wild type (WT). At 15 days after inoculation (DAI) the bacterial population was almost ten times more in the efr-1 tissues in relation to WT. Fluorescence microscopy analysis confirmed the high bacterial colonization in the tissues of efr-1 plants. The importance of EFR in X. fastidiosa recognition was also evaluated by the overexpression of AtEFR in tobacco host plants, which are susceptible to X. fastidiosa. Twenty transgenic events were identified by conventional PCR and the expression of the EFR transgene was confirmed in six lines by qRT-PCR. Western blot analysis confirmed the presence of the heterologous protein and the increased ROS production observed in the presence of elf18 epitopes from X. fastidiosa, E. coli and Xanthomonas citri subsp. citri indicate PTI activation in the tobacco transgenic plants. The significant reduction in the incidence of symptoms in transgenic plants inoculated with X. fastidiosa showed that EFR increased the tolerance against the bacteria infection. The results obtained from A. thaliana and tobacco indicate that EFR could be a good strategy to transform Citrus plants aiming X. fastidiosa and X. citri resistance Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/01412-0