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Os sistemas endocanabinóide e colinérgico muscarínico têm um importante papel modulador sobre a atividade neural tanto excitatória, quanto inibitória no sistema nervoso central, participando de inúmeros processos, entre eles, os mecanismos de aprendizagem e memória. Partindo do fato de que os receptores canabinóides CB1 têm alta concentração em áreas relevantes para a memória, como o hipocampo (responsável pelo componente contextual), ou o córtex infralímbico (envolvido na manutenção da extinção), inicialmente investigamos os efeitos do potente agonista CB1, CP55,940 sobre a consolidação e a reconsolidação da memória: essa área cortical ainda não fora estudada nesta etapa do processamento de memórias, nem aquele fármaco havia sido adequadamente investigado. A seguir, visando compreender o possível sinergismo entre os sistemas endocanabinóide CB1 e colinérgico muscarínico M4 no processamento de memórias aversivas em ratos, estudamos os efeitos da infusão concomitante de concentrações subefetivas do agonista CB1 e da toxina muscarínica seletiva para M4 (MT3 - extraída da peçonha da serpente mamba verde africana), na área CA1 do hipocampo, sobre a consolidação da memória, verificando também seus efeitos sobre a plasticidade neural de ratos Wistar machos adultos. Os resultados do presente trabalho mostraram uma clara modulação endocanabinóide, tanto da consolidação quanto da reconsolidação da memória, envolvendo igualmente receptores CB1 no hipocampo e no córtex infralímbico: o efeito amnéstico duradouro foi diferente do obtido por nosso grupo usando a menos seletiva Anandamida em outra tarefa, aversiva inibitória (de Oliveira Alvares et al., 2008b): as diferenças farmacológicas e entre tarefas explicariam, em parte, esses achados contrastantes. Na segunda parte, onde estudamos o sinergismo apenas na consolidação, constatamos uma forte interação complementar dos subsistemas CB1 e M4 afetando a resposta comportamental, com efeito amnéstico observado apenas na presença dos dois fármacos juntos (CP55,940+MT3, cada qual em concentração subefetiva). A infusão concomitante de ambos, nessas mesmas concentrações, também foi capaz de inibir a indução e a manutenção da potenciação de longa duração (LTP) na mesma região CA1 hipocampal, reforçando a hipótese de que a semelhança farmacológica observada nos efeitos de cada subsistema, com agonistas ou antagonistas, em cada uma das diferentes fases da memória, sugere que cada subsistema atua como “sobressalente”, complementar ao outro. The endocannabinoid and muscarinic cholinergic systems play a pivotal role in the modulation of neural activity, both excitatory and inhibitory, in the central nervous system, taking part in numerous processes, among which are mechanisms of learning and memory. Based on the fact that cannabinoid receptors CB1 have high concentration in areas relevant to memory, such as the hippocampus (responsible for the contextual component), or the infralimbic cortex (involved in the maintenance of extinction), we initially investigated the effects of the potent CB1 agonist CP55,940 on the consolidation and reconsolidation of memory: neither has this cortical area been studied in this phase of memory processing nor has this drug been adequately investigated. In order to understand the possible synergism between the endocannabinoid CB1 and the muscarinic cholinergic M4 systems in the processing of aversive memories in rats, we studied the effects of the concomitant infusion of subthreshold concentrations of the CB1 agonist and the selective muscarinic toxin for M4 (MT3 – extracted from the venom of the African green mamba snake), in the CA1 region of the hippocampus, on the consolidation of memory, also verifying their effects on the neural plasticity of adult male Wistar rats. The results of the present study evidenced a clear endocannabinoid modulation, both in the consolidation and reconsolidation of memory, equally involving CB1 receptors in the hippocampus and infralimbic cortex: the long-lasting amestic effect differed from that obtained by our group using the less selective Anandamide in another behavioral experiment, the aversive inhibitory task (de Oliveira Alvares et al., 2008b): pharmacological differences and those between tasks would explain, in part, these contrasting results. In the second part, in which we studied the synergism only in consolidation, we found a strong complementary interaction between CB1 and M4 subsystems affecting the behavioral response, with an amestic effect only observed in the presence of both drugs together (CP55,940+MT3, each in a subthreshold concentration). The concomitant infusion of both, in these same concentrations, was also able to inhibit the induction and maintenance of long term potentiation (LTP) in the same CA1 region of the hippocampus, reinforcing the hypothesis that the pharmacological similarities observed in the effects of each subsystem, using agonists or antagonists, in each of the different memory phases, suggest that each subsystem acts as a “spare”, complementary to each other.

