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Resumo:O presente estudo avaliou isolados de Streptococcus mutans e leveduras do gênero Candida quanto à capacidade de formação de biofilme in vitro, perfil molecular e a interação destes micro-organismos procedentes de saliva e biofilme dental de crianças com diferentes históricos da doença cárie. A partir de amostras de saliva e biofilme de 38 crianças, foram obtidos 83 isolados de S. mutans e 31 leveduras do gênero Candida, verificando-se 12 (31,5%) indivíduos multicolonizados. Os isolados de Candida spp. foram caracterizados quanto à formação de biofilme, assim como, analisados quanto à região parcial do gene D1/D2, ITS1-5,8S-ITS2 do DNA ribossomal e avaliação do perfil genotípico pelo sistema ABC. Um total de 20 isolados de S. mutans foram selecionados, sendo 12 procedentes de crianças coinfectadas e 08 de crianças não coinfectadas. Estes foram caracterizados, quanto a formação de biofilme in vitro e pelo sequenciamento parcial dos genes HtrA e GtfB. De acordo com os resultados verificou-se entre as linhagens de Candida analisadas que 26 pertenciam à espécie C. albicans (83,8%) e 05 identificadas como Candida não-albicans (16,12%), entre essas, 03 de C. tropicalis (9,6%), 01 C. glabrata (3,2%) e 01 de C. guilliermondii (3,2%). Todas as crianças coinfectadas eram colonizadas com pelo menos uma linhagem de C. albicans, entre as quais foram detectados os genótipos A e B, sendo que o genótipo A foi mais frequente nas crianças com histórico de cárie, ocorrendo em 77% delas, enquanto que o genótipo B foi mais frequente nas crianças sem histórico da doença (87,5%). As espécies não-albicans, principalmente a C. tropicalis estavam associadas à microbiotas cariogênicas, sugerindo que essas espécies podem potencializar a virulência de Streptococcus mutans, aumentando potencialmente o risco da doença. Ambos os micro-organismos avaliados apresentaram variação na concentração de células aderidas durante a formação do biofilme in vitro. Entretanto verificou-se uma variação maior da capacidade de formação de biofilme in vitro entre os isolados de S. mutans procedentes de crianças coinfectadas em relação ao grupo de isolados procedentes de crianças não coinfectadas. Os isolados de S. mutans geneticamente diferentes variavam quanto ao padrão fenotípico da aderência, apresentaram diversidade a qual pôde ser correlacionada ao histórico da doença cárie e padrão de aderência in vitro. Além disso, verificou-se que o padrão de aderência pode ser modificado em função da associação com as leveduras do gênero Candida. As imagens pela técnica de microscopia de fluorescência confocal e por microscopia eletrônica de varredura (MEV) confirmaram a maior expressão de exopolissararídeos na matriz do biofilme formado pela associação de S. mutans com C. albicans confirmando a potencialização da virulência de S. mutans nos biofilmes associados com os dois micro-organismos. A multicolonização, genótipos e distribuição das espécies de Candida encontradas parecem ter uma relação expressiva com o desenvolvimento da cárie dental, sendo que, indivíduos colonizados pela espécie C. tropicalis apresentaram maior incidência da doença. Palavras-chave: Biofilme. Candida albicans. Streptococcus mutans.

