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[ES] Trichoderma comprende un amplio número de especies, de gran interés en el manejo de enfermedades de las plantas de cultivo y la industria. El amplio rango de estilos de vida de estas especies está respaldado por su diversidad de Metabolitos Secundarios (MSs). En este trabajo, se ha utilizado una combinación de enfoques de minería genómica y genómica comparativa generando una extensa visión sobre el potencial de biosíntesis de MSs en Trichoderma.

[ES]Trichoderma es un género de hongos filamentosos ampliamente estudiados y utilizados como agentes de control biológico en agricultura, debido a numerosos mecanismos de acción, dentro de los cuales destaca el micoparasistismo, la atibiosis, la competencia, la promoción del crecimiento vegetal, la mejora de la resistencia a estreses bióticos y la tolerancia frente a abióticos en las plantas. La colonización radicular por parte de Trichoderma se ve limitada únicamente a las capas más externas de la raíz, sin penetrar hasta el haz vascular. Hemos podido comprobar como el ácido salicílico (SA) juega un papel clave en la capacidad de la planta para limitar la colonización por parte del hongo, pues, en su ausencia, Trichoderma pasa de hongo beneficios oa potógeno, debido a una masiva colonización radicular. El gen Thkel1 de Trichoderma harzianum está implicado en la capacidad del hongo para tolerar estreses de carácter abiótico como la salinidad y el frío. La transformación de plantas de Arabidopsis thaliana con el gen supone un aumento en sU tolerancia frente a estreses abióticos y aumenta la resistencia frente a patógenos como Botrytis cinerea. Por otro lado, la transformación de la colza (Brassica napus) con el mismo gen supone un aumento en su capacidad germinativa, productividad, tolerancia frente a estreses abióticos y resistencia sistémica frente a Phoma lingam. A su vez, el gen Thkel1 juega un papel clave en la capacidad de colonización radicular por parte de Trichoderma en plantas de la familia Brassicaceae (crucíferas).

[ES]Tradicionalmente, las especies del género Trichoderma eran consideradas como hongos saprófitos del suelo, de vida libre, cuya habilidad para parasitar a hongos fitopatógenos dio lugar a su uso como agentes de control biológico. Posteriormente, han sido definidas como simbiontes oportunistas avirulentos de plantas por su capacidad de asociarse de manera íntima con las raíces vegetales y, como resultado, promover el crecimiento de los cultivos y estimular sus respuestas de defensa frente al estrés biótico generado tras el ataque de organismos fitopatógenos y plagas. Hoy en día, se han redefinido como simbiontes multifuncionales antiestrés debido a los múltiples efectos beneficiosos que le brindan a los cultivos. Sin embargo, apenas se conoce como se relacionan los mecanismos moleculares que subyacen tras la interacción Trichoderma-planta. Entender a nivel molecular que factores intervienen en dicha interacción es crucial para explotar las propiedades beneficiosas de ciertas especies de Trichoderma a nivel agrícola. Con el propósito de profundizar en los mecanismos moleculares implicados en la interacción Trichoderma-planta, se diseñó un microarray de alta densidad de oligonucleótidos para especies del género Trichoderma y se utilizó para analizar la respuesta transcriptómica de T. harzianum CECT 2413 durante la interacción con plantas de tomate. Mediante esta aproximación se identificaron diversos genes fúngicos potencialmente implicados en el establecimiento de la asociación simbiótica con la planta, muchos de los cuales no habían sido previamente relacionados con dicho proceso, incluyendo genes implicados en la biosíntesis de óxido nítrico, serotonina y melatonina, desintoxicación de compuestos tóxicos y xenobióticos, actividades micoparasíticas, desarrollo del micelio o aquellos asociados con la formación de estructuras de infección del tejido vegetal. Adicionalmente, se llevó a cabo una caracterización biológico-funcional de dos de estos genes (qid74 y asp1) mediante estrategias de sobreexpresión, silenciamiento y/o disrupción génica. El gen qid74 codifica para una proteína de pared celular rica en cisteína y se había relacionado previamente con la protección celular del micelio de T. harzianum CECT 2413 y con su adherencia a superficies hidrofóbicas. En el presente estudio se encontró que la expresión de qid74 durante las primeras horas de interacción con plantas de tomate es inducida por la pared celular vegetal. Además, se demostró que qid74 está implicado en la modificación del sistema radical vegetal y, consecuentemente, en el efecto biofertilizador de T. harzianum. El gen asp1 codifica para una aspartil-peptidasa extracelular. En el presente estudio se encontró que asp1 cumple un papel esencial en la respuesta antagonista que despliega T. harzianum CECT 2413 frente al hongo fitopatógeno R. solani y que su expresión durante las primeras horas de interacción con plantas de tomate es inducida como consecuencia del reconocimiento por parte del hongo de un sustrato potencialmente colonizable. Además, nuestros resultados sugirieron que la proteína ASP1 secretada por el hongo provoca en la planta respuestas de defensa a nivel local dirigidas a limitar la colonización del tejido vegetal durante el establecimiento de la asociación simbiótica.

