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Les lymphocytes T orchestrent la réponse immunitaire adaptative afin de nous protéger contre les pathogènes. Les lymphocytes T sont dotés d’un récepteur de surface, le récepteur de cellules T (TCR), qui transmet le signal de stimulation vers l’intérieur de la cellule afin d’amorcer la cascade d’activation des cellules T. Le TCR est un complexe multimérique composé des dimères TCRαβ, CDεγ, CD3εδ et CD3ζζ. Les chaînes TCRαβ reconnaissent les antigènes pathogéniques tandis que les chaînes CD3 initient la cascade de signalisation des cellules T par la phosphorylation de leurs chaînes cytoplasmiques. Il est toujours incompris comment le signal d’activation du TCR est transmis des chaînes TCRαβ jusqu’aux domaines cytoplasmiques des chaînes CD3. Chez les lymphocytes T au repos, les chaînes CD3ε et CD3ζ sont associées au feuillet interne de la membrane plasmique (MP). Le domaine cytoplasmique de CD3ε et CD3ζ est riche en acides aminés basiques, ce qui permet leur association électrostatique avec les phospholipides acides de la MP. La phosphatidylsérine (PS) est le phospholipide acide le plus abondant de la MP. La PS est redistribuée exclusivement à la face cytoplasmique de la MP. Lors de l’activation des lymphocytes T, les chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs doivent se détacher de la PS pour leur phosphorylation. La dissociation membranaire d’un grand nombre de chaînes CD3 est essentielle à l’amplification de l’activation des lymphocytes T. Un mécanisme de dissociation des chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs proposé dans la littérature est par l’élévation intracellulaire de calcium. Un influx robuste de calcium est généré suivant la stimulation des cellules T. En plus d’être essentiel à l’activation efficace des cellules T, il a été proposé que le calcium neutralise les phospholipides acides de la MP afin de dissocier les chaînes CD3. Le calcium est également un co-facteur dans l’activité de plusieurs enzymes, comme la scramblase lipidique TMEM16F. TMEM16F redistribue la PS à la MP suivant l’élévation du calcium intracellulaire, ce qui résulte en la réduction de la PS au feuillet interne. Nous avons donc émis l’hypothèse que le calcium régule la dissociation des chaînes CD3 par l’activation de TMEM16F. Notre étude démontre que la redistribution calcium-dépendante de la PS par TMEM16F est essentielle à la dissociation membranaire de CD3ε dans la lignée de cellules T Jurkat. La réduction de l’expression de TMEM16F par ARN interférant (shTMEM16F) empêche la dissociation massive des chaînes CD3ε suivant la stimulation des cellules T. De plus, les cellules shTMEM16F démontrent une diminution de la phosphorylation des molécules de signalisation des cellules T. En contraste, l’expression d’une forme constitutivement active de TMEM16F augmente la redistribution de PS à la MP, la dissociation membranaire des chaînes CD3ε et la phosphorylation des molécules de signalisation. Notre étude démontre que la redistribution de la PS par la scramblase calcium-dépendante TMEM16F régule la dissociation membranaire des chaînes CD3 du TCR afin d’amplifier l’activation des cellules T. Enfin, nous avons confirmé les défauts d’activation dans des cellules T murines primaires exprimant shTMEM16F lors d’une réponse immunitaire. En conclusion, notre étude démontre le rôle de la régulation de la PS dans l’activation des cellules T. Nous avons démontré que nous pouvons modifier le niveau d’activation des cellules T en modulant la PS à la MP. Nos résultats ont ainsi plusieurs implications pour la conception et l’amélioration des immunothérapies basées sur les cellules T., T lymphocytes protect us against pathogens by orchestrating the adaptive immune response. T lymphocytes possess a specific surface receptor, the T cell receptor (TCR), which conveys the stimulation signal towards the cytoplasm for the initiation of the T cell activation cascade. The TCR is a multimeric complex composed of the TCRαβ, CDεγ, CD3εδ and CD3ζζ dimers. The TCRαβ chains recognize the pathogenic antigens while the CD3 chains initiate the T cells signaling cascade through the phosphorylation of their cytoplasmic tails. It is not yet understood how the TCR activating signal is transmitted through the membrane from the TCRαβ chains towards the cytoplasmic tails of the CD3 chains. In resting T cells, the CD3ε and CD3ζ chains are associated to the inner leaflet of the plasma membrane (PM). The cytoplasmic tails of CD3ε and CD3ζ are rich in basic amino acids, which allow electrostatic association with acidic phospholipids at the PM. Phosphatidylserine (PS) is the most abundant acidic phospholipid and is exclusively distributed towards the cytoplasmic PM leaflet. During T cell activation, the CD3ε and CD3ζ cytoplasmic tails have to dissociate from PS for their phosphorylation. The membrane dissociation of a large number of CD3 chains is essential for the amplification of T cell activation. A mechanism of CD3ε and CD3ζ chain dissociation that has been proposed in the literature is through intracellular calcium elevation. A robust calcium influx is generated following T cell stimulation. In addition to its essential role in regulating T cell activation, it has been proposed that calcium ions neutralize the PM acidic phospholipids for CD3 chain dissociation. Calcium is also an essential cofactor for the activity of many enzymes, such as the phospholipid scramblase TMEM16F. TMEM16F redistributes PS at the PM following intracellular calcium mobilization, resulting in a reduction of inner leaflet PS. We propose that calcium regulates CD3 chain dissociation through TMEM16F activity. Our study demonstrates that calcium-dependent PS redistribution by TMEM16F is required for CD3ε membrane dissociation in the Jurkat T cell line. Reduction of TMEM16F expression by shRNA targeting (shTMEM16F) prevents massive CD3ε chain dissociation following 8 T cell stimulation. The shTMEM16F cells show a reduction in the phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. In contrast, expression of a constitutively active mutant of TMEM16F increases PS redistribution, CD3ε chain dissociation and phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. Our study demonstrates that PS redistribution by the calcium-dependent TMEM16F scramblase regulates CD3 chain dissociation for the amplification of T cell activation. In addition, we have confirmed T cell activation defects in shTMEM16F murine primary T cells during an immune response. In conclusion, our study demonstrates the role of PS regulation by TMEM16F in T cell activation. We showed that we could modify the level of T cell activation by modulating the concentration of PS at the inner leaflet of the PM. Our results thus have important implications for the development and improvement of immune receptor-based cancer immunotherapies.

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

The plasma membrane of most eukaryotic cells possess specialized invaginated lipid nanodomains called caveolae. Like clathrin coated pits, caveolae possess a characteristic coat composed of a suite of essential proteins including caveolins and cavins [Parton and Simons 2007, Parton and del Pozo 2013, Lamaze et al. 2017]. In addition to being implicated in important cellular functions such as transcytosis, lipid homeostasis, endocytosis and signaling, caveolae have been recently shown to demonstrate a protective role in maintaining the integrity of the plasma membrane under conditions of mechanical stress [Sinha et al. 2011]. The caveolar pits act as ‘membrane reservoirs’ that can flatten out by disassembling their coat and thereby buffer the membrane tension variations resulting from mechanical stress. Following caveolae flattening, caveolins and the caveolar coat proteins are released and this event has been hypothesized to be involved in downstream signal transduction [Nassoy and Lamaze 2012]. The goal of my thesis work was to unravel the precise control of signaling by caveolae mechanics. Here we tried to dissect mechanotransduction through caveolae by elucidating the molecular events underlying the control of JAK-STAT signaling through disassembly of caveolae. Using state-of-the-art super resolution imaging combined with machine-learning network analysis, we show that in response to mechanical stress, caveolae disassemble into so-called smaller scaffolds (also known as non-caveolar caveolin-1 (Cav1) which display increased mobility at the plasma membrane. In addition, we found that Cav-1 negatively regulates JAK1 kinase dependent STAT3 phosphorylation. Furthermore, we revealed the interaction between Cav1 and JAK1 which increases upon an increase in mechanical stress and is mediated by the caveolin scaffolding domain (CSD). Taken together, our results demonstrate that caveolae can act as mechano-signaling organelles with an ability to remotely control downstream signal transduction from the plasma membrane., La membrane plasmique de la plupart des cellules eucaryotes possède des nanodomaines lipidiques invaginés spécialisés appelés cavéoles. Comme les puits recouverts de clathrine, les cavéoles possèdent un manteau caractéristique composé de protéines essentielles comprenant les cavéolines et les cavines [Parton et Simons 2007, Parton et del Pozo 2013, Lamaze et.al 2017]. En plus d'être impliquées dans des fonctions cellulaires importantes telles que la transcytose, l'homéostasie lipidique, l'endocytose et la signalisation, le rôle protecteur des cavéoles dans le maintien de l'intégrité de la membrane plasmique dans des conditions de stress mécanique a récemment été démontré [Sinha et al. 2011]. Les cavéoles agissent comme des « réservoirs membranaires » qui peuvent s'aplatir en démantelant leur manteau protéique et ainsi amortir les variations de tension membranaire résultant des contraintes mécaniques. Après l'aplatissement des cavéoles, cavéolines et leurs protéines d'enveloppe sont libérées et cet événement a été supposé être impliqué dans la transduction du signal en aval [Nassoy et Lamaze 2012]. Le but de mon travail de thèse était de décrypter le contrôle précis de la signalisation par la mécanique des cavéoles. Nous avons donc essayé de disséquer la mécanotransduction cavéolaire en élucidant les événements moléculaires sous-jacents au contrôle de la signalisation JAK-STAT par le désassemblage des cavéoles. En combinant l’imagerie à super résolution à l’analyse de réseaux par apprentissage automatique (machine learning), nous montrons qu'en réponse à un stress mécanique, les cavéoles se fragmentent en assemblages plus petits (également appelés cavéoline-1 (Cav1) non cavéolaires) qui présentent une augmentation de leur mobilité au niveau de la membrane plasmique. En outre, nous avons constaté que Cav-1 régule négativement la phosphorylation de STAT3 dépendante de la kinase JAK1. De plus, nous avons observé l'interaction entre Cav1 et JAK1 qui augmente lors d'un stress mécanique plus important et qui est médiée par le domaine d'échafaudage de la cavéoline (CSD). L’ensemble de nos résultats démontrent que les cavéoles peuvent agir comme des organites de mécano-signalisation avec la capacité de contrôler à distance la transduction du signal en aval de la membrane plasmique.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes.; La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes., La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

