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Lam et al. characterize a novel hematological/autoinflammatory disorder due to a de novo recurrent missense mutation of CDC42. The authors use in silico, in vitro, and in vivo analyses to correlate the molecular mechanisms altering CDC42 function to the observed phenotype., Hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is characterized by immune dysregulation due to inadequate restraint of overactivated immune cells and is associated with a variable clinical spectrum having overlap with more common pathophysiologies. HLH is difficult to diagnose and can be part of inflammatory syndromes. Here, we identify a novel hematological/autoinflammatory condition (NOCARH syndrome) in four unrelated patients with superimposable features, including neonatal-onset cytopenia with dyshematopoiesis, autoinflammation, rash, and HLH. Patients shared the same de novo CDC42 mutation (Chr1:22417990C>T, p.R186C) and altered hematopoietic compartment, immune dysregulation, and inflammation. CDC42 mutations had been associated with syndromic neurodevelopmental disorders. In vitro and in vivo assays documented unique effects of p.R186C on CDC42 localization and function, correlating with the distinctiveness of the trait. Emapalumab was critical to the survival of one patient, who underwent successful bone marrow transplantation. Early recognition of the disorder and establishment of treatment followed by bone marrow transplant are important to survival., Graphical Abstract

Background. Several mutations in CYP21 locus cause 21-Hydroxylase Deficiency (21-OHD). The most common mutations are widespread among the different geographic areas and their frequencies have been also reported to differ among certain populations. Aim. To obtain a large view on the frequencies of the most common mutations in the CYP21 locus, in Sicily, in Mediterranean and in other major geographic areas in the worldwide. Subjects and Methods. 308 unrelated CYP21A2 alleles leading 21-OHD in Sicily were genetically typed and compared with other series previously reported in Sicily and in surrounding regions. An analysis of the frequencies of the different geographic areas was also carried out. CYP21A2 typing was carried out using PCR-RFLP, for the detection of the CYP21A2 deletion, while sequencing analysis was performed to evaluate all the missense/non-sense mutations. Results: our study revealed that p.V281L (44.4%), I2splice (21.6%) and p.P30L (11.2%) were very frequent alleles, del8bp (0.4%) was found very rarely in Sicily and a novel mutation leading to nonclassical phenotype, p.L198F, was also discovered in this population. Allele frequencies were found to be significantly different from previously observed frequencies in Sicily. In addition, here we present the most significant frequency modifications among different geographic areas in the worldwide. Conclusions: as the distribution of the disease CYP21A2 alleles is heterogeneous around the world, the knowledge of the relative distributions allows a better management of 21-OHD for foetuses and newborns in different geographic areas.

We have previously described the development of a scaffold/matrix attachment region (S/MAR) episomal vector system for in vivo application and demonstrated its utility to sustain transgene expression in the mouse liver for at least 6 months following a single administration. Subsequently, we observed that transgene expression is sustained for the lifetime of the animal. The level of expression, however, does drop appreciably over time. We hypothesised that by eliminating the bacterial components in our vectors, we could improve their performance since bacterial sequences have been shown to be responsible for the immunotoxicity of the vector and the silencing of its expression when applied in vivo. We describe here the development of a minimally sized S/MAR vector, which is devoid of extraneous bacterial sequences. This minicircle vector comprises an expression cassette and an S/MAR moiety, providing higher and more sustained transgene expression for several months in the absence of selection, both in vitro and in vivo. In contrast to the expression of our original S/MAR plasmid vector, the novel S/MAR minicircle vectors mediate increased transgene expression, which becomes sustained at about twice the levels observed immediately after administration. These promising results demonstrate the utility of minimally sized S/MAR vectors for persistent, atoxic gene expression.