Os estreptococos B-hemoliticos do grupo A (Streptococcus pyogenes) causam varias doencas humanas e estao associados com febre reumatica e glomerulonefrite pos-estreptococica. A sorotipagem dos antigenos M e T tem sido a maneira mais comum de tipagem destes patogenos, entretanto, para alguns isolados a tipagem por este metodo nao e satisfatoria, pois cerca de 15 a 40% dos isolados nao sao tipaveis. Alem disso, estes metodos de sorotipagem nao sao eficientes para diferenciacao clonal em estudos epidemiologicos. Marcadores moleculares sao ferramentas importantes capazes de diferenciar sorotipos de estreptococos do grupo A, provendo informacoes na elucidacao de surtos epidemiologicos e diagnostico. Marcadores RAPD foram utilizados para detectar polimorfismos em isolados de S. pyogenes de um surto de faringotonsilite estreptococica ocorrido em uma industria alimenticia, em marco de 2004 na cidade de Curitiba - PR. Foram utilizados 26 isolados do surto, 11 isolados desta especie, nao relacionados com o surto, duas linhagens referencias de sorotipo nefritogenico e uma de sorotipo reumatogenico. Foi observada variabilidade genetica entre os isolados de S. pyogenes do surto. A analise de gcluster h utilizando-se o coeficiente de Jaccard, mostrou dois grupos de isolados sem relacao clonal entre si, sugerindo a circulacao de dois sorotipos na industria alimenticia. Os resultados sugerem que o surto foi causado por sorotipo nefritogenico, com possibilidade de ter sido o sorotipo M4. A utilizacao de mais linhagens referencias nefritogenicas e reumatogenicas e a sorotipagem da proteina M possibilitariam a identificacao dos sorotipos causadores do surto de glomerulonefrite estreptococica na industria alimenticia, em Curitiba-PR, naquela ocasiao.

Resumo: Os fungos negros constituem um grupo grande e heterogêneo cuja principal característica é a pigmentação escura (melanina) na parede celular das células vegetativas e reprodutivas. Estes fungos são encontrados na natureza, principalmente no solo e matéria orgânica em decomposição. Entre as infecções causadas por estes fungos, inclui-se micetomas eumicóticos, feohifomicose e cromoblastomicose. Recentemente uma doença emergente conhecida como doença do caranguejo letárgico (DCL), causada por um fungo negro, uma espécie de Exophiala sp (CBS 120420), está causando maciças mortalidades nas populações de caranguejo-uçá (Ucides cordatus) no Brasil. Enquanto, Cladophialophora sp detectada, algumas vezes, em caranguejos doentes, é considerada uma espécie oportunista. Caranguejos afetados para DCL apresentam letargia e controle motor reduzido. Amostras de fungos negros foram isolados de microhabitats distintos de regiões de manguezais expostos à mortalidades pela DCL (áreas do estado da Bahia) na procura pelas espécies associadas na doença. Marcadores moleculares específicos, Salm F5 e Salm R3 e Clado F2 e Clado R2, foram utilizados para identificar o fungo causador da DCL, Exophiala sp, e o fungo oportunista Cladophialophora sp, respectivamente. Todos os isolados de fungos negros (119) resultaram em reações negativas para o marcador molecular para o fungo causador DCL. Entretanto, 10 isolados resultaram reações positivas para o marcador molecular para o fungo oportunista, Cladophialophora sp. Essas amostras positivas foram isoladas de folhas da árvore (Canavieiras-controle e Acupi-fazenda), galho (Canavieiras controle e Acupi-fazenda) e raiz aérea (Canavieiras controle). Todas as amostras mostraram compatibilidade com a micromorfologia de Cladophialophora sp. Sequências ITS desses isolados positivos mostraram similaridade nucleotídica com linhagens depositadas no Genbank, as quais foram obtidas de solo da cidade de Colombo (Paraná-Brasil) e de doença disseminada ocorrida nos EUA. O resultado rejeita a hipótese que a proximidade de fazendas de carcinocultura pode aumentar a possibilidade de surtos de DCL em populações de caranguejo nos manguezais