ITCH est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans différents processus cellulaires. Elle contient une région riche en prolines (PRR, proline rich region) qui lui permet de lier le domaine SH3 (Src homology 3) d’Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans l’endocytose clathrine-dépendante de récepteurs tel le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, epidermal growth factor receptor). Après activation, l’EGFR est internalisé dans des vésicules enrobées de Clathrine et un complexe protéique formé par CBL, CIN85 et Endophiline participe à cet évènement. ITCH lie l’ubiquitine à CBL et à Endophiline pour vraisemblablement modifier leurs fonctions, ce qui suggère un lien direct entre cette ligase et l’endocytose de l’EGFR. Afin de déterminer le rôle d’ITCH dans ce processus, plusieurs expériences furent réalisées. Premièrement, la modalité de liaison entre la ligase ITCH et les protéines à domaine SH3 a été étudiée en détails. Une série de mutations dans la région PRR d’ITCH nous a aidé à identifier trois résidus arginines (R252, R255, R258) nécessaires pour son interaction avec Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Deuxièmement, des lignées cellulaires HeLa et Cos7 furent modifiées génétiquement par CRISPR pour empêcher l’expression d’ITCH. Ces lignées cellulaires knockout furent caractérisées et utilisées dans un essai d’endocytose de l’EGFR, puis examinées par spectrométrie de masse. L’internalisation d’EGFR fut suivie en microscopie confocale à l’aide d’un ligand EGF fluorescent -/- dans les deux types de cellules ITCH . En absence d’ITCH, nous observons une diminution significative du niveau d’EGF internalisé par rapport aux cellules parentales. La surexpression d’ITCH dans les cellules ITCH-/- rétablit l’internalisation normale de l’EGF, confirmant l’implication d’ITCH dans le processus, mais la surexpression des formes mutantes de ITCH incapable de lier Endophiline ou catalytiquement inactive ne rétablit pas l’internalisation de l’EGF. Ces résultats nous permettent de conclure que l’interaction ITCH-Endophiline et la fonction catalytique de ITCH sont nécessaires pour l’endocytose de l’EGFR. Ensemble, ces deux fonctions de ITCH régulent le trafic endocytique de l’EGFR. De plus, les cellules ITCH-/- montrent un délai de dégradation de l’EGFR phosphorylé ainsi qu’une prolongation du temps d’activation de la kinase MAPK (mitogen-activated protein kinase). Finalement, pour explorer l’influence de l’absence d’ITCH sur ses substrats et partenaires moléculaires nous avons effectué une comparaison protéomique des partenaires d’interaction et des protéines ubiquitylées à partir des lysats cellulaires ITCH-/- et WT. Les résultats ont montré que le manque d’expression de la ligase ITCH altère la présence peptidique des protéines liées à la signalisation de l’EGFR, à la voie protéolytique dépendante de l'ubiquitine et à l’adhésion cellulaire. Cette étude révèle pour une première fois que la protéine ITCH est requise pour l’endocytose dépendante de la Clathrine de l’EGFR., ITCH is a ubiquitin ligase involved in various cellular processes including endocytosis. It contains a proline rich region (PRR) which allows it to bind the SH3 domain of endophilin and other SH3 domain-containing proteins involved in Clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is an important regulatory mechanism for growth factor receptor activity. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is actively internalized in Clathrin-coated vesicles after activation. This endocytosis is facilitated by a protein complex formed by CBL, CIN85 and Endophilin. ITCH is known to ubiquitinate both CBL and endophilin, providing a potential functional link between the ligase and receptor internalization. In order to determine the role of ITCH in this process, several experiments were performed. First, the mapping of molecular binding sites between the ligase ITCH and SH3 domain proteins has been studied in detail. A series of mutations in the PRR region of ITCH helped us identify three arginine residues (R252, R255, R258) as necessary for its interaction with endophilin and all the tested SH3-domain containing proteins. Secondly, HeLa and Cos7 cell lines were genetically modified by CRISPR to prevent ITCH expression. These knockout cell lines were characterized for use in an EGFR endocytosis assay and for mass spectrometry analysis. EGFR internalization was monitored by confocal microscopy using fluorescent EGF ligand in both ITCH-/- cell types. In the absence of ITCH, a significant decrease in the level of internalized EGF compared to parental cells is visible. Overexpression of WT ITCH in the knockout cells restores normal internalization of EGF, confirming the involvement of ITCH in the process. Overexpression of Endophilin-binding defective or catalytically inactive ITCH does not restore the internalization of EGF in ITCH-/- cells. These results show that the ITCH- Endophilin interaction as well as the catalytic function of ITCH are necessary for the endocytosis of EGFR. In addition, ITCH-/- cells show a delay in the degradation of phosphorylated EGFR accompanied with an extended period of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. In a last set of experiments, we explored the influence of the absence of ITCH on its substrates and molecular partners. We performed a proteomic comparison of ITCH-binding partners and potential substrates using the ITCH-/- and WT cell lysates. The results showed that the lack of ITCH expression alters the peptide count of proteins mainly related to EGFR signaling, theubiquitin-dependent proteolytic pathway and cell adhesion. This study shows for the first time that the protein ITCH is required for the clathrin-dependent endocytosis of EGFR.

Strigolactones (SL) make up a novel class of phytohormones that are found across the whole land plant lineage. In vascular plants, the main hormonal role of SL is the repression of shoot axillary branching. However, SL are also a major symbiotic signal, granting the plant increased access to the nutrients and water contained in the rhizosphere. These two functions of SL led to the hypothesis that these molecules have been instrumental at the time of land colonization by plants, approximately 450 million years ago. Studying SL biosynthesis and signaling in the bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, a non-vascular plant), and comparing these processes with the available knowledge in vascular plants, enables to investigate the evolution of SL cellular pathways in land plants. As a matter of facts, SL biosynthesis and signaling pathways are quite extensively described in vascular plants. Notably, SL signaling starts in the cytosol where the SL molecule binds to the D14 receptor. D14 cleaves the SL and stays covalently linked to a part of the SL. Under this conformation, D14 can then interact with two partners in the nucleus: the MAX2 F-box protein and SMXL proteins. SMXL proteins act as repressors of the SL response, as their interaction with D14 and MAX2 will trigger their ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Most SL biosynthesis and signaling genes have homologs in P. patens genome, sometimes in different numbers. Nevertheless, only reverse genetics approaches can clearly establish these homologs function. Previous characterization of P. patens SL deficient mutant Ppccd8 revealed that SL biosynthesis is broadly conserved between mosses and vascular plants. Furthermore, SL play a similar role in the regulation of plant architecture in P. patens as demonstrated in vascular plants. On the other hand, results presented herein show that SL signaling is only partly conserved between P. patens and vascular plants, supporting the prior observation that the sole MAX2 homolog in P. patens is not needed for SL response. Indeed, only 2 out of the 13 P. patens D14 homologs (PpKAI2L genes) are involved in SL perception according to the characterization of Ppkai2l CRISPR knock-out mutants and to biochemistry analyses. Moreover, instead of D14, PpKAI2L proteins are closer to the KAI2 protein, which is not involved in SL perception in vascular plants. In addition, the phenotype of CRISPR knock-out mutants for the PpSMXL genes, together with genetic linkage analysis of PpSMXL with PpMAX2 and PpCCD8, show that none of the 4 PpSMXL proteins play a major role in SL response. However, the two PpSMXL homologs that are closer to the ancestral land plants SMXL seem to be important regulators of growth, which as per recent phylogenetic studies could be the ancestral role of the SMXL family. This effect on growth would actually be the main response to the ancestral KL (KAI2-ligand) signal, an endogenous signal different from SL. Transduction of the KL signal would hence be conserved across land plants and would be achieved in P. patens via some PpKAI2L proteins, together with the PpMAX2 and at least two PpSMXL proteins. To date, the identity of the KL molecule(s) remains under debate. As SL signaling is not conserved in P. patens, it appears that the known SL signaling pathway results from a vascular plants specific innovation. Likewise, SL response in P. patens would be the product of a convergent evolution. Therefore, the question as to how P. patens transduces the SL signal, downstream of perception by specific PpKAI2L proteins, remains open.; Les strigolactones (SL) sont une nouvelle classe de phytohormones, retrouvées chez toutes les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les SL ont un rôle hormonal prédominant dans la régulation de l’architecture aérienne, mais aussi une fonction de signal symbiotique, favorisant ainsi la captation d’eau et de nutriments du sol par les plantes. Ces deux fonctions ont conduit à l’hypothèse selon laquelle les SL ont pu être essentielles dans les processus de colonisation du milieu terrestre par les plantes il y a 450 millions d’années. L’étude de la biosynthèse et de la signalisation des SL chez la bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, non-vasculaire), par comparaison avec ce qui est connu chez les plantes vasculaires, permet de questionner l’évolution des voies cellulaires associées aux SL chez les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les voies de biosynthèse et de perception des SL sont assez bien décrites. La voie de signalisation des SL commence par la perception de la molécule par le récepteur D14 dans le cytosol, qui la clive et reste associé à une partie de la SL. Ce complexe interagit dans le noyau avec deux partenaires : la protéine à boîte F MAX2, capable de recruter un complexe d’ubiquitination, et certaines protéines SMXL. Ces protéines agissent comme des répresseurs de la réponse aux SL et vont être ubiquitinées sous l’action du complexe recruté par MAX2, puis rapidement dégradées par le protéasome. Chez P. patens, la plupart des gènes de biosynthèse et de signalisation des SL sont retrouvés, parfois en nombres différents comparés aux plantes vasculaires. Seules des approches de génétique inverse permettent de définir précisément leur fonction. La précédente caractérisation du mutant de biosynthèse Ppccd8 chez P. patens a montré que les SL sont synthétisées via une voie similaire à celle des plantes vasculaires. En outre, la fonction des SL dans la régulation de l’architecture est conservée chez P. patens. Au contraire, en accord avec la découverte précédente que l’unique homologue de MAX2 chez P. patens n’est pas impliqué dans la signalisation des SL, les résultats ici présentés indiquent que la signalisation des SL n’est que partiellement conservée entre P. patens et les plantes vasculaires. En effet, seuls 2 homologues PpKAI2L de D14, sur les 13 possédés par P. patens, sont impliqués dans la perception des SL, d’après l’étude de mutants perte-de-fonction et les analyses de biochimie. Par ailleurs, les protéines PpKAI2L sont phylogénétiquement plus proches d’une autre protéine appelée KAI2 que de D14. Or KAI2 ne perçoit pas les SL chez les plantes vasculaires. De plus, la caractérisation des mutants perte-de-fonction Ppsmxl, obtenus par l’utilisation de la technologie CRISPR, et les analyses de liaison génétique avec PpMAX2 et PpCCD8 montrent que les quatre protéines PpSMXL ne jouent pas un rôle majeur dans la réponse aux SL. Cependant, les protéines PpSMXL les plus proches phylogénétiquement des SMXL ancestrales apparaissent comme des régulateurs importants de la croissance, ce qui pourrait constituer le rôle ancestral des protéines SMXL, en accord avec des études phylogénétiques récentes. Cette régulation de la croissance constituerait la réponse à un autre signal endogène, plus ancestral que les SL, le KL (ligand de KAI2). La transduction du signal KL serait conservée au moins chez les plantes terrestres et impliquerait chez P. patens certaines protéines PpKAI2L et les protéines PpMAX2 et PpSMXL. L’identité moléculaire du KL n’a pas encore été élucidée. N’étant pas conservée chez P. patens, la signalisation des SL résulte possiblement d’une innovation spécifique de la lignée des plantes vasculaires. Ainsi, la voie de réponse aux SL présente chez la mousse résulterait d’une évolution convergente vers la perception des SL. Il reste donc à élucider comment le signal SL est transduit chez P. patens, en aval de sa perception par certaines protéines PpKAI2L.