Background: Excessive androgen production, suspected in women when acne is accompanied by hirsutism and menstrual irregularities, may be due to congenital adrenal hyperplasia. This inherited disorder of cortisol biosynthesis is caused in more than 90–95% of all cases by 21-hydroxylase deficiency (21-OHD). The steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) has a high degree of variability. Objective: This study was conducted to evaluate CYP21 gene mutations in a selected group of women with papulopustular and comedonal acne refractory to treatment, irregular menses and hirsutism. Methods: 30 out of 61 women enrolled underwent pelvic ultrasound examination and hormonal screening. In 9 patients with a polycystic ovary and hormonal pattern of adrenal hyperandrogenism a significant elevation of adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulated 17-hydroxyprogesterone was detected. These women positive in the ACTH stimulation test were submitted to CYP21 gene analysis. Results: Genetic testing revealed several different point mutations and demonstrated that a cohort of patients resistant to acne therapy can be carriers or affected by non-classical 21-OHD (late onset). Conclusion: Persistent acne can be the unique presenting sign of non-classical 21-OHD. Evaluation of CYP21 gene mutations may identify female carriers or patients for genetic counselling.

A barrier limiting the use of nonviral vectors for gene therapy is related to the short duration of transgene expression in vivo. Development, evaluation, and optimisation of a long term transgene expression using a non viral vector is currently the primary aim in our research field. Recently, we have demonstrate that a nonviral episomal plasmid (pDNA) vector combined with a scaffold/matrix attachment region (S/MAR) is able to sustain long-term expression in murine liver for at least six months following hydrodynamic injection. However, plasmids contain sequences, which are essential for propagation in bacteria but are unnecessary for expression in mammalian cells. These bacterial components are responsible for the epigenetic silencing of the vector and toxicity when applied in vivo.

Trombofilia ereditaria e complicanze gravidiche nella popolazione siciliana. È ormai noto che la trombofilia congenita rappresen- ti un fattore di rischio per la gravidanza. Può infatti es- sere causa di abortività ricorrente, perdita fetale (MEF), ritardo di crescita fetale (IUGR) e altri problemi nel mantenimento della gravidanza (preeclampsia e di- stacco di placenta). Nel presente studio è stata indaga- ta la prevalenza dei fattori trombofilici nella popolazio- ne siciliana e la possibile relazione fra essi ed un even- to trombotico uteroplacentare in gravidanza. Sono sta- ti comparati due gruppi di gestanti con anamnesi posi- tiva per presenza di almeno un fattore trombofilico e storia di insuccessi riproduttivi e/o complicanze gravi- diche: gruppo di studio (120 donne) trattato con LMWH 0.3 mL associata all’ASA 50 mg; gruppo con- trollo (44 donne) non trattato. L’analisi dei genotipi associati al fenomeno compli- canze gravidiche ha evidenziato come, fra i fattori trombofilici, il polimorfismo PAI-1 4G/4G sia preva- lente nella popolazione siciliana e che esso, da solo o in associazione con altri difetti genetici, sia in grado di au- mentare il rischio di complicanze ostetriche del 50%. Come emerso già da altri lavori pubblicati in letteratu- ra, anche nel nostro studio si è avuta la conferma che il trattamento con un'anticoagulante come l'eparina a basso peso molecolare (LMWH) è utile nel ridurre le complicazioni.

La sindrome di Crigler-Najjar (CNS) è una malattia molto rara (prevalenza 1/1.000.000 nati) a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata da un incremento cronico e grave di bilirubina sierica indiretta (non coniugata), dovuta alla parziale (tipo 2) o completa (tipo 1) assenza funzionale dell’enzima epatico glucoronosil transferasi UGT1. La malattia si manifesta in età neonatale con un ittero precoce e intenso, dovuto alla presenza di bilirubina non coniugata e l'esame fisico è nella norma; in epoca di sviluppo gli effetti clinici della CNS tipo 1 sono letali in quanto l’eccesso di bilirubina porta inevitabilmente ad una encefalopatia essendo tale pigmento fortemente liposolubile. Le mutazioni ad oggi descritte causano l’assenza di sintesi enzimatica o la sintesi di un prodotto aberrante non funzionale. La CNS tipo 2, in particolare, è caratterizzata dalla presenza di un’attività enzimatica residua ed è causata da mutazioni autosomiche sia dominanti, a penetranza incompleta, che recessive nel gene UGT1A1. La prova clinica del fenobarbital consente di distinguere le due forme (tipo I e tipo II) mentre il test genetico è il metodo più specifico per la corretta diagnosi. Il gene UGT1A1 è situato in posizione telomerica nel cromosoma 2 (2q37.1) e si estende per 110Kb. Il gene è costituito da 4 esoni consecutivi (ex2-ex5) e da un gruppo di 10 varianti dell’esone 1 posti all’estremità 5’. La selezione per splicing alternativo dell’esone 1 è finemente regolato dal promotore ed è responsabile della sintesi delle varie isoforme dell’enzima (Fig. 1). La proteina enzimatica (precursore UDP-glucuronosyltransferase 1-1) consta di 533 aminoacidi. Le mutazioni missense che correlano con tale patologia sono circa 79 e tale numero è in continuo aggiornamento presso il database internazionale (sito http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php). Qui presentiamo due casi di Crigler Najjar tipo II dovuti a due nuove mutazioni del gene UGT1A1 e vogliamo sottolineare che l’eterogeneità genomica presso il nostro territorio suggerisce una valutazione completa del gene UGT1A1 per una corretta diagnosi di Crigler Najjar ed una valutazione funzionale delle nuove mutazioni eventualmente riscontrate.