Resumo: Os fungos dematiáceos constituem um grupo grande e heterogêneo, caracterizados por possuírem um pigmento escuro, dihidroxinaftaleno melanina-DHN, na parede celular de suas células. Na natureza são encontrados principalmente na microbiota do solo e de matéria orgânica em decomposição, distribuindo-se em regiões de clima tropical e subtropical. Muitos deles são sapróbios de crescimento rápido, entretanto há uma parcela patogênica em hospedeiros vertebrados que está reunida na famí ia Herpotrichiellaceae. Para este estudo foi utilizado o fungo dematiáceo da espécie Fonsecaea monophora, agente de cromoblastomicose, o qual pode causar infecção de forma disseminada em pacientes imunocomprometidos. Com o objetivo de obter, os glicoconjugados de parede celular, os exopolissacarídeos (EPS) e a biomassa das linhagens de origem clinica e ambiental de F. monophora (MMHC82 e F 5p4), respectivamente, realizou-se o cultivo nos meios Mínimo (MM) e Czapeck- Dox (CD). Os EPS foram avaliados quanto a sua composição monossacarídica nos diferentes meios de cultivo e como resultado desta composição, açúcares como manose, galactose e glucose foram encontrados como prevalentes. Os polissacarídeos da parede celular das duas linhagens também apresentaram açúcares como glicose, manose e galactose em sua composição. Quando as frações de parede foram submetidas a análise de metilação e de RMN, foi possível observar a presença de Galf (15) e (16) ligada, bem como na forma de terminal não redutor, devido a presença dos derivados per-O-metilados 2,3,6-Me3-Galf, 2,3,5- Me3-Galf e 2,3,5,6-Me4-Galf, respectivamente, em conjunto com os sinais em 108,4 e 106,0, indicando a presença de uma possível galactofuranana como polissacarídeo estrutural. Além de Galf, a mistura de polissacarídeos de parede também apresentou unidades de Glcp e Manp, sugerindo a presença de - e - glucanas e de -mananas, devido à presença dos sinais em 98,4 e 103,0, e 101,3, respectivamente. Baseado nos dados de metilação observou-se que as unidades de Glcp apresentaram-se principalmente 3-O-, 4-O- e 4,6-di-O-substituídas, enquanto que as unidades de Manp eram substituídas em O-4 e O-6, ou 2,4-, 4,6-, 2,6-, 3,6-di- O-substituídas, ou ainda ,3,6-tri-O-substituídas. Na análise quimiométrica os resultados de 1H RMN corroboraram com os dados de metilação, onde observou-se que a linhagem MMHC82 de F. monophora em meio CD apresentou uma maior variação no perfil fisiológico relacionado aos carboidratos da parede celular. Os glicoconjugados foram utilizados como antígenos em ensaios imunológicos utilizando soros provenientes de pacientes portadores de cromoblastomicose. O antígeno, polissacarídeo pertencente à parede celular do fungo MMHC82 (patogênico), cultivado no meio MM, foi o que obteve melhor resposta antigênica. A distribuição destas espécies na natureza e o conhecimento destes polissacarídeos e glicoconjugados de parede poderão contribuir para ampliar o entendimento e elucidação da patogênese deste fungo podendo auxiliar no diagnóstico e tratamento destas doenças.

