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Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Patologias do tecido ósseo, originárias de várias causas, nomeadamente traumas, infeções ou doenças ósseas, são muito comuns na nossa sociedade. Na situação de diabetes mellitus, estes defeitos ósseo estão agravados e o seu tratamento apresenta uma maior dificuldade para os clínicos. Nos últimos anos a nanotecnologia tem fornecido variadíssimos benefícios no campo da engenharia do tecido ósseo, no entanto nenhuma das soluções tem resolvido totalmente os diversos desafios que pressupõem a reparação óssea. Desta forma, têm sido estudadas novas soluções terapêuticas para resolver este problema, e o desenvolvimento de novos biomateriais fabricados com nanopartículas que simulem a estrutura e composição do osso, favorecendo a sua regeneração, têm sido equacionados. Assim este trabalho tem como principal objetivo o estudo da biocompatibilidade de uma preparação de nanopartículas de hidroxiapatite (NanoXIM•HAp102®) na condição de diabetes, usando para tal um modelo de implante subcutâneo em ratos Wistar. Neste estudo foram usados 16 ratos machos da estirpe Wistar, dos quais 10 foram submetidos à indução da diabetes, por via intraperitonial, com uma única administração de 55 mg/Kg de estreptozotocina (STZ), sendo os restantes injetados com soro tampão citrato (grupo controlo). Duas semanas após a indução da diabetes, implantou-se subcutaneamente em todos os animais 0,5 ml de suspensão de nanopartículas de hidroxiapatite (nano-HAp). Os animais foram sacrificados às 48h e 3 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e tecido subcutâneo com a nano-HAp, para avaliar a atividade e expressão de variados marcadores séricos, assim como proceder à análise histopatológica. Os animais diabéticos apresentaram uma diminuição do peso corporal e um aumento do peso relativo dos rins e do fígado quando comparado com os respetivos grupos controlo. Os valores dos marcadores de função renal, ureia e creatinina, e das enzimas hepáticas ALT e FA, encontraram-se elevados nos animais diabéticos comparativamente com os controlos. Às 48h, verificou-se a existência de uma resposta inflamatória aguda, com presença de neutrófilos e linfócitos, e uma resposta inflamatória crónica caracterizada pela presença de macrófagos e células gigantes, às 3 semanas. Tanto a resposta inflamatória, como a reabsorção das nanopartículas encontraram-se diminuídas nos grupos diabéticos comparativamente com o respetivo grupo controlo. Constatou-se a presença de uma cápsula fibrosa nos grupos experimentais das 3 semanas, sendo que esta foi menor no grupo diabético comparativamente com o respetivo grupo controlo. Observou-se ainda alguma agregação de nano-HAp, tendo esta sido mais intensa em ambos os grupos diabéticos, e dentro destes maior às 3 semanas. Uma vez que não se verificou uma reação exacerbada e que ocorreu reabsorção do biomaterial, sem sinal de toxicidade hepática ou renal, na quantidade testada, podemos concluir que as nano-HAp não apresentam toxicidade. Embora se tenha observado reabsorção das nano-HAp ao longo do período experimental, constatou-se que este processo era bastante mais lento nas condições diabéticas. Pathologies of bone tissue, that are provided from different causes, including trauma, infections or bone diseases, are very common in our society. In the specific case of diabetes mellitus, the bone defects are intensified and its treatment presents a major difficulty for clinicians. Actually, nanotechnology provides many different benefits in the field of bone tissue engineering, however, any solutions have completely solved the challenges that require bone repair. In this way, it has been studied new therapeutic solutions to solve this problem, the development of new biomaterials made from nanoparticles that acquire a similar structure and composition of the original bone, promoting regeneration, have been solved. The main objective of this work is the study of the biocompatibility, of hydroxyapatite nanoparticles (NanoXIM • HAp102 ®) in diabetic conditions, using for such a model of subcutaneous implantation in Wistar rats. This study used 16 male rats of the Wistar strain, 10 of which were subjected to induction of diabetes with single intraperitoneally administration of 55 mg / kg streptozotocin (STZ), and the remaining were injected with