Search

ÖZET DIKLOFENAK SODYUM İÇEREN MIKROKURELERIN BİYOLOJİK PARÇALANABİLEN POLİMERLER İLE FORMÜLASYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ VE İN VİTRO/İN VİVO DEĞERLENDİRİLMELERİ Terapötik ilaç taşıyıcı sistemlerin formülasyonlarında biyolojik parçalanabilen polimerik taşıyıcıların kullanımı `biyolojik sistemle geçimli` olma ve `biyolojik olarak parçalanabilmek gibi sağladıkları bazı üstünlükler nedeniyle çok yaygınlaşmış durumdadır. Bu konuda; vücudun istenen bölgelerine hedeflendirilebilmeleri ve ilaçların sürekli saliminin sağlanabilmesi nedeniyle mikropartiküler sistemler içinde mikroküreler en popüler ilaç şekilleri olarak kabul edilmektedir. Diklofenak Sodyum (DS), NSAİİ (Non- Steroidal Antiinflamatuvar İlaç) grubundan yüksek aktiviteli bir ilaçtır ve romatoit artrit, osteoartrit ve ankilozan spondilit tedavisinde yaygın bir kullanımı bulunmaktadır. Çalışmada, DS'un mide-barsak kanalında iritasyon yapma riski ve yanlanma ömrünün de kısa olması nedeniyle, biyolojik parçalanabilen sentetik ve doğal polimerler kullanılarak kontrollü salım sağlayan mikroküre formülasyonları hazırlanmış ve ilacın eklemde kalış süresinin arttırılması amaçlanmıştır. DS'un doğal biyoparçalanabilir polimer olan BSA (Sığır Serum Albumini) ve sentetik biyoparçalanabilir polimer olan PLGA (Poli(laktid-ko-glikolid)) (50:50; MA:34 000 Dalton ve 88 000 Dalton) kullanılarak hazırlanan formülasyonları, partikül büyüklüğü, hazırlama verimi, yüzey morfolojik özellikleri, ilaç içeriği ve salım özellikleri açısından in vitro değerlendirilmiş ve doğal ve sentetik polimer formülasyonlarından uygun bulunan birer adet formülasyon in vivo değerlendirmeye alınmıştır. İn vivo çalışmalarda ovalbumin ve Freund's Complete Adjuvan kullanılarak tavşanların eklemlerinde deneysel artrit oluşturulmuş, `Tc-HIG kullanılarak sintigrafık yöntemlerle görüntülenmiştir. Belirli zaman aralıklarındaki sintigrafik ölçümler ile mikrokürelerin artritli eklemlerde kalış süresi değerlendirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Mikroküre, Diklofenak Sodyum, İn Vitro Karakterizasyon, Deneysel Artrit, Sintigrafık Görüntüleme iv ABSTRACT THE DEVELOPMENT OF THE FORMULATION OF DICLOFENAC SODIUM LOADED BIODEGRADABLE MICROSPHERES AND THEIR IN VITRO/IN VIVO EVALUATION The use of polymeric carriers in formulations of therapeutic drug delivery systems has gained widespread application due to the advantages as being biodegradable and biocompatable. Among the microparticulate systems, microspheres have a special importance as it possible to target the drugs and provide controlled release. Diclofenac Sodium (DS), is a potent drug in NSAID group having non steroidal, antiinflamatory properties and is used widely in treatment of rheumatoid arthritis, osteoarthritis and ankylosing spondylitis. As NSAID' s are known to produce irritation and gastric mucosal damage furthermore as they have a short half life, in this study it was aimed to prepare the microsphere formulations using natural (BSA) and synthetic (PLGA) biodegradable polymers for intraartikular administration sustained drug release and extend the duration period of dosage form in the knee joint. Microsphere formulations which are prepared using above mentioned polymers are evaluated in vitro for particle size, yield value, encapsulation efficiency, surface morphology and in vitro drug release. Afterwards, two formulations were selected for in vivo trials. In vivo studies; after the formation of arthritis in knee joints of rabbits, the radio labeled microspheres loaded with DS were injected directly into articular cavity and at specific time points gamma scintigraph measurements are done to determine the dwelling time of microspheres in knee joints in order to determine the most suitable formulation. The Key Words : Microspheres, Diclofenac Sodium, In Vitro Characterization, Experimental Arthritis, Scintigraphic Imaging. 97