Strigolactones (SL) make up a novel class of phytohormones that are found across the whole land plant lineage. In vascular plants, the main hormonal role of SL is the repression of shoot axillary branching. However, SL are also a major symbiotic signal, granting the plant increased access to the nutrients and water contained in the rhizosphere. These two functions of SL led to the hypothesis that these molecules have been instrumental at the time of land colonization by plants, approximately 450 million years ago. Studying SL biosynthesis and signaling in the bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, a non-vascular plant), and comparing these processes with the available knowledge in vascular plants, enables to investigate the evolution of SL cellular pathways in land plants. As a matter of facts, SL biosynthesis and signaling pathways are quite extensively described in vascular plants. Notably, SL signaling starts in the cytosol where the SL molecule binds to the D14 receptor. D14 cleaves the SL and stays covalently linked to a part of the SL. Under this conformation, D14 can then interact with two partners in the nucleus: the MAX2 F-box protein and SMXL proteins. SMXL proteins act as repressors of the SL response, as their interaction with D14 and MAX2 will trigger their ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Most SL biosynthesis and signaling genes have homologs in P. patens genome, sometimes in different numbers. Nevertheless, only reverse genetics approaches can clearly establish these homologs function. Previous characterization of P. patens SL deficient mutant Ppccd8 revealed that SL biosynthesis is broadly conserved between mosses and vascular plants. Furthermore, SL play a similar role in the regulation of plant architecture in P. patens as demonstrated in vascular plants. On the other hand, results presented herein show that SL signaling is only partly conserved between P. patens and vascular plants, supporting the prior observation that the sole MAX2 homolog in P. patens is not needed for SL response. Indeed, only 2 out of the 13 P. patens D14 homologs (PpKAI2L genes) are involved in SL perception according to the characterization of Ppkai2l CRISPR knock-out mutants and to biochemistry analyses. Moreover, instead of D14, PpKAI2L proteins are closer to the KAI2 protein, which is not involved in SL perception in vascular plants. In addition, the phenotype of CRISPR knock-out mutants for the PpSMXL genes, together with genetic linkage analysis of PpSMXL with PpMAX2 and PpCCD8, show that none of the 4 PpSMXL proteins play a major role in SL response. However, the two PpSMXL homologs that are closer to the ancestral land plants SMXL seem to be important regulators of growth, which as per recent phylogenetic studies could be the ancestral role of the SMXL family. This effect on growth would actually be the main response to the ancestral KL (KAI2-ligand) signal, an endogenous signal different from SL. Transduction of the KL signal would hence be conserved across land plants and would be achieved in P. patens via some PpKAI2L proteins, together with the PpMAX2 and at least two PpSMXL proteins. To date, the identity of the KL molecule(s) remains under debate. As SL signaling is not conserved in P. patens, it appears that the known SL signaling pathway results from a vascular plants specific innovation. Likewise, SL response in P. patens would be the product of a convergent evolution. Therefore, the question as to how P. patens transduces the SL signal, downstream of perception by specific PpKAI2L proteins, remains open.; Les strigolactones (SL) sont une nouvelle classe de phytohormones, retrouvées chez toutes les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les SL ont un rôle hormonal prédominant dans la régulation de l’architecture aérienne, mais aussi une fonction de signal symbiotique, favorisant ainsi la captation d’eau et de nutriments du sol par les plantes. Ces deux fonctions ont conduit à l’hypothèse selon laquelle les SL ont pu être essentielles dans les processus de colonisation du milieu terrestre par les plantes il y a 450 millions d’années. L’étude de la biosynthèse et de la signalisation des SL chez la bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, non-vasculaire), par comparaison avec ce qui est connu chez les plantes vasculaires, permet de questionner l’évolution des voies cellulaires associées aux SL chez les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les voies de biosynthèse et de perception des SL sont assez bien décrites. La voie de signalisation des SL commence par la perception de la molécule par le récepteur D14 dans le cytosol, qui la clive et reste associé à une partie de la SL. Ce complexe interagit dans le noyau avec deux partenaires : la protéine à boîte F MAX2, capable de recruter un complexe d’ubiquitination, et certaines protéines SMXL. Ces protéines agissent comme des répresseurs de la réponse aux SL et vont être ubiquitinées sous l’action du complexe recruté par MAX2, puis rapidement dégradées par le protéasome. Chez P. patens, la plupart des gènes de biosynthèse et de signalisation des SL sont retrouvés, parfois en nombres différents comparés aux plantes vasculaires. Seules des approches de génétique inverse permettent de définir précisément leur fonction. La précédente caractérisation du mutant de biosynthèse Ppccd8 chez P. patens a montré que les SL sont synthétisées via une voie similaire à celle des plantes vasculaires. En outre, la fonction des SL dans la régulation de l’architecture est conservée chez P. patens. Au contraire, en accord avec la découverte précédente que l’unique homologue de MAX2 chez P. patens n’est pas impliqué dans la signalisation des SL, les résultats ici présentés indiquent que la signalisation des SL n’est que partiellement conservée entre P. patens et les plantes vasculaires. En effet, seuls 2 homologues PpKAI2L de D14, sur les 13 possédés par P. patens, sont impliqués dans la perception des SL, d’après l’étude de mutants perte-de-fonction et les analyses de biochimie. Par ailleurs, les protéines PpKAI2L sont phylogénétiquement plus proches d’une autre protéine appelée KAI2 que de D14. Or KAI2 ne perçoit pas les SL chez les plantes vasculaires. De plus, la caractérisation des mutants perte-de-fonction Ppsmxl, obtenus par l’utilisation de la technologie CRISPR, et les analyses de liaison génétique avec PpMAX2 et PpCCD8 montrent que les quatre protéines PpSMXL ne jouent pas un rôle majeur dans la réponse aux SL. Cependant, les protéines PpSMXL les plus proches phylogénétiquement des SMXL ancestrales apparaissent comme des régulateurs importants de la croissance, ce qui pourrait constituer le rôle ancestral des protéines SMXL, en accord avec des études phylogénétiques récentes. Cette régulation de la croissance constituerait la réponse à un autre signal endogène, plus ancestral que les SL, le KL (ligand de KAI2). La transduction du signal KL serait conservée au moins chez les plantes terrestres et impliquerait chez P. patens certaines protéines PpKAI2L et les protéines PpMAX2 et PpSMXL. L’identité moléculaire du KL n’a pas encore été élucidée. N’étant pas conservée chez P. patens, la signalisation des SL résulte possiblement d’une innovation spécifique de la lignée des plantes vasculaires. Ainsi, la voie de réponse aux SL présente chez la mousse résulterait d’une évolution convergente vers la perception des SL. Il reste donc à élucider comment le signal SL est transduit chez P. patens, en aval de sa perception par certaines protéines PpKAI2L.