Resumo: A bioprospecção de plantas medicinais e microrganismos endofíticos constitui uma atividade promissora na pesquisa e detecção de novos compostos com atividades biológicas de interesse na área da saúde e na área agronômica. Croton urucurana Baill (Euphobiaceae) é uma planta amplamente utilizada na medicina tradicional em países como Brasil, Paraguai e Uruguai. Entre as várias propriedades medicinais atribuídas à planta, destaca-se seu uso para tratar doenças de etiologia infecciosa. No presente trabalho foi avaliada a atividade antibacteriana e antifúngica de diferentes extratos de C. urucurana contra as bactérias gram positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Streptococcus mutans, bactérias gram negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra os fungos filamentosos Microsporum gypseum, Fonsecaea monophora e Guignardia citricarpa. Devido ao fato de que nos últimos anos vários trabalhos vêm demonstrando a importância dos microrganismos endofíticos de plantas medicinais como fontes de compostos bioativos, neste trabalho também se realizou a bioprospecção de fungos endofíticos isolados da planta. Avaliou-se o potencial antibacteriano e antifúngico como também a capacidade de produção de compostos bioativos em diferentes meios de cultura desses microrganismos. Em relação à atividade da planta, comparando a atividade antimicrobiana de extratos brutos da folha e casca do caule, este último demonstrou maior atividade. As bactérias mais sensíveis a esse extrato foram P. aeruginosa (CIM: 0,1 mg/mL) e S. aureus (CIM: 0,5 mg/mL). Nenhuma das frações demonstrou uma atividade maior que a do extrato bruto, devido provavelmente a atividade do extrato ser produzida por um sinergismo entre vários princípios ativos. Porém, notou-se que as frações mais polares foram as mais ativas. Para selecionar os fungos endofíticos com maior potencial antimicrobiano foi realizado o teste de antagonismo de 27 isolados endofíticos contra os fungos G. citricarpa e F. monophora. Também foi realizada uma triagem de atividade antibacteriana contra bactérias gram positivas e gramnegativas. Seis isolados foram selecionados para a produção de metabólitos em diferentes meios de cultura: meios líquidos, malte e milho, e meios sólidos arroz e milho. Os extratos obtidos apresentaram diferentes graus de atividade antimicrobiana. A análise dos extratos mais ativos da planta, através de cromatografia em camada delgada demonstrou a presença de metabólitos da classe dos polifenóis. Em relação aos extratos dos endofíticos, o perfil cromatográfico variou bastante em função do fungo e meio de cultura utilizado. O extrato do isolado endofítico FCU 055 Epicoccum sp cultivado em meio sólido milho demonstrou uma interessante atividade antimicrobiana contra G. citricarpa e P. aeruginosa.

Resumo: A armilariose, doença causada por fungos do gênero Armillaria, é conhecida em várias partes do mundo, provocando a mortalidade de culturas agrícolas e florestais. Na região Sul do Brasil, essa doença tem causado a morte de árvores, principalmente em plantios de pínus, e a espécie associada à doença ainda não foi identificada. Sendo assim, o presente trabalho visou caracterizar isolados de Armillaria coletados na região Sul do Brasil, por meio de marcadores morfológicos e moleculares (RAPD e sequenciamento de região ITS). Vinte e dois isolados de Armillaria sp. foram coletados de árvores doentes de pínus, pessegueiro e vassourinha-do-campo, nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Os isolados foram cultivados em meio sólido BDA (batata, dextrose e ágar), a 22ºC, no escuro. As observações de micromorfologia do micélio foram feitas através de microscopia de luz e eletrônica de varredura e demonstraram a presença de estruturas típicas do gênero. Os resultados do RAPD demonstraram haver ariabilidade entre os isolados. Os resultados das análises das sequências ITS demonstraram que os isolados procedentes da região Sul do Brasil formaram um único grupo filogenético, sugerindo se tratar de uma única espécie, a qual parece ser muito próxima das linhagens referências procedentes da Patagônia, as quais parecem se tratar da espécie A. montagnei, intimamente relacionada com a espécie A. luteobubalina.