ÖZET Intravenöz (i.v.) lipid emülsiyonlar içerdiği yüksek miktarda enerjiden dolayı, parenteral beslenmede enerji ka/Tiağı olarak uygulanmaktadır. Bu tip emülsiyonlar son zamanlarda yağda çözünen ilaçların parenteral kullanımında, taşıyıcı sistemler olarak incelenmektedir. i.v. emülsiyonlar, suda çözünmeyen ilaçların çözünürlüğünün sağlanması, olası geciktiril miş salım, farmakolojik etkinin arttırılması gibi nedenlerle ilaç taşıyıcısı olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle yağda çözünen bir ilaç olan naproxen içeren emülsiyonların eklem sıvısındaki akümülasyonu ve olası geciktirilmiş etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada, üç çeşit yüzey aktif madde (Soya lesitini (LEC). Pluronic F-127. ve bunların 50:50 karışımı) kullanılarak soya yağı emülsiyonları hazırlanmıştır. Naproxen'in örnek ilaç olarak seçilme nedeni, bu ilacın oral yoldan verildiği zaman /iiksek klirense uğramasıdır. Emülsiyonların stabilite çalışmaları farklı sıcaklıklarda (4. 25 ve 40 °C) bekletilip 6 ay bo/TJiıca yapılmıştır. Emülsiyonların, kırmızı kan hücreleri üzerindeki hemolysis derecesi incelenmiştir. İn vitro çalışmalarından sonra. 50:50 Pluronic F-127+LEC karışımı ile stabilize edilmiş formülasyon, en dayanıklı olarak bulunmuş ve in vivo çalışmalarda bu formülasyon kullanılmıştır. İn vivo çalışmalarda hawan modeli olarak tavşanlar kullanılmıştır. Burada seçilen formülasyonun tavşan eklemlerinde oluşturulan artrit'in tedavi derecesi, kontrol foımülasyonları (boş emülsiyon, dimetilsulfoksit (DMSO) içindeki naproxen çözeltisi, sadece DMSO) ile sintigrafı yöntemiyle karşılaştırılmıştır. Yöntem tedavi öncesi ve sonrasındaki artrit ve sağlam eklemlerdeki radyoaktivite sayım oranlarının karşılaştırılmasına dayanmaktadır. Çalışmanın sonucunda, tüm gruplarda tedavi öncesi ile sonrası arasındaki radyoaktivite sayım oranları arasında fark bulunmamıştır. Elde edilen sonuç, radyoaktif maddenin spesifik olmayışı, hawan derisinin kontaminasyonunu önleyecek metabolizma kafeslerinin bulunmaması ve uygulanan naproxen dozunun düşük olabileceği gibi çeşitli nedenlere bağlanmıştır. Anahtar Kelimeler : Intravenöz Emülsiyonlar, Formülasyon. Stabilite. Sintigrafık Görüntülemesi. Denevsel Artrit. ABSTRACT Lipid (i.v. = intravenous) emulsions have been used as calorie source due to their ability to yield high amount of energy. Such emulsions have recently been investigated as drug carrier systems, especially for lipid soluble drugs. Lipid emulsions may be employed as drug carrier systems due to reasons such as solubilization of low-water soluble drugs, stabilization of hydroljtically susceptible drugs, potential sustained release, possible drug targeting and enhanced pharmacological efficacy. As a result we investigated the accumulation and potential sustained release ability of emulsions as carrier systems for a lipid soluble drag in the synovial fluid. In this research, emulsions of soybean oil stabilized with three different types of emulsi- fiers (Soybean lecithin (LEC), PLU F-127 and a 50:50 mixture of PLU F-127+LEC) were formulated. Naproxen was chosen as a model drug because of its high clearance from the blood stream when administered orally. Stability studies of emulsions systems was carried out at different temperatures (4, 25 and 40 °C) for a period of six months. The degree of hemolysis of emulsion systems was also