Legumes adapt their root architecture to environmental conditions by modifying the growth and number of their lateral roots, but also by developing nitrogen-fixing nodules in nitrogen-deficient conditions and in the presence of symbiotic bacteria (rhizobia). Systemic regulatory pathways involving signaling peptides perceived by receptors kinase allow the coordination of the development of these root organs according to the availability of nitrogen in the soil and the needs of the plant. The objectives of this thesis were, on the one hand, to identify which peptide signal acts via one of these receptors, namely CRA2, to induce nodulation and suppress the formation of lateral roots; and secondly to determine how this pathway integrates with other signaling pathways regulating the root architecture, ie (i) the systemic pathway involving CLE signaling peptides and the SUNN receptor negatively regulating nodulation and (ii) the pathway of cytokinin phytohormones regulating root architecture similarly to CRA2. We have shown that the CRA2 receptor is required for the action of the signaling peptide MtCEP1, and that the two systemic pathways antagonistically regulating nodulation act independently. Finally, we have shown that the MtCEP7 gene, induced by rhizobium and cytokinins, promotes rhizobial infections, and its production is coordinated with that of a CLE peptide that negatively regulates nodulation, via cytokinins and the NIN transcription factor., Les légumineuses adaptent l’architecture de leur système racinaire aux conditions environnementales en modifiant la croissance et le nombre de leurs racines latérales mais aussi en développant des nodosités fixatrices d’azote en condition de carence azotée et en présence de bactéries symbiotiques (rhizobia). Des voies de régulation systémique impliquant des peptides de signalisation perçus par des récepteurs kinases permettent la coordination du développement de ces organes racinaires en fonction de la disponibilité en azote dans le sol et des besoins de la plante. Les objectifs de cette thèse était d’une part d’identifier quel signal peptidique agit via l’un de ces récepteurs, appelé CRA2, pour induire la nodulation et réprimer la formation des racines latérales ; et d’autre part de déterminer comment cette voie s’intègre avec d’autres voies de signalisation régulant l’architecture racinaire, ie (i) la voie systémique impliquant des peptides de signalisation CLE et le récepteur SUNN régulant négativement la nodulation et (ii) la voie des phytohormones cytokinines régulant l’architecture racinaire de manière similaire à CRA2 .Nous avons montré que le récepteur CRA2 est requis pour l’action du peptide de signalisation MtCEP1, et que les deux voies systémiques régulant de manière antagoniste la nodulation agissaient de manière indépendante Enfin, nous avons montré que le gène MtCEP7, induit par rhizobium et les cytokinines, favorise les infections rhizobiennes, et sa production est coordonnée avec celle d’un peptide CLE régulant négativement la nodulation, via les cytokinines et le facteur de transcription NIN.

Signaling by the interleukin-2 receptor (IL-2R) is regulated by its clathrin-independent endocytosis (CIE) and subsequent degradation, while playing a critical role in immunity. Interestingly, CIE lacks a coat protein that drives pit formation, raising the question of how the CIE vesicle is initiated. Protein clustering generates forces that can induce membrane conformational changes. Notably, IL-2R has been shown to accumulate at the base of membrane protrusions, where receptors might cluster and thereby initiate the pit.To study the relevance of IL-2R clustering in its endocytosis, we generated a CRISPR-edited T cell line expressing GFP-IL-2Rᵧ and analyzed its stoichiometry at the plasma membrane, by TIRF microscopy coupled to a single-molecule endocytic tracking method. We identified distinct IL-2Rᵧ cluster populations. IL-2Rᵧ seems to reach the cell surface as a preassembled cluster to which further molecules are added, reaching an optimal cluster size that is key for its internalization. Binding of IL-2 promotes the formation of endocytic clusters and receptor uptake, highlighting the importance of clustering for CIE internalization.Moreover, we found that cholesterol depletion increases the proportion of large, non-endocytic clusters as well as IL-2R signaling. Disruption of the actin meshwork also promotes the formation of large clusters, yet it decreases IL-2R signaling. Thus, both factors regulate IL-2R endocytosis and signaling in a distinct manner. Our results provide new insights into the mechanisms regulating receptor signaling and CIE.; La signalisation par le récepteur de l'interleukine-2 (IL-2R), est régulée par son endocytose indépendante de la clathrine (EIC) et sa dégradation ultérieure, tout en jouant un rôle essentiel dans l'immunité. L'endocytose indépendante de la clathrine étant dépourvue de manteau protéique induisant la formation des puits, la question qui se pose est de savoir comment la vésicule d’IL-2R est-elle initiée. Le regroupement local des protéines peut induire des changements de conformation de la membrane et créer une invagination. Sachant que l'IL-2R s'accumule à la base des protubérances membranaires avant d’initier sa vésicule d’endocytose, nous avons analysé si le regroupement des récepteurs pourrait favoriser son internalisation. Pour étudier l’importance du regroupement de l'IL-2R, nous avons généré une lignée lymphocytaire humaine éditée (CRISPR) pour exprimer GFP-IL-2Rᵧ. Nous avons ensuite analysé la stoechiométrie du récepteur au niveau de la membrane plasmique, par microscopie TIRF couplée à une méthode de suivi de GFP-IL-2Rᵧ en molécule unique et identifié des populations distinctes d’oligomérisation. L'IL-2Rᵧ semble atteindre la surface cellulaire sous forme d'oligomères pré-assemblés auxquels d'autres molécules sont ajoutées, atteignant ainsi une taille d'oligomérisation optimale qui est essentielle à son internalisation. La liaison de l'IL-2 favorise la formation de ces oligomères, compétents pour l’endocytose, ce qui souligne l'importance du regroupement des récepteurs dans l'internalisation EIC.De plus, nous avons constaté que la déplétion du cholestérol augmentait la proportion de gros oligomères, non compétents pour l’endocytose mais induisant une forte signalisation. La perturbation du réseau d'actine favorise également la formation de gros oligomères, mais cette fois en diminuant la signalisation de l’IL-2R. Ainsi, les deux facteurs régulent l'endocytose et la signalisation de l'IL-2R de manière distincte. Nos résultats apportent de nouvelles connaissances sur les mécanismes régulant la signalisation des récepteurs et l’EIC.

The plant plasma membrane is subjected to mechanical stress generated by the turgor pressure, the development of the adjacent tissues or external mechanical cues such as wind. Transmembrane proteins, called mechanosensitive channels, permeate ions through the membrane when activated by an increase in the membrane mechanical tension. These nanosensors of mechanical cues directly transduce changes in tension into electrical potential variation, rapidly triggering cell mechanotransduction signaling pathways. The activity of a native mechanosensitive channel permeating calcium was recently recorded at the plasma membrane of the model plant Arabidopsis thaliana with the patch-clamp technique. This mechanosensitive channel, which is dependent on the DEK1 protein, is still not identified and was called Rapid Mechanically Activated (RMA). In the context of this PhD, the dynamics of gating of the RMA mechanosensitive channel were characterised over time and pressure and an activation model was proposed. Moreover, mutant plants knocked-out for genes encoding putative calcium mechanosensitive channels (Piezo, OSCAs) were analysed in order to find out its molecular identity. In parallel, the involvement of RMA in mechanically-induced calcium signaling in roots was investigated using the calcium sensor R-GECO expressed in Arabidopsis seedlings. These seedlings were grown in microponic chips in such way that their root grew in a channel of controlled liquid medium and controlled flow. Roots were subjected either to osmotic shock or to squeezing and calcium signals were recorded. The link between the observations obtained at the molecular and the root scales is discussed in order to give an integrated view of the function of RMA mechanosensitive channel., A la membrane plasmique des cellules végétales se concentrent des contraintes mécaniques générées par la pression de turgescence, la croissance des tissus adjacents ou des stimulations extérieures comme celles produites par le vent. Certaines protéines membranaires comme les canaux mécanosensibles sont activés par ces contraintes mécaniques. Ces canaux ioniques sont des protéines transmembranaires qui forment un pore dont l'ouverture dépend de la tension mécanique dans la membrane. Ils assurent ainsi la transduction directe d'une stimulation mécanique en transport ionique, activant des voies de signalisation cellulaires permettant de répondre à ces contraintes. L'activité d'un canal mécanosensible perméant au calcium a récemment été mise en évidence à la membrane plasmique de la plante modèle Arabidopsis thaliana par la technique de patch clamp. Ce canal mécanosensible, dont l'activité dépend de la protéine DEK1, reste non identifié et a été nommé RMA (Rapid Mechanically Activated). Dans le cadre de cette thèse, l'activation de RMA a été analysée en fonction de la tension membranaire et du temps, ce qui a permis de proposer un modèle d'activation du canal. De plus, différents mutants ont été analysés (Piezo, OSCA) pour trouver l'identité moléculaire de RMA. En parallèle, la participation de RMA à la signalisation calcique a été étudiée par l'expression de la sonde calcique R-GECO dans des plantules d'Arabidopsis. Ces plantules ont été cultivées dans des chambres microfluidiques, de telle sorte que leur racine principale grandisse dans un canal dont on puisse contrôler la composition du milieu liquide et la vitesse du flux. Les racines ont été soumises à des chocs osmotiques ou à une pression et les signaux calciques déclenchés ont été enregistrés. Les observations recueillies aux échelles moléculaire et racinaire sont mises en relation afin de proposer une vue intégrée du fonctionnement du canal RMA.