Resumo: A pesquisa de compostos químicos biologicamente ativos para fins terapêuticos em plantas utilizadas na medicina popular e em seus microrganismos endofíticos tem enriquecido as opções terapêuticas com novos fármacos antinflamatórios, antimicrobianos, antitumorais, entre outros. Em busca de soluções para o avanço das bactérias multiresistentes o presente trabalho buscou a confirmação científica para o uso popular de Schinus terebenthifolius Raddi, aroeira, como atimicrobiano e ampliou o estudo buscando a relação desta atividade aos seus endófitos. Para isto foi avaliada a atividade antimicriobiana e a composição química do extrato metanólico bruto das folhas da planta, assim como suas frações. Paralelamente, foram isolados fungos filamentosos e actinomicetos endofíticos das folhas da mesma árvore, que foram confrontados com bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e levedura de interesse clínico e um fitopatógeno filamentoso para verificar o potencial de produção de compostos antimicrobianos por esses microrganismos. Os endófitos com este potencial foram selecionados para fermentação a fim de extrair seus metabólitos secundários ativos. Aqueles que apresentaram bons resultados também foram avaliados quimicamente e comparados com o extrato obtido diretamente das folhas da planta e suas frações. O extrato bruto metanólico das folhas de aroeira e suas frações de diclorometano:acetato de etila (1:1) e de acetato de etila foram ativos contra Staphylococcus aureus (ATCC 27213), Escherichia coli (ATCC 35219), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Candida albicans (ATCC 10231). Ainda, o extrato bruto da planta inibiu em mais de 40% o crescimento do fitopatógeno Guignardia citricarpa. Alguns dos compostos extraídos dos endófitos também apresentaram atividade contra pelo menos um dos microrganismos testados (Staphylococcus aureus - ATCC 27213, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853 e Candida albicans - ATCC 10231). Foram encontrados nove microrganismos endofíticos produtores de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana, entre eles foram identificados os gêneros Alternaria, Phomopsis, Penicillium e Streptomyces, um basideomiceto também apresentou a mesma propriedade. De acordo com a analíse química por cromatografia em camada delgada sugere-se que os metabólitos ativos da planta estejam relacionados com compostos fenólicos e/ou antraquinonas, enquanto a atividade antimicrobiana dos endófitos testados parece estar vinculada à produção de alcalóides, presente em todos os extratos ativos dos microrganismos. Dois extratos com atividade produzidos por endófitos também apresentaram antraquinonas e um terpenóides. Nas condições testadas não foi encontrada relação entre os compostos com atividade antimicrobiana extraídos das folhas de S. terebenthifolius Raddi com os extraídos dos fungos e actinomiceto isolados desta mesma planta. Entretanto, esta diversidade de vias metabólicas secundárias ressalta a importância da pesquisa destas duas fontes de metabólitos secundários biologicamente ativos.

O objetivo deste estudo foi investigar qualitativamente e quantitativamente, a capacidade de aderência de S. mutans e C. albicans isoladamente e associados. Foi realizado ensaio de aderência "in vitro" na superfície dentária, cuja análise foi feita por Microscopia Eletrônica de Varredura (M.E.V.). Para este ensaio de aderência, foram utilizados sistemas com dentes humanos em meio Gibbons e Nygaard, acrescidos dos inóculos C. albicans e S. mutans isoladamente e associados, incubados por 21 dias. Os isolados eram provenientes de amostras salivares de crianças coinfectadas e linhagens de referência ATCC dos dois microrganismos. A análise por meio de M.E.V. mostrou menor aderência de C. albicans do que S. mutans na superfície dentária quando inoculados isoladamente. Quando inoculados juntos no mesmo sistema, C. albicans apresentou aumento de aderência. Também houve favorecimento na aderência de S. mutans quando em associação com C. albicans, mostrando aumento de colonização pela utilização da superfície celular da levedura como suporte de aderência. Um segundo experimento foi desenvolvido buscando avaliar quantitativamente essa aderência, para tanto foi utilizado um sistema de aderência "in vitro" com uso de cortes de acrílico como corpos de prova, e como inóculos os isolados com comportamentos contrastantes do primeiro ensaio, sendo que os resultados confirmaram que durante a associação de C. albicans e S. mutans em meio rico em sacarose, houve potencialização da aderência de ambos, porém S. mutans demonstrou ser mais beneficiado nesta associação. Os dados obtidos pelos dois ensaios de aderência “in vitro” permitem sugerir que embora no meio bucal as interações microbianas sejam muito mais complexas, a presença dos dois microrganismos associados pode favorecer a aderência de ambos, e o conseqüente aumento de colonização por S. mutans pode ser considerado mais um fator relevante no aumento de risco à cárie