[ES]Trichoderma es un genero de hongos con demostrado interes biotecnologico, siendo la aplicacion mas conocida la derivada de sus propiedades como agentes de control biologico en agricultura. No obstante, estos hongos tambien mantienen con las plantas una relacion mutualista, con probados ejemplos de como dicha relacion resulta beneficiosa para la planta, pero no tantos de los resultados positivos para Trichoderma, mas alla del valor del mucigel como nutriente y de las raices como sitio de colonizacion endofitica. En esta Tesis Doctoral, he querido abordar el estudio de los cambios transcriptomicos que se producen en tres cepas de Trichoderma, pertenecientes a especies acreditadas como agentes de biocontrol, durante su interaccion con plantas de tomate. Asi como los que se producen en una cepa de T. parareesei, una nueva especie descrita en Austria durante la realizacion de esta Tesis Doctoral, que esta muy alejada taxonomicamente de las anteriores, y cuyo potencial de biocontrol ha sido demostrado en nuestro laboratorio. Tambien he abordado, por medio de transformantes heterologos de T. harzianum que expresan el gen amdS, que codifica una amidasa de A. nidulans, el papel de este gen en fertilizacion, mediante el uso eficiente de nitrogeno, y en la transcripcion de genes relacionados con la modulacion de las respuestas de defensa y desarrollo de plantas de tomate tras haber sido colonizadas por Trichoderma.

[ES] Trichoderma brevicompactum es un hongo anamórfico descrito recientemente por Kraus y col. (2004) y, por tanto, es poco conocido. Sin embargo, dentro de las actividades biológicas descritas para esta especie destaca la antibiosis. En cuanto a la producción de metabolitos secundarios con actividad biológica en el clade Brevicompactum, se han descrito los trichotecenos como el harzianum A o la trichodermina. Estos trichotecenos se producen en la ruta biosintética de los terpeneos y su biosíntesis está regulada por factores genéticos y ambientales a nivel transcripcional. Se ha descrito que uno de los pasos críticos es la ciclación e isomerización de farnesil pirofosfato (FPP) a trichodieno (TDN), paso catalizado por la trichodieno sintasa, codificada por el gen tri5. A pesar que se han descrito genes similares de la ruta biosintética en Fusarium graminearum, es muy poco lo que se conoce de los genes de esta ruta en T. brevicompactum. La tesis doctoral está enfocada al aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen Tbtri5 en T. brevicompactum IBT40841. Se aisló el gen tri5 utilizando sondas obtenidas a partir de Fusarium, para hibridar con una genoteca de DNA genómico de T. brevicompactum. Posteriormente, se obtuvieron transformantes sobreexpresando el gen Tbtri5. Se realizó el análisis funcional de Tbtri5 tanto en la cepa silvestre IBT40841, como en tres transformantes seleccionados por su actividad antibiótica. Por Southern se determinó una única copia endógena de Tbtri5 y una sola inserción del cassette de expresión en los transformantes. Bajo diferentes condiciones de cultivo y mediante estudios de Real Time PCR, se determinó una mayor expresión del gen en presencia de glucosa, glicerol y H2O2 y una represión en presencia de agentes antioxidantes como ácido ferúlico o tirosol. A partir de extractos acetónicos de cultivos de la cepa silvestre (IBT40841) y de uno de los transformantes; se purificaron por HPLC tres metabolitos: trichodermina, tirosol e hidroxitirosol, siendo éstos mayormente producidos por el transformante. En ensayos de actividad antimicrobiana (CLSI), se demostró que la trichodermina es el metabolito con capacidad antibiótica. La trichodermina fue capaz de inhibir el crecimiento de patógenos de importancia clínica como Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, P. aeruginosa, S. aureus MRSA, E. faecalis vancomicina resistente y A. baumannii. Además, se determinó que la trichodermina posee actividad antitumoral (mecanismo citostático) frente a adenocarcinoma de mama (MCF-7), carcinoma de pulmón (A-549) y carcinoma hepatocelular (Hep-3B y Hep-G2). Los resultados de los ensayos antitumorales indican que la trichodermina tiene menor actividad antitumoral, pero, a su vez, menor citotoxicidad frente a la línea hepatocelular humana sana que el taxol (paclitaxel), un antitumoral utilizado en el tratamiento de tumores sólidos. Por tanto, los resultados indican una relación del gen Tbtri5 de T. brevicompactum con las actividades anteriormente descritas. Por otro