Le traitement antiplaquettaire à l’aspirine (ASA) est moins efficace chez certains patients coronariens, ce qui augmente leur risque de développer une thrombose. Des taux sanguins élevés de médiateurs thrombo-inflammatoires, tels que le sCD40L, peuvent expliquer de telles variabilités. Nous avons émis l’hypothèse que, en présence de taux élevés de sCD40L, l’efficacité de l’ASA peut être réduite. Ainsi, nous avons viser à déterminer les effets de l’ASA sur la signalisation et l’agrégation des plaquettes en présence de sCD40L. Les effets de l'ASA sur les plaquettes humaines traitées par le sCD40L, en réponse à des concentrations sub-optimales de collagène ou de thrombine, ont été évalués sur l'agrégation, la sécrétion de thromboxane A2 (TxA2) et la phosphorylation de la p38- « Mitogen-activated protein kinase » (MAPK), le facteur nucléaire-κB (NF-κB), la kinase activée par le TGF-β 1 (TAK-1) et la chaîne légère de la myosine (MLC). Le sCD40L a significativement augmenté la sécrétion de TxA2 dans les plaquettes, en réponse à des doses sub-optimales de collagène et de thrombine, ce qui a été inversé par l'ASA. L'ASA n'a pas inhibé la phosphorylation de p38-MAPK, NF-KB, TAK-1, que ce soit avec une stimulation par le sCD40L seul ou en présence des agonistes plaquettaires. Cependant, Le sCD40L a potentialisé l'agrégation plaquettaire, un effet complètement inversé et partiellement réduit par l'ASA en réponse au collagène et à la thrombine, respectivement. Les effets de l'ASA sur les plaquettes traitées par le sCD40L et stimulées par le collagène étaient liés à l'inhibition du changement de forme des plaquettes et la phosphorylation de la MLC. L'ASA n'affecte pas la signalisation du sCD40L dans les plaquettes, mais empêche son effet sur la sécrétion de TXA2 et l'agrégation plaquettaire en réponse au collagène, via un mécanisme impliquant l'inhibition de la MLC. Le ciblage de l'axe sCD40L dans les plaquettes peut avoir un potentiel thérapeutique chez les patients, présentant des taux élevés de sCD40L, qui ne répondent pas ou moins à l'ASA., Antiplatelet therapy with Aspirin (ASA) is less efficient in some coronary patients, which increases their risk of developing thrombosis. Elevated blood levels of thrombo-inflammatory mediators, like sCD40L, may explain such variabilities. We hypothesized that in the presence of elevated levels of sCD40L, the efficacy of ASA may be reduced. Accordingly, this study was designed to determine the effects of ASA on sCD40L signalling and aggregation of platelets. The effects of ASA on sCD40L-treated human platelets, in response to suboptimal concentrations of collagen or thrombin, were assessed on aggregation, thromboxane A2 (TxA2) secretion, and phosphorylation of p38-MAPK, NF-κB, TGF-β-activated kinase 1 (TAK-1), and myosin light chain (MLC). sCD40L significantly elevated TxA2 secretion in platelets, in response to suboptimal doses of collagen and thrombin, which was reversed by ASA. ASA did not inhibit phosphorylation of p38-MAPK, NF-κB, TAK-1, either with sCD40L stimulation alone or with platelet agonists. However, sCD40L potentiated platelet aggregation, an effect completely reversed and partially reduced by ASA in response to collagen and thrombin, respectively. The effects of ASA in sCD40L-treated platelets with collagen were related to inhibition of platelet shape change and MLC phosphorylation. ASA does not affect platelet sCD40L signalling, but prevents its effect on TXA2 secretion and platelet aggregation in response to collagen, via a mechanism implying inhibition of MLC. Targeting sCD40L axis in platelets may have therapeutic potential in patients with elevated levels of sCD40L that are none or less responding to ASA.

Idiopathic nephrotic syndrome (INS) is a podocytopathy of presumable immune origin and poorly understood pathogenesis. Our team has identified a gene (CMIP) whose expression is associated with certain forms of INS. The main objective of my thesis is to better understand the pathophysiology of INS by using proteomic approaches. After optimizing the FASP method to improve sensitivity, we studied the proteome of T-cells overexpressing CMIP. The results show, among other effects, the link between CMIP expression and T-cell cytoskeleton disorganization. As CMIP can locate in membrane rafts, we developed a very sensitive method for raft protein analysis by mass spectrometry. We observed the impact of CMIP on raft-mediated signaling in T-cells via altered recruitment of proteins in these microdomains. We also explored the proximal signaling in podocytes exposed to plasma from SNI patients. By studying the raftome and phosphoproteome of plasma-stimulated podocytes, we highlighted a deregulation of mTORC1, of autophagy, and a disorganization of the podocyte cytoskeleton. Finally, we analyzed plasma exchanges (both the soluble fraction and extracellular vesicles -EVs-) from post-transplant INS patients to identify proteins potentially involved in INS recurrence. We found in the EV fraction from SNI patients the differential presence of amino acid transporters, known to be involved in the mTOR pathway. We also observed a high presence of neutrophil degranulation proteins in both the soluble fraction and EV from these patients. In conclusion, my PhD work has highlighted the dysregulation of cytoskeleton organization in both T-cells and podocytes, as well as the implication of the mTOR pathway in INS pathogenesis in podocytes. The results of the study on post-transplant patient plasma open new perspectives on the potential involvement of neutrophils in the recurrence of the disease, Le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) est une podocytopathie d’origine immunitaire dont la pathogenèse n’est pas bien connue. Notre équipe a identifié un gène (CMIP) dont l’expression est associée à certaines formes de SNI. Le principal objectif de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie du SNI par des approches protéomiques. Après avoir optimisé la méthode FASP pour l’analyse des lymphocytes T (LT) afin d’améliorer la sensibilité de l’analyse protéomique, nous avons étudié le protéome total du LT en fonction de la présence de CMIP. Nous avons ainsi montré l’implication de CMIP dans la désorganisation du cytosquelette du LT. CMIP pouvant être localisée dans les rafts, nous avons alors développé une méthode très sensible permettant l’analyse de ces microdomaines par spectrométrie de masse afin d’évaluer l’impact de CMIP sur le raftome de LT obtenus à partir d’une souris. Nos résultats suggèrent un recrutement différent des protéines de signalisation des LT stimulés en fonction de la présence de CMIP. Nous avons également exploré la signalisation proximale podocytaire pour comprendre l’effet sur ces cellules du plasma des patients SNI. En étudiant le raftome et le phosphoprotéome des podocytes, nous avons observé une dérégulation de mTORC1, de l’autophagie et une désorganisation du cytosquelette podocytaire. Enfin, les échanges plasmatiques (la fraction soluble et les vésicules extracellulaires -EVs-) des patients SNI en récidive post-greffe ont été analysés, afin de mettre en évidence des biomarqueurs de la récidive. Nos expériences ont montré que les EVs des patients SNI présentent une augmentation des transporteurs d’acides aminés, impliqués dans la voie mTOR. De plus, nous observons une plus forte présence des protéines de la dégranulation du neutrophile chez ces patients. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence la désorganisation du cytosquelette au niveau des LT exprimant CMIP et des podocytes incubés en présence de plasma SNI, ainsi que l’implication de la voie mTOR dans les podocytes dans ce contexte. Les résultats issus de l'analyse du plasma des patients a permis d’ouvrir la voie à de nouvelles hypothèses sur l’implication des neutrophiles dans la récidive de la maladie

Breast cancer is the most diagnosed cancer in women and its progression is most often due to ovarian steroid hormones : estrogen and progesterone. Both hormones bind to their receptors : ERα and PR respectively, which are key drivers of tumor progression. To date, more than 75% of newly diagnosed breast tumors express ERα. A few years ago, an isoform of ERα : ERα36 was identified. ERα36 is a 36-kDa protein expressed independently of ERα, which has a high proliferative and metastatic potential in breast cancer. We studied its expression as well as its prognostic value in breast tumor sub-categories (PR-positive and PR-negative). Interestingly, the poor prognosis of ERα36 was found only in the PR-positive sub-category but not in the PR-negative subcategory, suggesting that ERα36 might interfere with PR signaling. For the first time, we identified a functional link between ERα36 and PR. Indeed, we have shown on the one hand that ERα36 interacts with PR in the cancer cell nucleus and on the other hand that ERα36 acts as a coregulator of the expression of PR target genes. In addition, ERα36 regulates the antiproliferative effect of progesterone; Le cancer du sein est le cancer le plus diagnostiqué chez la femme et sa progression se fait le plus souvent via les hormones stéroïdes ovariennes : les œstrogènes et la progestérone. Ces deux hormones vont se lier à leurs récepteurs respectifs : ERα et PR, qui sont des biomarqueurs clés de la progression tumorale. A ce jour, plus de 75% des tumeurs mammaires nouvellement diagnostiquées expriment ERα. Il y a quelques années, une isoforme d’ERα : ERα36 a été identifiée. ERα36 est une protéine de 36 kDa exprimée indépendamment d’ERα, et qui possède un fort potentiel prolifératif et métastatique dans le cancer du sein. Nous avons étudié son expression ainsi que sa valeur pronostique dans des sous-catégories tumorales mammaires (PR-positives et PR-négatives). De manière intéressante, le mauvais pronostic d’ERα36 était retrouvé uniquement dans la sous-catégorie PR-positive et non dans la sous-catégorie PR-négative, suggérant que ERα36 pourrait interférer avec la signalisation de PR. Pour la première fois, nous avons identifié un lien fonctionnel entre ERα36 et PR. En effet, nous avons montré d’une part que ERα36 interagit avec PR dans le noyau de cellules cancéreuses et d’autre part que ERα36 agit comme un corégulateur de l’expression de gènes cibles de PR. De plus, ERα36 régule l’effet antiprolifératif de la progestérone