When normal development and growth of the calvarial sutures is disrupted, craniosynostosis (premature calvarial suture fusion) may result. Classical craniosynostosis syndromes are autosomal dominant traits and include Apert, Pfeiffer, Crouzon, Jackson-Weiss, and Saethre-Chotzen syndromes. In these conditions, there is premature fusion of skull bones leading to an abnormal head shape, ocular hypertelorism with proptosis, and midface hypoplasia. It is known that mutations in the fibroblast growth factor receptors 1, 2, and 3 cause craniosynostosis. We report on a child with a clinically diagnosed Pfeiffer syndrome that shows the missense point mutation Q289P in exon 8 of the FGFR2 gene. This is a mutation not previously described in the Pfeiffer syndrome but reported in the Crouzon, Jackson-Weiss, and Saethre-Chotzen syndromes. In this paper, we propose the concept that these disorders may represent one genetic condition with phenotypic variability.

Un vettore ideale dovrebbe consentire l'espressione di un transgene senza alcuna limitazione di sicurezza e di riproducibilità. Qui riportiamo lo sviluppo di un nuovo vettore NON-virale basato su DNA episomale plasmidico (pDNA) che sembra soddisfare al pieno le caratteristiche del vettore ideale nel tessuto epatico. Questo pDNA deriva dalla combinazione tra un promotore epatospecifico (AAT promoter) posto a monte del transgene e un elemento S-MAR (Scafold/Matrix Attachment) posto a valle, mentre il reporter è gene della luciferasi. L'applicazione nel tessuto epatico è stata effettuata mediante iniezione ad alta pressione per via vena caudale del modello murino (hydrodynamic delivery). L'espressione a lungo termine è stata dimostrata attraverso diverse metodiche in vivo ed in vitro. In vivo, mediante l'utilizzo del Xenogen in vivo bio-imaging ai tempi "

L’Emofilia A, la più comune causa di disordine emorragico nell’uomo, è causata da una grande varietà di mutazioni genetiche nel gene F8 con un ampio range di quadri clinici definiti: forma severa (FaVIIIC G al nucleotide -2 nell’introne 16 (IVS16 -2). Tale mutazione porta verosimilmente ad una alterazione del sito di splicing e non essendo presente nei due genitori è da ritenersi una mutazione de novo.

Per una migliore comprensione patogenetica del ritardo mentale (RM) in combinazione o meno con le manifestazioni malformative, i tests di laboratorio sono di notevole importanza. La metodica CGH Array ha migliorato la sensibilità nella valutazione dei punti di rottura nelle delezioni cromosomiche. Qui presentiamo un caso di delezione 15q26.2-15qter in un bambina con medie note dismorfiche esterne (come la clinodattilia), interne (doppio distretto renale a destra) ed alcune alterazioni del linguaggio. L'analisi GCH Microarray è stata effettuata estraendo da linfociti di sangue periferico (Puregene DNA isolation kit, Gentra) e marcando (Cy5) il DNA del probando e realizzando l'Array CGH (Agilent human genome CGH Microarray Kit 4 x 44K, capacità risolutiva: 200Kb). La metodica FISH è stata realizzata mediante il multiprobe-T (Cytocell, UK) in accordo con le raccomandazioni della casa costruttrice. La comparazione genomica tra il DNA del probando ed il DNA di controllo (Human DNA, Promega), opportunamente marcato (Cy3), ha evidenziato la presenza di una monosomia parziale di circa 5,55 Mb del braccio lungo del cromosoma 15 (posizioni: da 94.783.205 a 100.338.915). La valutazione dei break points in tale monosomia ci consente di valutare i geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi del RM. Particolare rilievo hanno i geni IGFR1, MEF2A e CHSY1 le cui alterazioni sembrano essere legate a più processi di sviluppo somatico e del SNC .