investigated. After the in vitro stability studies, it was observed that emulsions stabilized with a 50:50 mixture of PLU F-127+LEC were more stable and appeared favorable from toxicological point of view. As a result this formulation was used as a test sample in the in vivo studies. Rabbits were used as animal model in the in vivo studies. In the study, the degree of treatment of arthritis induced in the knee joints of rabbits by the test sample was compared to that of controls (empty emulsion, naproxen solution in dimethylsulfoxide (DMSO) and only DMSO) scintigraphically. The scintigraphic method was based on the average radioactivity count ratios on the arthritic and contralateral knee joints before and after therapy. At the end of the study, it was observed that there was no significant difference in the radioactivity count ratios between groups before and after therapy. This was attributed to various reasons such as the non-specificity of the radiopharmaceutical, lack of metabolism cages to prevent skin contamination of animals and possibly to the low naproxen dose administered. Key Words : Intravenous Emulsions. Formulation. Stability, Scintigraphic Imaging, Experimental Arthritis. 148

ÖZET Araştırmamızın amacı, fenitoin sodyumun mikrokapsüllerini hazırlayarak, uzun etki sağlamak ve hasta uyuncunu artırmaktır. Bu amaç doğrultusunda, organik çözücüden faz ayrışması ve kaplanmış granule yöntemleriyle mikropartiküller hazırlanmıştır. Çeper maddesi olarak etil selüloz, Eudragit S100 ve Eudragit S100 + Eudragit L100 karışımı kullanılmış ve (1:1), (1:2), (1:2.3), (1:3), (2:1), (1:0.325), (1:0.65), (1:1.3), (1:0.4), (1:0.8), (1:1.6) çekirdek: çeper oranları denenmiştir. Formüle edilen mikropartiküllerden ve ticari preparatlardan etken madde salımı USP XXII dönen sepet yöntemi ile CO21 i uzaklaştırılmış distile suda çalışılmış ve elde edilen bulguların, Higuchi salım kinetiğine uyumuna bakılmıştır. Faktoriyel denemelerde, seçilen bağımsız değişkenlerin (nonsolvan miktarı, sıcaklık, zaman, çekirdefcçeper oranı), bağımlı değişkenlere (etil selüloz miktarı, % çözünen) karşı çoklu regresyonu yapılmış ve sonuçların ikinci dereceden polinomial denkleme uygunlukları araştırılmıştır. Hesaplanan eşitlikler kullanılarak, bağımsız değişkenlerin değişik düzeylerindeki yanıt değişkenlerinin tahmin edilebileceği cevap-yüzey grafikleri çizilmiştir. En uygun bulunan formülasyonlar, E -5 ( verim : %70, etken madde miktarı : %90, çekirdek : çeper oranı 1 :2.3), ES -2 ( verim :%71, Etken madde içeriği: % 85, çekirdek : çeper oranı 1 :0.65), ESL-2 (verim :%75, etken madde içeriği:%92, çekirdek :çeper oranı 1:0.8) dir. Sonuçta, geliştirilen formülasyonlar ile uzatılmış salım etkisi sağlanabilmiştir. 68 SUMMARY The purpose of our investigation is to formulate and prepare sustained action phenytoin sodium microcapsules and to increase the patient compliance. For this purpose, microcapsules of phenytoin sodium are formulated, by organic phase separation and granule coating method. Ethylcelluiose, Eudragit S100 ve Eudragit S100 + Eudragit L100 has been used as coating materials and [(1:1), (1:2), (1:2.3), (1:3), (2:1), (1:0.325), (1:0.65), (1:1.3), (1:0.4), (1:0.8), (1:1.6)] different core:wall ratios are evaluated. The in vitro release profiles of the formulated microparticles and the commercially available preparations are performed in CO2 free distilled water by using (USP XXII) rotating basket method. The in vitro release is evaluated by Higuchi kinetics. The multiple regression is applied to dependent variables (amount of ethylcelluiose, percent dissolved) against independent variables (amount of