Initialement découvert au cerveau, le Brain-derived neutrophic factor (BDNF) est un facteur de croissance dont les mécanismes de relâche et la signalisation ont été bien étudiés dans le système nerveux central. Il est aussi retrouvé en concentrations importantes dans la circulation où il est emmagasiné dans les plaquettes avec des niveaux pouvant atteindre 100 à 1000 fois ceux des neurones. Malgré l’abondance du BDNF dans les plaquettes, sa fonction dans la physiologie plaquettaire n’a jamais été étudiée. Le but de ce projet était donc d’investiguer le rôle du BDNF dans la fonction plaquettaire et les mécanismes de signalisation impliqués dans la réponse plaquettaire au BDNF. Lorsque les plaquettes sont isolées et re-suspendues dans un tampon physiologique dépourvu de protéines plasmatiques, le BDNF induit une agrégation plaquettaire complète et biphasique qui dépend des voies secondaires de l’agrégation. La neurotrophine NT4 ainsi qu’un anticorps activateur du récepteur TrkB ont tous les deux induit une agrégation plaquettaire similaire à celle du BDNF suggérant un récepteur commun, le TrkB. Par immunobuvardage, cytométrie en flux et microscopie électronique, nous avons pu confirmer que les plaquettes expriment une forme tronquée du récepteur TrkB, au niveau intracellulaire et à leur surface. Les tests fonctionnels nous ont mené à impliquer les voies de rhoGTPase Rac1, la protéine kinase C (PKC) et la voie phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt dans l’agrégation plaquettaire induite par le BDNF. Une fois activées par le BDNF, les plaquettes relâchent plusieurs cytokines proinflammatoires et proangiogéniques qui peuvent jouer un rôle important dans le maintien et la réparation de l’intégrité vasculaire. Parmi les agents relâchés, on retrouve des facteurs de croissances comme le PDGF et le VEGF, mais aussi des chimiokines comme l’IL8 et ENA-78. Finalement, lorsque les expériences d’agrégation ont été répétées en plasma riche en plaquettes, l’effet pro-agrégant du BDNF était perdu, possiblement via une liaison de BDNF avec la protéine plasmatique α2-macroglobuline (α2M). Cette liaison à α2M, suggérée par des expériences de co-immunoprécipitation, réduit la biodisponibilité du BDNF et pourrait aider à contenir la réponse plaquettaire au BDNF aux sites de lésions vasculaires., The Brain-Derived Neutrophic Factor (BDNF) is a growth factor that was initially discovered in the brain. BDNF has both an autocrine and a paracrine role in neurons and its release and signaling mechanisms have been extensively studied in the central nervous system. Surprisingly, large quantities of BDNF have been reported in circulation, where it is essentially stored in platelets with concentrations reaching 100-1000-fold those of neurons. Despite this abundance, the function of BDNF in platelet biology has not been explored. Thus, this project sought to investigate the effect of BDNF on platelet function and the mechanisms underlying platelet responses to BDNF. In washed platelets, BDNF induced complete biphasic platelet aggregation that in part relied on amplification from secondary mediators. The low-affinity agonist neurotrophin-4 and an activating antibody raised against the canonical BDNF receptor TrkB induced similar platelet responses, implicating TrkB. Platelets express, both at their surface and in their intracellular compartment, a truncated form of TrkB lacking a tyrosine kinase domain. The BDNF-induced aggregation of washed platelets was prevented by inhibitors of the Rac1, PKC, and PI3K/Akt. Platelets exposed to BDNF secreted pro-angiogenic and pro-inflammatory cytokines, which may play a role in maintaining vascular homeostasis. Finally, in platelet-rich plasma, exogenous BDNF failed to induce aggregation and BDNF immunoprecipitates contained α2-macroglobulin immunoreactivity. Hence, platelets are rich in BDNF, which induce platelet aggregation via TrkB activation. The restriction of BDNF bioavailablility by plasma protein binding may serve to target BDNF-mediated platelet activation to sites of vascular injury.

La force de la recherche fondamentale réside dans le transfert des découvertes à de réels problèmes humains, qu’ils soient médicaux, sociaux ou pratiques. Généralement, cette recherche débute par la compréhension de ce problème. L’humain a une capacité de guérison qu’on peut définir comme rapide, mais qui réside plus dans le rafistolage que dans la qualité de la guérison. Si la blessure en question est le moindrement grave, généralement, le corps humain est capable de guérir afin de maintenir l’organisme en vie, toutefois la fonction n’est pas toujours rétablie. Par exemple, dans le cas d’une amputation à un membre, la guérison va se faire par une cicatrice et former un moignon, rendant la partie amputée non fonctionnelle. Le laboratoire du Dr Roy étudie la régénération et la guérison sans cicatrice chez un modèle qui le fait de manière phénoménale, l’axolotl (Ambystoma mexicanum). Comprendre la signalisation qui permet à cet animal de régénérer parfaitement est une étape importante pour nous permettre de transférer ces découvertes à des traitements chez l’humain. Notre modèle de régulation des voies de signalisation dans le processus de régénération met la cytokine TGF-beta au cœur de notre recherche. Cette protéine est responsable de la formation du blastème, en permettant la migration et la prolifération suite à une amputation. Notre recherche a permis de montrer que lors de la première phase de la régénération, TGF-beta active SMAD2 et SMAD3, mais que le processus de guérison passe par SMAD2 puisque le niveau de SMAD3 est très faible. De plus, en bloquant uniquement SMAD3, la régénération s’opère normalement. L’importance de TGF-beta pour la formation du blastème est solidement démontrée. Par contre, son rôle pour la fermeture de plaie n’a pas encore été déterminé. La fonction de TGF-beta est associée à une multitude de processus dont celui des transitions épithéliales mésenchymateuses (EMT). Ce processus est caractérisé par des changements phénotypiques de cellules épithéliales leur permettant de migrer. Les EMTs s’opèrent lors du développement, de la progression du cancer et durant la guérison. Nous avons donc tenté de comprendre comment les EMTs pouvaient jouer un rôle dans la régénération de la patte et comment TGF-beta pouvait influencer la chose. Durant mon doctorat, nous avons déterminé que les EMTs étaient associées à la fermeture de la plaie, une étape indispensable à la régénération. De plus, leur régulation serait dépendante en partie de TGF-beta. La fermeture de la plaie serait dépendante de la voie TGF-beta/SMAD (connue comme la voie canonique) et de la voie TGF-beta/p38/JNK (une des voies non-canonique). Nous avons aussi montré que les voies p38 et JNK sont importantes pour la progression du blastème, et ce de manière indépendante de TGF-beta. Les résultats obtenus durant cette thèse nous permettent de mieux comprendre le processus de régénération parfaite., The strength of basic research lies in the ability to translate discoveries to real human problems, whether they are medical, social or practical. Generally, research begins with a problem that needs to be solved. Humans have a healing capacity that can be defined as rapid, but resides more in repairing promptly than in quality healing. If the injury in question is not life threatening, usually the human body is able to heal in order to keep the organism alive, but the function is not always restored. For example, in the case of an amputation the healing will be done by scar formation, and will form a stump rendering the amputated part non-functional. Our lab studies regeneration and scar-free healing in a model that does it phenomenally well, the axolotl (Ambystoma mexicanum). Understanding the signaling that allows this animal to regenerate perfectly may allow us to transfer these discoveries to treatments for humans. Our signaling regulatory model of the regeneration process puts the cytokine TGF-β at the heart of our research. This protein is responsible for blastema formation, by allowing migration and proliferation following the amputation. Our research has shown that during the first phase of regeneration, TGF-β activates SMAD2 and SMAD3, and that the healing process mainly goes through SMAD2, since the level of SMAD3 is very low. Also, by only blocking SMAD3, regeneration proceeds normally. The importance of TGF-β for the formation of the blastema is now very well demonstrated, however, its role in wound closure has not yet been determined. The function of TGF-β is associated with a multitude of processes including epithelial to mesenchymal transitions (EMT). This process is characterized by phenotypic changes of epithelial cells allowing them to migrate. EMTs occur during development, cancer progression and during wound healing. We therefore tried to understand how EMTs could play a role in the regeneration of the limb and how TGF-β could influence it. During my Ph.D., we determined that EMTs were associated with wound closure, an essential step to regeneration. In addition, their regulation is dependent in part on TGF-β. Wound closure is dependent of the TGF-β/SMAD pathway (known as the canonical pathway) and the TGF-β/p38/JNK pathway (one of the non-canonical pathways). Additionally, we showed that p38 and JNK are essential for blastema progression, and in this case, independently of TGF-. The results obtained during this thesis provide a better understanding of what signaling pathway allows perfect regeneration in axolotl.

Mouse blastocyst formation involves lumen formation and cell fate specification. While many studies have investigated how the blastocyst cell lineages are specified through genetics and signaling, studies into the potential role of the fluid lumen have yet to be conducted. We discover that blastocyst fluid emerges by secretion of cytoplasmic vesicles to intercellular space in addition to trans-epithelial flow. We observe that the beginning of epiblast and primitive endoderm spatial segregation directly follows lumen coalescence. Notably, we show that perturbing lumen expansion by pharmacological and biophysical means impair the specification and spatial segregation of primitive endoderm cells within the blastocyst. Combined, our results suggest that blastocyst lumen expansion plays a critical role in guiding cell fate specification and positioning. As epithelial tissues typically form lumina, lumen expansion may provide a general mechanism of cell fate control in many tissues.; La formation de blastocystes de souris implique la formation de lumière et la spécification du destin de cellules. Bien que de nombreuses études aient étudié la façon dont les lignées de cellules de blastocystes sont spécifiées par la génétique et la signalisation, des études sur le rôle potentiel de la lumière du fluide n’ont pas encore été menées. Nous découvrons que le liquide de blastocyste émerge par la sécrétion de vésicules cytoplasmiques dans l’espace intercellulaire en plus du flux trans épithélial. Nous observons que le début de la ségrégation spatiale des épiblastes et des endodermes primitifs suit directement la coalescence de la lumière. Nous montrons notamment que la perturbation de l’expansion de la lumière par des moyens pharmacologiques et biophysiques altère la spécification et la ségrégation spatiale des cellules d’endoderme primitives au sein du blastocyste. Ensemble, nos résultats suggèrent que l’expansion de la lumière du blastocyste joue un rôle critique dans la spécification et le positionnement du destin des cellules. Comme les tissus épithéliaux forment typiquement une lumière, l’expansion de la lumière peut fournir un mécanisme général de contrôle du destin cellulaire dans de nombreux tissus.