physiological serum (the control group). After the induction of diabetes, was subcutaneously implanted 0,5 ml hydroxyapatite nanoparticles (nano-HAp). The animals were sacrificed at 48 hours and 3 weeks, being collected the blood, organs, and subcutaneous tissue, with nano-Hap, to evaluate the expression and the activity of various serum markers, as well as the histopathology. Diabetic animals showed a decrease in body weight and an increase in the relative weight of the liver and kidneys when compared with the respective control groups. The values of markers of renal function, urea and creatinine, and liver enzymes ALT and FA, were also higher in diabetic animals compared with control. At 48 h, it was found a several inflammatory response with neutrophils and lymphocytes, and a chronic inflammatory response characterized by the presence of macrophages and giant cells, at 3 weeks. The inflammatory response and the reabsorption of the nanoparticles were found decreased in diabetic group compared with the respective control group. It was observed the presence of a fibrous capsule in the experimental groups of the 3 weeks, but it was lower in the diabetic group as compared to the respective control group. There was also some aggregation of nano-Hap, that was more intense in both diabetic groups, and within these higher at 3 weeks. With the quantity tested, there has not been observed an overreaction and the biomaterial reabsorption occurred without signs of hepatic or renal toxicity. Although we observed a progressive reabsorption of nano-HAp throughout the experimental period, this process was significantly slower in diabetic conditions.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A diabetes mellitus é uma patologia heterogénea, caracterizada por alterações endócrino-metabólicas da homeostasia da glicose plasmática. A associação entre esta doença metabólica e a afeção do metabolismo do tecido ósseo tem sido alvo de estudo aprofundado na literatura científica. Apesar das evidências obtidas em diversos estudos experimentais e clínicos, o conhecimento da influência desta condição no processo de regeneração óssea é ainda escasso. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da diabetes mellitus experimental, induzida pela estreptozotocina, no processo de regeneração de defeitos ósseos subcríticos, na tíbia de rato. Simultaneamente avaliou-se o efeito da implantação de uma membrana de colagénio tipo I, reabsorvível, no processo de regeneração óssea guiada. Foram utilizados 34 Rattus norvegicus, os quais foram divididos em quatro grupos: Diabetes 2 semanas (D2S), Controlo 2 semanas (C2S), Diabetes 6 semanas (D6S) e Controlo 6 semanas (C6S), de acordo com o tempo de regeneração do defeito criado cirurgicamente. A condição diabética foi induzida pela administração intraperitonial de estreptozotocina (STZ), na dose de 60mg/Kg. Duas semanas após a indução da diabetes experimental, e confirmação do estado diabético, foi efetuado um defeito ósseo monocortical subcrítico de 1,4mm de diâmetro nas tíbias de todos os animais. Nas tíbias esquerdas foi aplicada uma membrana reabsorvível de colagénio tipo I, de forma a avaliar o processo de regeneração óssea guiada. Durante toda a atividade experimental foram avaliados o consumo de água e alimento, bem como os pesos corporais dos animais de todos os grupos. No final de cada período experimental, 2 e 6 semanas após a realização dos defeitos ósseos, os animais foram sacrificados, os órgãos internos foram pesados e as tíbias foram recolhidas para análise radiográfica, microtomográfica e histológica. Neste trabalho verificou-se que a administração de STZ induziu a condição diabética em todos os animais dos grupos D6S e D2S. Estes grupos consumiram muito mais água e alimento, relativamente aos seus controlos. Observou-se também que estes grupos apresentaram uma perda de peso estatisticamente significativa. Relativamente aos pesos dos órgãos, verificou-se que, nos grupos diabéticos, o fígado, coração e baço apresentaram peso inferior e os rins um peso superior aos controlos respetivos. Os animais diabéticos manifestaram também alterações da microestrutura óssea: redução de densidade e volume ósseo e maior separação entre trabéculas, ao nível do osso trabeculado da tíbia. Relativamente à avaliação do processo de regeneração óssea verificou-se que, ao longo do tempo, o defeito foi progressivamente