O sistema endocanabinóide tem um papel modulador sobre células excitatórias e inibitórias em diferentes áreas do sistema nervoso central (SNC), em particular naquelas envolvidas na formação, consolidação e evocação de novas memórias (Davies, Pertwee, and Riedel 2002). Os estudos mostram que a principal função dos endocanabinóides no encéfalo é a supressão da liberação de neurotransmissores como GABA e glutamato por meio da sinalização mediante mensageiros retrógrados (Fattore, Fadda, and Fratta 2007; Iversen 2003). O receptor canabinóides tipo 1 (CB1) apresenta uma alta densidade na área CA1 do hipocampo (Ashton et al. 2004; Hoffman, Riegel, and Lupica 2003). Poucos estudos têm sido realizados estudando o efeito da inibição do sistema endocanabinóide na evocação de memórias aversivas, e pouco se sabe acerca de seu efeito na evocação de memórias previamente extintas. Neste trabalho, investigamos o curso temporal dos efeitos do agonista inverso seletivo para o receptor CB1, AM251, sobre a evocação de memórias aversivas de longo prazo formadas ou extintas recente ou remotamente, bem como investigaremos os mecanismos subjacentes a eles. Assim, ratos Wistar foram treinados no condicionamento aversivo ao contexto (CAC), e alguns foram submetidos à extinção da memória e testados em três momentos diferentes. O AM251 CB1 foi administrado sempre 15 minutos antes do teste. Nossos resultados demonstraram diferentes efeitos dependentes do tempo do AM251 na evocação da memória. A infusão intra-hipocampal do AM251 antes de sessão de teste melhorou a evocação da memória de medo quando foi testada 72 horas após a sessão de treino, enquanto que a mesma dose de AM251 prejudicou a evocação da memória quando foi testada 15 dias após a sessão de treino. É importante ressaltar que quando o teste foi 30 dias após a sessão de treino o AM251 melhorou a evocação da memória. Também encontramos que quando a memória foi testada 24 horas após a sessão de extinção, o AM251 bloqueou a evocação da memória de extinção, mas, quando a sessão de extinção foi realizada 14 ou 30 dias após a sessão de treino e testada 24 horas depois, o AM251 não teve efeito. Desta forma, o efeito farmacológico da AM251 pode mudar com a extinção da memória e seu efeito é dependente do tempo. Acredita-se que o efeito oposto do AM251 sobre a evocação da memória, em diferentes momentos no tempo, é o resultado de alterações na expressão e localização do receptor CB1 em neurónios excitatórios piramidais, em interneurônios GABAérgicos ou em ambos os sistemas na região CA1 do hipocampo. Estudos de imunoistoquímica estão sendo realizados para avaliar as mudanças no número e localização dos receptores canabinóides CB1 em memórias recentes e remotas e assim fornecer uma explicação aos efeitos contraditórios na evocação da memória observados neste trabalho. Extensive evidence indicates that the endocannabinoid system plays a modulatory role on excitatory and inhibitory neural activity in central and peripheral nervous system. The CB1 cannabinoid receptors have a high concentration in important areas related to memory modulation, such as the hippocampus-responsible for the contextual component, and infralimbic cortex-involved in the maintenance of extinction. Few studies have been conducted studying the effect of inhibition of the endocannabinoid system in the recall of aversive memories, and little is known about its effect on retrieval of memories previously extinct. Here we have studied the effects of microinfusion of the CB1 receptor antagonist AM251 into the dorsal hippocampus upon the retrieval process of an aversive memory. Accordingly, Wistar rats were trained in contextual fear conditioning (CFC), in some experiments underwent memory extinction and were tested at 3 different time points. The CB1 antagonist AM251 was administered 15 minutes prior to the retrieval session. Our results showed different time-dependent effects of the AM251 on memory retrieval. Intra-hippocampal infusions of AM251 shortly before testing session improved retrieval of contextual fear memory when it was tested 72 hours after training, whereas the same dose of AM251 impaired retrieval of the memory when it was tested 15 days after training session. Importantly, when the testing session was 30 days after the training session, the AM251 improved the retrieval of the memory. We also found that, when memory was tested 24 hours after the extinction session, the AM251 blocked the retrieval of the extinction memory, but when the extinction session was performed 14 or 30 days after the training session and tested 24 hours later, the AM251 had no effect. Thus, the pharmacological effect of AM251 can change with the extinction of memory and its effect is time dependent. It is believed that the opposite effect of AM251 on memory retrieval at different moments in time, are the result of changes in the expression and localization of the CB1 receptor in excitatory pyramidal neurons, GABAergic interneurons or both systems in the CA1 region of the hippocampus. Immunohistochemistry studies are being done to evaluate the changes in the number and location of CB1 cannabinoid receptors in different moments in time to provide an explanation for the contradictory effects observed on memory retrieval.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Os receptores canabinóides CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias. Estudos recentes mostram o importante papel do sistema endocanabinóide hipocampal sobre a consolidação e evocação de memórias emocionalmente relevantes ou que envolvam algum grau de aversividade. Na primeira parte desta tese, estudamos os efeitos da administração intra-hipocampal de AM251, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou anandamida, um agonista canabinóide endógeno, sobre as fases da reconsolidação e extinção da memória na tarefa do condicionamento aversivo contextual. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 facilitou a reconsolidação, porém inibiu a extinção. A anandamida inibiu a reconsolidação da memória e facilitou a extinção, e esses efeitos foram revertidos pela co-administração de uma dose subefetiva de AM251, mostrando que os efeitos são mediados pelos receptores CB1. Na segunda parte do trabalho, investigamos os mecanismos por trás do envolvimento do sistema endocanabinóide hipocampal sobre memórias emocionais/aversivas. Foram desenvolvidos dois protocolos com diferentes níveis de aversividade. O antagonista CB1 AM251 inibiu a consolidação da memória no protocolo de alta aversividade (choque forte), mas não no de baixa aversividade (choque fraco). Em seguida, os animais foram submetidos a uma sessão de estresse para mimetizar um aprendizado aversivo e então, treinamos no protocolo fraco. A infusão de AM251 inibiu a consolidação da memória nessas condições. O experimento seguinte avaliou se os glicocorticóides liberados durante o estresse ou num aprendizado com forte conteúdo emocional é o fator determinante para a ativação do sistema endocanabinóide no hipocampo. O AM251 inibiu a consolidação da memória quando os animais eram tratados com o glicocorticóide sintético dexametasona imediatamente antes do treino com choque fraco. Por fim, avaliamos se o local de ação dos glicocorticóides era o hipocampo. A administração intra-hipocampal de dexametasona não produziu efeito sobre a consolidação, sugerindo que a modulação dos glicocorticóides ocorre de maneira indireta. Esses resultados mostram que existe uma interação sinérgica entre o sistema canabinóide e glicocorticóide sobre a modulação da memória. CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes. Experimental evidence suggests an important role of the endocannabinoid system (ECS) in aversively-motivated memories. Similarly, Glucocorticoids (GC) released in response to stress exposure also modulates memory formation, and both stress and dexamethasone activate the ECS. The scope of the first part is to investigate the potential role of the hippocampal endocannabinoid system on reconsolidation and extinction. Bilateral infusion of CB1 antagonist AM251 into the dorsal hippocampus after memory reactivation facilitated the reconsolidation of the contextual fear conditioning memory. In contrast, the local infusion in CA1 with anandamide blocked memory reconsolidation, an effect that was antagonized after the combined administration of anandamide with a CB1 antagonist, supporting a role of the hippocampal endocabinnoid system in the modulation of the reconsolidation. Local infusion with AM251 into CA1 blocked memory extinction whereas the administration of ananadamide facilitated memory extinction. However, when combined with a subthreshold dose of the antagonist the extinction remain unaffected. Our results demonstrated a modulatory role of the hippocampal endocannabinoid system in both processes after retrieval: reconsolidation and extinction In the second part, we investigated the interaction between the ECS and GCs in the hippocampus in the modulation of fear memory consolidation. Two protocols with different shock intensities were used in order to control the level of aversiveness. Local infusion of AM251 into the CA1 immediately after training was amnestic in the strong, but not in the weak protocol. Moreover, AM251 was amnestic in animals stressed prior to the weak protocol, reverting the stress-induced facilitating effect. In order to investigate if the stress effect was mediated by glucocorticoid, we performed dexamethasone injection before training. Intrahippocampal AM251 infusion reduced memory in these animals. Finally, we investigated if glucocorticoid action site was in hippocampus. Dexamethasone infused directly in CA1 was not able to mimic the systemic injection effect, suggesting an indirect GC modulation. In conclusion, ECS and GC seem to interact in a synergic way in order to modulate memory consolidation.

Os receptores canabinóides do tipo CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias e local onde o fenômeno eletrofisiológico da potenciação de longa duração (LTP) tem sido mais extensamente estudado. Neste trabalho, estudamos os efeitos da administração intrahipocampal de AM152, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou da Anandamida, um agonista canabinóide endógeno, (a) sobre as etapas de aquisição, consolidação e evocação da memória, e (b) sobre a indução da LTP. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 prejudicou a consolidação, porém facilitou a evocação da memória; foi, também, capaz de inibir a indução da LTP. Já o endocanabinóide anandamida facilitou a consolidação da memória. As evidências sustentam um claro envolvimento do sistema CB1 endógeno na modulação dos processos plásticos subjacentes ao processamento do aprendizado e da memória. CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes and extensively studied in LTP experiments. Here, we have studied the effect of the dorsal hippocampus infusion of the selective CB1 receptor antagonist AM251, or the endogenous cannabinoid anandamide, (a) upon the memory acquisition, consolidation and retrieval of the step-down inhibitory avoidance task in rats, and (b) upon LTP induction. Our results show that AM251 has caused a memory consolidation deficit, but a retrieval facilitation; it has also blocked the LTP induction. The endocannabinoid anandamide, otherwise, has caused a facilitation of the consolidation. Our evidence support a clear role for the CB1 endogenous cannabinoid system in the modulation of plastic events underlying the learning and memory processes.