Mouse blastocyst formation involves lumen formation and cell fate specification. While many studies have investigated how the blastocyst cell lineages are specified through genetics and signaling, studies into the potential role of the fluid lumen have yet to be conducted. We discover that blastocyst fluid emerges by secretion of cytoplasmic vesicles to intercellular space in addition to trans-epithelial flow. We observe that the beginning of epiblast and primitive endoderm spatial segregation directly follows lumen coalescence. Notably, we show that perturbing lumen expansion by pharmacological and biophysical means impair the specification and spatial segregation of primitive endoderm cells within the blastocyst. Combined, our results suggest that blastocyst lumen expansion plays a critical role in guiding cell fate specification and positioning. As epithelial tissues typically form lumina, lumen expansion may provide a general mechanism of cell fate control in many tissues.; La formation de blastocystes de souris implique la formation de lumière et la spécification du destin de cellules. Bien que de nombreuses études aient étudié la façon dont les lignées de cellules de blastocystes sont spécifiées par la génétique et la signalisation, des études sur le rôle potentiel de la lumière du fluide n’ont pas encore été menées. Nous découvrons que le liquide de blastocyste émerge par la sécrétion de vésicules cytoplasmiques dans l’espace intercellulaire en plus du flux trans épithélial. Nous observons que le début de la ségrégation spatiale des épiblastes et des endodermes primitifs suit directement la coalescence de la lumière. Nous montrons notamment que la perturbation de l’expansion de la lumière par des moyens pharmacologiques et biophysiques altère la spécification et la ségrégation spatiale des cellules d’endoderme primitives au sein du blastocyste. Ensemble, nos résultats suggèrent que l’expansion de la lumière du blastocyste joue un rôle critique dans la spécification et le positionnement du destin des cellules. Comme les tissus épithéliaux forment typiquement une lumière, l’expansion de la lumière peut fournir un mécanisme général de contrôle du destin cellulaire dans de nombreux tissus.

International audience; Knowledge on G protein-coupled receptor (GPCRs) structure and mechanism of activation has profoundly evolved over the past years. The way drugs targeting this family of receptors are discovered and used has also changed. Ligands appear to bind a growing number of GPCRs in a competitive or allosteric manner to elicit balanced signaling or biased signaling (i.e., differential efficacy in activating or inhibiting selective signaling pathway(s) compared to the reference ligand). These novel concepts and developments transform our understanding of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor (FSHR) biology and the way it could be pharmacologically modulated in the future. The FSHR is expressed in somatic cells of the gonads and plays a major role in reproduction. When compared to classical GPCRs, the FSHR exhibits intrinsic peculiarities, such as a very large NH2-terminal extracellular domain that binds a naturally heterogeneous, large heterodimeric glycoprotein, namely FSH. Once activated, the FSHR couples to Gαs and, in some instances, to other Gα subunits. G protein-coupled receptor kinases and β-arrestins are also recruited to this receptor and account for its desensitization, trafficking, and intracellular signaling. Different classes of pharmacological tools capable of biasing FSHR signaling have been reported and open promising prospects both in basic research and for therapeutic applications. Here we provide an updated review of the most salient peculiarities of FSHR signaling and its selective modulation.

Les salamandres ont la capacité rare de parfaitement régénérer leurs membres suite à une amputation. Ceci en fait un excellent modèle pour comprendre comment recréer le phénomène chez les humains. Cependant, les mécanismes internes qui permettent la régénération sont encore peu connus. Un nombre limité de gènes a été étudié dans le contexte de la régénération et encore moins ont été le sujet d'analyses fonctionnelles. Les travaux présentés ici se concentrent sur la voie de signalisation canonique des Bmp. Nous démontrons que celle-ci est distincte de la voie de signalisation des Tgf-β. Nous observons que les Bmp, ainsi que plusieurs de leurs cibles potentielles sont exprimées durant la période de redéveloppement du blastème du membre en régénération. En utilisant l'inhibiteur pharmacologique LDN193189, nous explorons les conséquences de la perte de la signalisation canonique des Bmp. Les résultats morphologiques vont d'hypoplasies à l'absence complète de membre régénéré. En limitant les traitements à des périodes spécifiques, on tente de séparer temporellement les différents rôles des Bmp. Nous trouvons que la signalisation des Bmp est effectivement requise pour l'expression de plusieurs des gènes sélectionnés, mais seulement à des stades spécifiques. La signalisation des Bmp maintient l'expression des gènes Msx, qui sont requis pour la prolifération durant la phase de croissance du blastème. Elle est aussi requise pour l'induction de Fgf8 et Shh durant la formation initiale du patron de développement. Les gènes chondrogéniques dépendent également de la signalisation des Bmp, mais seulement aux stades plus tardifs. En traitant les axolotls avec le LDN193189 à différents temps durant la régénération, nous montrons également que la régénération du membre procède clairement du proximal vers le distal, allant à l'encontre d'une vision de la régénération qui persiste depuis 50 ans, c’est-à-dire l’intercalation. Nos résultats suggèrent également que le patron antéro-postérieur est déterminé durant une courte période de temps. Ceci démontre que les Bmp jouent un rôle majeur dans la formation de patron durant la régénération et que le processus est progressif comme durant le développement., Salamanders possess the rare ability to perfectly regenerate its limbs following amputation. This makes it a great model to understand how to bring the phenomenon closer to human use. However, the inner workings of regeneration remain largely unknown. A limited number of genes have been studied in this context and even fewer have been analyzed functionally. This work focuses on the roles of the canonical Bmp signaling pathway. We find that Bmps act distinctly from Tgf-β during limb regeneration. We also find that Bmps, and many of their potential targets are expressed throughout the redevelopment blastema phase of regeneration. By using the chemical inhibitor LDN193189, we explore the consequences of loss of canonical Bmp signaling in regeneration. This results in severe hypoplasia or complete absence of the regenerated limbs. By limiting treatments to specific timeframes, we try to separate the possible roles of Bmp temporally. We find that Bmp signaling is indeed required for the expression of selected target genes, but that requirement varies from one stages of regeneration to another. Bmp signaling maintains expression of Msx genes and is required for proliferation during the growth stage of the blastema. It is required for the induction of Fgf8 and Shh during the early pattern formation events. Chondrogenic genes are also dependent on Bmp signaling, but only at later stages. By administering LDN193189 treatments at different time points during regeneration, we clearly show that limb regeneration progresses in a proximal to distal fashion, going against an intercalary interpretation of regeneration that has lasted for 50 years. Our results also suggest that antero-posterior patterning is determined during a narrow period. This demonstrates that Bmps play a major role in patterning of regenerated limbs and that regeneration is a progressive process like development.