An ideal gene therapy vector should enable persistent transgene expression without limitations of safety and reproducibility. Here we report the development of a non-viral episomal plasmid DNA (pDNA) vector that appears to fulfil these criteria. This pDNA vector combines a scaffold/matrix attachment region (S/MAR) with a human liver-specific promoter (alpha1-antitrypsin (AAT)) in such a way that long-term expression is enabled in murine liver following hydrodynamic injection. Long-term expression is demonstrated by monitoring the longitudinal luciferase expression profile for up to 6 months by means of in situ bioluminescent imaging. All relevant control pDNA constructs expressing luciferase are unable to sustain significant transgene expression beyond 1 week post-administration. We establish that this shutdown of expression is due to promoter methylation. In contrast, the S/MAR element appears to inhibit methylation of the AAT promoter thereby preventing transgene silencing. Although this vector appears to be maintained as an episome throughout, we have no evidence for its establishment as a replicating entity. We conclude that the combination of a mammalian, tissue-specific promoter with the S/MAR element is sufficient to drive long-term episomal pDNA expression of genes in vivo.

La deficienza enzimatica di G6PDH è uno dei più comuni disordini nella popolazione siciliana in quanto più di 400 milioni di persone ne sono affette. Al fine di valutare la reale prevalenza dei casi nel nostro territorio presentiamo i dati di uno studio di genotipizzazione del locus G6PD (Xq28). 349 soggetti Siciliani di sesso maschile affetti da deficienza di G6PDH sono stati tipizzati secondo varie metodiche. Gli approcci di laboratorio sono: RFLPs (NlaIII, BclI, PstI e BspHI), PCR-Reverse Dot Blot (RDB) ed il sequenziamento diretto del gene. Le prime metodiche sono utili per definire le mutazioni già descritte e comunque le più comuni; il sequenziamento diretto è determinante per la valutazione delle nuove varianti genotipiche. Oltre alla coorte di campioni è stata tipizzata anche una coorte di controllo costituita da 104 individui maschi Siciliani da almeno tre generazioni e clinicamente asintomatici. I dati ottenuti consentono di definire la prevalenza delle mutazioni più frequenti del gene G6PD (G6PD*Siattle G844C, 37%; G6PD*Mediterranea C563T, 32%; G6PD*AG202A / A376G, 18%; G6PD*Santamaria A376G / A542T, 9%). Inoltre, grazie al sequenziamento genico diretto è stato possibile identificare una nuova variante G6PD*Palermo R257M (C769A / G770A Esone 7). Lo studio dei genotipi G6PD in Sicilia acquisisce notevole importanza in quanto anche questi sono stati oggetto di selezione naturale positiva in tempi endemici di Malaria.

An ideal gene therapy vector should enable persistent transgene expression without limitations of safety and reproducibility. Here we report the development of a non-viral episomal plasmid DNA (pDNA) vector that appears to fulfil these criteria. This pDNA vector combines a scaffold/matrix attachment region (S/MAR) with a human liver-specific promoter (a1-antitrypsin (AAT)) in such a way that long-term expression is enabled in murine liver following hydrodynamic injection. Long-term expression is demonstrated by monitoring the longitudinal luciferase expression profile for up to 6 months by means of in situ bioluminescent imaging. We conclude that the combination of a mammalian, tissue-specific promoter with the S/MAR element is sufficient to drive longterm episomal pDNA expression of genes in vivo.