nonsolvent, temperature, time, core:wall ratio). Then, the fitness of the results to second order polynomial equation is investigated. By using the calculated equations, the responce-surface graphs were drawn from which varied levels of the independent variables could be predicted. The most suitable formulations are E-5 ( yield : % 70, amount of phenytoin sodium : % 90, core : wall ratio 1 :2.3 ), ES-2 ( yield : % 71, amount of phenytoin sodium : % 85, core : wall ratio 1:0.65 ), ESL-2 ( yield : % 75, amounth of phenytoin sodium % 92, core : wall ratio 1:0.8 ). Finally, the sustained release effect was obtained by the evaluated formulations. 79

ORGANİK FOSFORLU ÎNSEKTÎStTLERE MARUZ KALAN İŞÇİLERDE GECİKMİŞ NÖROTOKSİK ETKİNİN ARAŞTIRILMASI Ecz. FERDA DO?RUÖZ Tez Yöneticisi Prof. Dr. ALİ ESAT KARAKAYA 1993 ÖZET /' Organik fosforlu insektisitlere maruziyet sonrası insanda gecikmiş polinöropati riskinin değerlendirilebilmesi için fenSon'a maruz kalan işçilerde lenfosit nöropati hedef esteraz (NTE) enzi mi ve buna paralel asetilkölınesteraz (AchE) enzimi düzeyleri ölçülmüştür. Çalışmamızda asetilkonesteraz enzimi ölçümleri Ellman yöntemi, lenfositlerde nöropati hedef esteraz enzimi ölçümleri Johnson'ın yöntemine göre yapılmıştır. Kontrol grubunda ve denek grubunda maruziyet öncesi AchE ve NTE enzimi düzeylerinin normal sınırlar içerisinde olduğu gözlenmiştir. Kontrol grubunun ortalama AchE değeri 2.93 ± 0.60 IU/ml, ortalama NTE değeri 11.8 ± 1.7 nmol/dak.mgprotein olarak bulunmuştur. Denek grubunda maruziyet sonrasında AchE enzimi aktivi- telerinde ençok % 35'lik (maruziyet öncesi 4.6 IU/ml, maruziyet sonrası 3.03 IU/ml) bir inhibisyon gözlenirken, NTE enzimi akti- vitelerinde ise en çok % 16 lık (maruziyet öncesi 14.99 nmol/ dak.mgprotein, maruziyet sonrası 12.59 nmol/dak.mgprotein) bir inhibisyon olduğu saptanmıştır.Çalışmamızda elde edilen veriler fention'a maruz kalan kişilerde nöropati hedef esteraz enzimi düzeyleri ile ilgili bir çalışma bulunamadığından, deney hayvanlarında fention'la yapılan çalışmalardan elde edilen verilerle tartışılmıştır. RESSEARCHING OF DELAYED NEUROTOXIC EFFECT IN WORKERS AFTER EXPOSURE TO ORGANOPHOSPHORUSINSECTICIDES Ecz. FERDA DO?RUÖZ Prof. Dr. ALÎ ESAT KARAKAYA 1993 SUMMARY Lymphocytic neuropathy target esterase (NTE) and associated acetylcholinesterase (AchE) levels were measured in workers exposed to fenrtiion in order to assess the risk for delayed polyneuropathy in humans after exposure to organophosphorous i insecticides. Acetylcholinesterase levels were measured with the Ellman method, lymphocytic neuropathy target esterase levels were measured with the Johnson's method. It was observed that AchE and NTE levels were in the normal range pre-exposure in both the control and the case groups. Mean. AchE level was 2.93 ± 0.60 IU/ml and mean NTE level was 11.8 ± 1.7 n.Mole/min.mgprotein in the control group. While a maximum of 35 % inhibition (4.6 IU/ml pre-exposure, 3.03 IU/ml after exposure) was observed in AchE enzyme activities in the case group after exposure, a maximum of 16 % inhibition (14.99 nMole/min.mgprotein pre-exposure, 12.59 nMole/min.mgprotein after exposure) was assessed in NTE enzyme activities.Data accumulated from this study was discussed in the light of available data from similar animal studies using fenthion, since no similar were studies available about neuropathy target esterase levels in human exposed to fenthion. 135

121

158