La mélatonine est une neurohormone produite principalement par la glande pinéale de manière circadienne et agissant par l’activation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appelés MT1 et MT2. La mélatonine régule de nombreuses fonctions physiologiques importantes. La régulation des niveaux de dopamine (DA) et de glucose en font partie mais nous ne savons pas clairement comment la mélatonine les régule. Les niveaux de DA extracellulaire sont principalement régulés par son transporteur (DAT) responsable de sa recapture dans les neurones présynaptiques afin de prévenir d’une hyperactivation des récepteurs dopaminergiques. Par conséquent, nous avons vérifié le rôle de DAT dans la régulation du système dopaminergique par le système mélatoninergique. Nous avons montré qu’en interagissant avec la forme immature non-glycosylée de DAT, MT1 et MT2 le retiennent dans le réticulum endoplasmique régulant ainsi son expression à la surface cellulaire et donc la recapture de la DA. De la même manière, les souris déficientes en MT1 ou MT2 ont montré une augmentation de la recapture de la DA dans les synaptosomes de striatum et une baisse de l’hypermotilité induite par l’amphétamine. Dans ce projet nous avons ainsi révélé un nouveau lien entre les systèmes mélatoninergiques et dopaminergiques basé sur la formation de complexes moléculaires entre les récepteurs de la mélatonine et DAT. Afin de mieux comprendre le rôle de la mélatonine dans la régulation des niveaux de glucose, nous avons ensuite étudié l’implication de variants génétiques de MT2 dans le développement du diabète de type 2 (DT2). Des études antérieures avaient montré que des variants naturels défectueux fonctionnellement étaient associés à un risque de développer le DT2. Afin de déterminer plus précisément les propriétés défectueuses en lien avec le DT2, nous avons mesuré l’activation spontanée et celle induite par la mélatonine de 40 variants MT2. Nous avons ainsi montré que des défauts d’activation des protéines Gαi et Gαz induite par la mélatonine et de recrutement spontané de la βarrestine-2 sont significativement reliés à un risque de développer le DT2. Les résultats expérimentaux corrélaient avec les prédictions de l’analyse sur le score d’évolution. Ce travail permettra de nouvelles avancées dans la recherche de traitements personnalisés pour les personnes portants les mutations sur MT2 afin qu’il retrouve une réponse non défectueuse. Le séquençage du gène codant pour MT1 chez 9393 personnes a permis l’identification de 32 variants naturels MT1. Le récepteur MT1 sauvage et les variants ont ainsi été caractérisés grâce aux techniques de transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET). Nous avons montré que MT1 active les protéines Gαi/o, Gα12 et Gα15 et recrute la βarrestine-2. L’analyse des résultats par factorisation matricielle non linéaire a révélé l’existence de 5 clusters caractérisés par différents profils de signalisation. La modélisation 3D par homologie de MT1 a permis de déterminer l’impact de chaque variant sur l’activation du récepteur et ses interactions avec les protéines G et la βarrestine-2. Ce projet a ainsi permis de démontrer que des variants naturels sont très intéressant afin de comprendre les mécanismes d’action des RCPGs. En résumé, ce travail contribue à la compréhension des fonctions des récepteurs à la mélatonine et souligne leur importance dans la régulation du système dopaminergique et de l’homéostasie glucidique. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives dans la recherche de nouveaux traitements personnalisés pour les patients souffrant d’un dérèglement du système dopaminergique ou de DT2., Melatonin is a neurohormone mainly released from the pineal gland in a circadian manner acting through two G protein-coupled receptors (GPCRs) called MT1 and MT2. Melatonin regulates many important physiological functions. Regulation of dopamine (DA) and glucose levels are two of them but how they do this is not clear. Extracellular DA levels are mainly regulated by its transporter (DAT) which mediates DA reuptake into presynaptic nerve termini to prevent DA receptor hyperactivation in the presynaptic cleft. Consequently, we verified the role of DAT in the regulation of the DA system by melatonin. We showed that MT1 and MT2, by interacting with the immature non-glycosylated form of DAT retain DAT in the endoplasmic reticulum thus regulating DAT cell surface expression and DA reuptake. Consistently, mice with targeted deletion of MT1 and MT2 show markedly enhanced DA uptake in striatal synaptosomes and decreased amphetamine-induced locomotor activity. Collectively, we revealed here a molecular link between the melatonin and DA systems, which is based on the formation of a molecular complex between melatonin receptors and DAT. To better understand the role of melatonin on the regulation of glucose levels, we studied the involvement of genetic variants of MT2 in the development of type 2 diabetes (T2D). Previous studies showed that natural loss-of-function variants of MT2 associate with T2D risk. To determine more precisely the defective properties linked to T2D risk we monitored spontaneous and melatonin-induced activation of different signaling pathways by 40 MT2 variants. We show that defects in melatonin-induced Gαi and Gαz activation and spontaneous βarrestin-2 recruitment are most significantly associated to T2D risk. Experimental results correlated well with those predicted by evolutionary lineage analysis. This work will help to propose personalized treatments for MT2 variant carriers to recover their defective responses. Sequencing of MT1 gene of 9393 individuals resulted in the identification of 32 natural MT1 variants. MT1 wild-type and variants were functionally characterized in bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays. We showed that MT1 activates Gαi/o, Gα12 and Gα15 proteins and recruits βarrestin-2. Analyzes of results by non-linear matrix factorization revealed the existence of 5 clusters characterized by different signaling profiles. Computational homology modeling of the 3D model of MT1 helped to determine the impact of each variant on receptor activation and interaction with G proteins and βarrestin-2. Collectively, our data illustrate that natural variants are powerful tools to understand the molecular basis of GPCR function. Overall, this work contributes to our understanding of the function of melatonin receptors and highlights their importance in the regulation of the DA system and glucose homeostasis. Our results will open new, personalized therapeutic options for patient suffering from a defective DA system or T2D.

Axon guidance receptors often bind several ligands, themselves mediating their effects via different receptors, which complexifies the understanding of functional outcomes downstream of each ligand-receptor couple. Likewise, during commissural axon navigation across the spinal cord midline in the floor plate (FP), PlexinA1 (PlxnA1) contributes as a receptor for two guidance cues, SlitC and Sema3B when complexed with Neuropilin2 (Nrp2). SlitN, produced with SlitC by full-length Slit processing bind other receptors, the Roundabouts (Robo1/2). To decipher the selective contributions of PlxnA1/SlitC signaling to the FP navigation, we generated a mouse strain baring PlxnA1 Y1815F mutation, previously found in vitro to abolish SlitC but not Sema3B responses. We found that this mutation selectively recapitulates one of the phenotypes of PlxnA1-/- embryos. This outcome is not triggered by specific spatial arrangement of SlitC in the FP, as using various fluorescent reporter tools we found SlitC has a pattern closely resembling that of SlitN, suggesting SlitC outcome might rather be set at the receptor levels. To get further insights, we explored the nature of the process requiring the Y1815 residue. Through imaging of pHLuo-tagged PlxnA1 receptor in various ex vivo paradigms and mass spectrometry analysis, we observed that Y1815 alters the surface dynamics of PlxnA1 and its network of interactions, revealing this is a crucial parameter for SlitC functions. More generally, our study provides the first dissection of ligand-specific outcomes of a guidance receptor during commissural axon navigation, Les récepteurs du guidage axonal sont souvent capables de lier plusieurs ligands, qui eux-mêmes agissent via différents récepteurs, ce qui complexifie la compréhension des impacts fonctionnels en aval de chaque couple ligand-récepteur. Au cours de la navigation des axones commissuraux à travers la ligne médiane de la moelle épinière dans la plaque du plancher (PP), PlexinA1 (PlxnA1) agit en tant que récepteur pour deux signaux de guidage, Sema3B quand il est complexé à Neuropilin2 (Nrp2) et SlitC indépendamment de Np2. SlitN, produit avec SlitC à la suite du clivage de Slit complet, se lie à d’autres récepteurs, les Roundabouts (Robo1/2). Pour déterminer les contributions spécifiques de la signalisation PlxnA1/SlitC dans la navigation de la PP, nous avons généré une lignée de souris qui possèdent la mutation Y1815F sur PlxnA1. Précédemment, il a été montré in vitro que cette mutation abroge la réponse à SlitC mais pas à Sema3B. Nous avons trouvé que cette mutation récapitule spécifiquement l’un des phénotypes des embryons PlxnA1-/-. Cette contribution n’est pas le résultat d’une distribution spatiale spécifique de SlitC dans la PP. En effet, en se servant de rapporteurs fluorescents variés, nous avons trouvé que le patron de SlitC ressemble étroitement à celui de SlitN, ce qui suggère que la contribution de SlitC provient de son récepteur. Pour approfondir, nous avons exploré la nature du processus nécessitant le résidu Y1815. En imageant PlxnA1 fusionné à la pHluo dans divers paradigmes ex vivo et en analysant les données de spectrométrie de masse, nous avons observé que Y1815 altère la dynamique de surface de PlxnA1 et son réseau d’interactions, révélant que c’est un paramètre crucial pour la fonction de SlitC. Plus généralement, notre étude fournit la première dissection de la contribution spécifique d’un couple ligand-récepteur de guidage au cours de la navigation des axones commissuraux

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Axon guidance receptors often bind several ligands, themselves mediating their effects via different receptors, which complexifies the understanding of functional outcomes downstream of each ligand-receptor couple. Likewise, during commissural axon navigation across the spinal cord midline in the floor plate (FP), PlexinA1 (PlxnA1) contributes as a receptor for two guidance cues, SlitC and Sema3B when complexed with Neuropilin2 (Nrp2). SlitN, produced with SlitC by full-length Slit processing bind other receptors, the Roundabouts (Robo1/2). To decipher the selective contributions of PlxnA1/SlitC signaling to the FP navigation, we generated a mouse strain baring PlxnA1 Y1815F mutation, previously found in vitro to abolish SlitC but not Sema3B responses. We found that this mutation selectively recapitulates one of the phenotypes of PlxnA1-/- embryos. This outcome is not triggered by specific spatial arrangement of SlitC in the FP, as using various fluorescent reporter tools we found SlitC has a pattern closely resembling that of SlitN, suggesting SlitC outcome might rather be set at the receptor levels. To get further insights, we explored the nature of the process requiring the Y1815 residue. Through imaging of pHLuo-tagged PlxnA1 receptor in various ex vivo paradigms and mass spectrometry analysis, we observed that Y1815 alters the surface dynamics of PlxnA1 and its network of interactions, revealing this is a crucial parameter for SlitC functions. More generally, our study provides the first dissection of ligand-specific outcomes of a guidance receptor during commissural axon navigation, Les récepteurs du guidage axonal sont souvent capables de lier plusieurs ligands, qui eux-mêmes agissent via différents récepteurs, ce qui complexifie la compréhension des impacts fonctionnels en aval de chaque couple ligand-récepteur. Au cours de la navigation des axones commissuraux à travers la ligne médiane de la moelle épinière dans la plaque du plancher (PP), PlexinA1 (PlxnA1) agit en tant que récepteur pour deux signaux de guidage, Sema3B quand il est complexé à Neuropilin2 (Nrp2) et SlitC indépendamment de Np2. SlitN, produit avec SlitC à la suite du clivage de Slit complet, se lie à d’autres récepteurs, les Roundabouts (Robo1/2). Pour déterminer les contributions spécifiques de la signalisation PlxnA1/SlitC dans la navigation de la PP, nous avons généré une lignée de souris qui possèdent la mutation Y1815F sur PlxnA1. Précédemment, il a été montré in vitro que cette mutation abroge la réponse à SlitC mais pas à Sema3B. Nous avons trouvé que cette mutation récapitule spécifiquement l’un des phénotypes des embryons PlxnA1-/-. Cette contribution n’est pas le résultat d’une distribution spatiale spécifique de SlitC dans la PP. En effet, en se servant de rapporteurs fluorescents variés, nous avons trouvé que le patron de SlitC ressemble étroitement à celui de SlitN, ce qui suggère que la contribution de SlitC provient de son récepteur. Pour approfondir, nous avons exploré la nature du processus nécessitant le résidu Y1815. En imageant PlxnA1 fusionné à la pHluo dans divers paradigmes ex vivo et en analysant les données de spectrométrie de masse, nous avons observé que Y1815 altère la dynamique de surface de PlxnA1 et son réseau d’interactions, révélant que c’est un paramètre crucial pour la fonction de SlitC. Plus généralement, notre étude fournit la première dissection de la contribution spécifique d’un couple ligand-récepteur de guidage au cours de la navigation des axones commissuraux