lado, análisis de tamaños y secuencias de productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de T. brevicompactum IBT40841 y de T. arundinaceum IBT40837 correspondientes a genes y regiones intergénicas del cluster tri, indican que la disposición de los genes es coincidente en ambas especies del género Trichoderma pero difiere con la descrita para el cluster tri en especies del género Fusarium. Además, a diferencia de lo que ocurre en Fusarium, en las dos cepas de Trichoderma el gen Tbtri5 está situado fuera del cluster tri. Finalmente, la aplicación biotecnológica de T. brevicompactum podría residir en la explotación de las capacidades antimicrobiana y antitumorales de la trichodermina. Precisamente, a diferencia de otras especies del género Trichoderma, éstas capacidades invalidan a T. brevicompactum como agente de control biológico., [EN] Trichoderma is a fungus anamorphic brevicompactum recently described by Kraus et al. (2004) and, therefore, is little known. However, within the biological activities described for this species highlights the antibiosis. As for the production of secondary metabolites with biological activity in the clade brevicompactum, trichotecenos have been described as A or trichodermina harzianum. These trichotecenos occur in the biosynthetic pathway of terpeneos and its biosynthesis is regulated by genetic and environmental factors at the transcriptional level. It has been reported that one of the critical steps is the cyclization and isomerization of farnesyl pyrophosphate (FPP) to trichodieno (TDN), trichodieno step catalyzed by synthase, encoded by the gene tri5. Although similar genes have been described in the biosynthetic pathway in Fusarium graminearum, very little is known about the genes of this pathway in T. brevicompactum. The dissertation is focused on the isolation, characterization and functional analysis of the gene in T. Tbtri5 brevicompactum IBT40841. Tri5 gene was isolated using probes derived from Fusarium, to hybridize with a library of genomic DNA from T. brevicompactum. Subsequently, transformants were obtained by overexpressing the gene Tbtri5. We performed functional analysis of both Tbtri5 IBT40841 wild type, as in three transformants selected by their antibiotic activity. Southern was determined by a single copy endogenous Tbtri5 and a single insertion of expression cassette in the transformants. Under different culture conditions and by Real Time PCR studies, we found a greater expression of the gene in the presence of glucose, glycerol and H2O2 and repression in the presence of antioxidants such as ferulic acid and tyrosol. From acetone extracts of cultures of wild type (IBT40841) and one of the transformants, were purified by HPLC three metabolites: trichodermina, tyrosol and hydroxytyrosol, the latter being mostly produced by the transformant. In tests of antimicrobial activity (CLSI) demonstrated that the metabolite trichodermina antibiotic capacity. The trichodermina was able to inhibit the growth of clinically important pathogens such as Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, P. aeruginosa, S. aureus MRSA, E. A. faecalis and vancomycin-resistant baumannii. It was concluded that the trichodermina has antitumor activity (cytostatic mechanism) against breast adenocarcinoma (MCF-7), lung carcinoma (A-549) and hepatocellular carcinoma (Hep-3B and Hep-G2). The test results indicate that trichodermina tumor has lower antitumor activity, but, in turn, lower cytotoxicity against human hepatocellular line healthy Taxol (paclitaxel), an antitumor used in the treatment of solid tumors. Therefore, the results indicate a relationship between gene Tbtri5 T. brevicompactum with the above activities. On the other hand, size and sequence analysis of PCR products amplified from genomic DNA of T. brevicompactum IBT40841 and T. IBT40837 arundinaceum for genes and intergenic regions of the tri cluster indicate that the arrangement of genes is consistent in both species of the genus Trichoderma, but differs from the tri cluster described for Fusarium species. Moreover, unlike what happens in Fusarium, in the two strains of Trichoderma Tbtri5 gene cluster is located outside the tri. Finally, the biotechnological application of T. brevicompactum may lie in exploiting the capabilities of the antimicrobial and antitumor trichodermina. Indeed, unlike other species of Trichoderma, T. invalidate these capabilities brevicompactum biological control agent.