93 ÖZET Bu araştırmanın amacı, siklofosf amid mikroküreleri ha zırlanarak, in vitro salıverilmeyi incelemek, organ dağılım larını araştırmak ve artritli eklemlerden in vivo salıveril meyi incelemektir. Alkil leyici ajanlar grubunda olan siklof osf amid ' in kim yasal ve f izikokimyasal özellikleri kontrol edilmiştir. Yapı da parçalanma olup olmadığı I.R. spektroskopisi ile tayin edilmiştir. Sik lafosfamid en -fazla kullanılan antineoplastik ajan lardan biridir. Ayrıca güçlü immünosupresif etkinlik göster mesi nedeniyle romatizmal hastalıkların tedavisinde de kulla nımı mevcuttur. Siklo-fosf amid ' in, emülsiyon polimerizasyonu yöntemine göre matriks maddesi alarak albumin kullanılmak suretiyle mikroküreleri hazırlanmış ve farklı f ormülasyonlar gelişti rilmiştir. in vitro salıverilme deneylerinde, -Farklı -formülasyon - lardan, farklı salıverilme profilleri elde edilmiştir. Gluta- raldehit farklı süreler (15 dak. ve 60 dak.) ile farklı kon santrasyonlarda (0.1 ml ve 0.7 ml) sertleştirici ajan alarak kullanılmıştır. 22 coketkenli denemesi ile de sertleştirme süresi ile sertleştirici madde miktarı ve bu iki etkenin et kileşimlerinin salıverilme hızında önemli rol oynadığı bulun muştur.94 in vitro salıverilme bulguları kinetik alarak değerlen dirilmiş ve en iyi uyumu I. derece kinetiğinin sağladığı bu lunmuştur. Organ dağılımı deneylerinde de, pasif hedeflendirme ile ortalama 2.21 um partikül büyüklüğüne sahip mikrokürelerin hedef organ olan karaciğerde enjeksiyondan 1 saat sonra %64.7 gibi büyük bir oranda toplanması sağlanmıştır. Histopatolojik değerlendirmelerde karaciğer dokusunda mikroküreler tespit e dilmiştir, ancak doku harabiyetine rastlanmamıştır. Artritli eklemlerden in vivo salıverilme deneylerinde de artrit oluşturulan eklemlerde siklofosfamid mikrokürelerinin kalış süresinin serbest siklof osf amide oranla çok daha fasla olduğu bulunmuştur. 95 SUMMARY The aim of this study is to formulate cyclophosphamide microspheres, to investigate their in vitro release, to accu mulate them in the target organ, liver, and to study their in vivo release from the arthritic joints. The chemical and physicochemical properties of cyclophos pharnide, an alkylating agent which belongs to the nitrogen mustard group, is investigated. The degredation products a.re determined by I.R. spectroscopy. Cyclophosphamide is a widely used anticancerogen drug. It is also used in the treatment of rheumatismal diseases because of it is strong immunosuppressive effect. Different formulations of cyclophosphamide microspheres are prepared by emulsion polymerisation method using human serum albumin as the matrix material. In the in vitro release experiments, different release profiles are obtained from different microsphere formulations Two different volumes (0.1 and 0.7 ml) of glutaraldehyde solution (2.57.) and two different cross- linking durations (15 min. and ih.) are used. And it is observed through 22 factorial design that the cross-linking duration and the stabilizing agent concentration has an influence on the re lease rate of these cyclophosphamide microspheres. The in vitro release rate results are evaluated kinetic- ally and the best fitting equation is found to be the first order kinetics.96 The in vivo tissue distribution is obtained by passive targeting using microspheres o-f particle size around 2.21 um One hour after injection 64.7 V. of the cyclophosphamide mic rospheres are accumulated in the target organ, liver. During the histopathological investigations, cyclophosphamide micro spheres are observed in the liver but there was no tissue damage in the liver. The in vivo release experiments from the arthritic joints show that the duration of cyclophosphamide microsphe res in the artritic joints is much longer and the release much slower when compared to the free cyclophosphamide. 121