regenerado em ambos os grupos experimentais – atingindo a regeneração completa às 6 semanas. No entanto, os animais diabéticos apresentaram um processo regenerativo mais lento que o verificado nos animais controlo, mesmo com a aplicação de técnicas de regeneração óssea guiada – implantação cirúrgica da membrana. Nos locais em que a membranas foi implantada verificou-se um crescimento exofítico de tecido ósseo, não só na região do defeito mas também na superfície do osso adjacente, nos animais do grupo controlo e do grupo diabético. Este tecido apresentava características morfológicas de osso imaturo, com elevada densidade de trabéculas e porosidade. A condição diabética parece afetar significativamente o processo de regeneração óssea, mesmo na presença de técnicas de regeneração óssea guiada, atrasando a regeneração do defeito criado. Diabetes mellitus is a heterogeneous disorder characterized by endocrine-metabolic changes of the homeostasis of plasma glucose. The association between this metabolic disease and the metabolic condition of the osseous tissue has been the subject of extensive scientific studies. Despite evidence obtained in several experimental and clinical studies, knowledge of the influence of this condition in the process of bone regeneration is still scarce. This study had the objective of evaluate the influence of experimental diabetes induced by streptozotocin (STZ) in the process of regeneration of subcritical bone defects of the tibiae in rats. Simultaneously, the effect of the implantation of type I collagen reabsorbable membrane, in the process of guided bone regeneration, has been evaluated. In this study, 34 Rattus norvegicus were used, which were divided into four groups: Diabetes 2 Weeks (D2W), Control 2 Weeks (C2W), Diabetes 6 Weeks (D6W) and Control 6 Weeks (C6W) according with the regeneration time of the surgically created defect. The diabetic state was induced by the intraperitoneal administration of STZ at a 60mg/kg dose. Two weeks after the induction of experimental diabetes and diabetic status confirmation, a subcritical monocortical bone defect of 1.4 mm of diameter was made on the tibiae of all animals. In the left tibiae a reabsorbable type I collagen membrane was applied, in order to evaluate the process of guided bone regeneration. Throughout the experiment the consumption of food and water and the body weights of the animals of all groups were assessed. At the end of each experimental period, 2 and 6 weeks after the execution of bone defects, the animals were sacrificed, the internal organs were weighed and the tibiae were harvested for radiographic, histological and micro tomographic studies. In this study it was verified that the administration of STZ induced the diabetic condition in all animals from groups D2W and D6W. The animals from these groups consumed more food and water than the animals from their control groups. It was also observed that the animals from these groups showed a statistically significant weight loss. With regard to the weights of the organs it was found that, in animals from diabetic groups, liver, heart and spleen showed a lower weight than the ones from control animals and kidneys showed a higher weight than the ones from respective control animals. Diabetic animals also showed bone microstructure changes: decrease of the density and bone volume and a higher separation between trabeculae at the level of the trabecular bone of the tibia. Regarding the evaluation of the process of bone regeneration was found that, over time, the defect was gradually regenerated in both experimental groups - achieving complete regeneration at 6 weeks. However, diabetic animals showed a regenerative process slower than the observed in control animals, even with the application of guided bone regeneration techniques - surgical implantation of the membrane. In places where the membrane has been deployed, an exophytic growth of bone tissue was observed, not only at the region of the defect but also on the surface of the adjacent bone on both control and diabetic animals groups. This tissue showed morphological characteristics of immature bone, with high density of trabeculae and porosity. The diabetic condition seems to affect significantly the process of bone regeneration, even in the presence of techniques for guided bone regeneration, delaying the regeneration of the created defect.