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El factor de inicio de traducción de eucariotas 5A (eIF5A) es una proteína esencial y conservada con funciones en las tres fases de la traducción. eIF5A está codificado por dos genes parálogos, TIF51A/TIF51B y EIF5A1/EIF5A2 en levadura y humanos respectivamente. eIF5A es la única proteína que contiene hipusina, una modificación esencial para su actividad, y se une a los ribosomas para facilitar la traducción de motivos con prolinas consecutivas o combinaciones de prolina con glicina y aminoácidos cargados. eIF5A participa en otras funciones y procesos como exporte de mRNAs nucleares, proliferación y apoptosis. Su asociación con enfermades como el cáncer es de interés. En esta tesis se han utilizado los organismos modelo Saccharomyces cerevisiae y Mus Musculus para adquirir conocimiento fundamental de las funciones de eIF5A. Se han identificado dos nuevas dianas de eIF5A para la traducción, una función básica nueva del factor y las bases moleculares de la regulación transcripcional de los dos genes de eIF5A. Nuestros resultados con levadura y células de mamífero demostraron que eIF5A hipusinado es necesario para la síntesis de colágeno I ya que la traducción se para en motivos colagénicos, enriquecidos en prolina y glicina, en deficiencia de eIF5A. Su inactivación redujo el contenido en colágeno I y produjo la retención de colágeno parcialmente sintetizado en el retículo endoplásmico y estrés. La sobreproducción de colágeno I células humanas hepáticas estrelladas tratadas con la citoquina profibrótica TGF-β1 dependía de eIF5A también. En cuanto a la regulación transcripcional de eIF5A, se determinó que la expresión génica de las dos isoformas respondía a las demandas energéticas y dependía de TORC1 y Hap1. En condiciones de respiración, Hap1 activaba TIF51A por unión directa y reprimía TIF51B indirectamente. Por el contrario, cuando la respiración era comprometida, Hap1 se convertía en un represor para inhibir la expresión de TIF51A e inducir TIF51B. Nuestros resultados demostraron el papel esencial de la isoforma Tif51A en la respiración mitocondrial. Se descubrió un nuevo mecanismo que conecta la actividad de eIF5A con las funciones mitocondriales. Se observó que eIF5A es necesario para la traducción de la región de prolinas de Tim50, una proteína esencial que reconoce proteínas mitocondriales y media su importe a la mitocondria. La inactivación de eIF5A inhibía el importe de proteínas y generaba la agregación de precursores y estrés. Finalmente, se reveló una nueva función de eIF5A en la regulación transcripcional de genes cuyos mRNAs lo requieren para la traducción. Nuestros resultados demostraron su unión a la cromatina y su inactivación aumentaba la transcripción de genes que codifican proteínas con motivos dependientes de eIF5A, sugiriendo un efecto transcripcional represor sobre sus dianas. Así, eIF5A no solo funciona en traducción sino también en el control de la síntesis de mRNA para mantener la homeostasis de proteína de sus dianas. The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is an essential, evolutionarily conserved protein with functions in the three stages of translation. eIF5A is codified by two paralog genes, TIF51A/TIF51B and EIF5A1/EIF5A2 in yeast and human respectively. eIF5A is the only known protein containing hypusine, an essential modification for its activity. eIF5A binds ribosomes to facilitate translation of motifs with consecutive prolines or combinations of proline with glycine and charged amino acids. eIF5A has been linked to other molecular functions and cellular processes such as nuclear mRNA export, proliferation and apoptosis. Its association with the pathogenesis of several diseases including cancer is of interest. In this thesis we have used Saccharomyces cerevisiae and Mus Musculus to gain fundamental knowledge on the functions of eIF5A. Here, we identified and characterized two novel targets requiring eIF5A for translation, a new basic function for the factor and the molecular bases of the transcriptional regulation of the two eIF5A genes. Our results in yeast and mammalian cells proved that hypusinated eIF5A is needed for synthesis of mammalian collagen I as translation stalls at collagenic motifs, enriched in proline and glycine, under eIF5A deficiency. eIF5A inactivation reduced collagen I and led to the retention of partially synthesized collagen I in the endoplasmic reticulum and to stress. The collagen I overproduction in human hepatic stellate cells treated with the profibrotic cytokine TGF-β1 was also dependent on eIF5A. The gene expression regulation of the two isoforms responded to the cellular energy demands and was found to be dependent on TORC1 and Hap1. Under respiratory conditions, Hap1 induced TIF51A through direct binding while indirectly repressed TIF51B. Conversely, when the respiration was compromised, Hap1 became a repressor to down-regulate TIF51A expression and up-regulate TIF51B. Our results demonstrated the essential role of the Tif51A isoform in the mitochondrial respiration. A novel mechanism connecting eIF5A activity with mitochondria functions was revealed. We showed that eIF5A is required for the translation of the proline-rich region of Tim50, an essential protein that specifically recognizes mitochondrial proteins and mediates their import into mitochondria. eIF5A inactivation inhibited mitochondrial protein import and caused precursors to aggregate and stress. Finally, a novel function of eIF5A was uncovered. eIF5A was found to participate in the transcriptional regulation of genes whose mRNAs require eIF5A for translation. Our findings proved the eIF5A binding to chromatin and its absence increases the transcription of specific genes encoding proteins with eIF5A-dependent motifs, suggesting a transcriptional repressor effect on its targets. Thus, our results indicated that eIF5A functions not only in translation but also in the control of mRNA synthesis to maintain protein homeostasis of its targets.

Candida albicans es el patógeno humano más prevalente. A pesar de ser un organismo comensal, también es un hongo oportunista que puede causar infecciones de seria gravedad en personas inmunodeprimidas. Aunque los principales factores de virulencia han sido caracterizados, el proceso exacto de patogénesis en Candida todavía se desconoce. Los mecanismos de adaptación a los distintos ambientes a los que se enfrenta durante la invasión del cuerpo humano todavía no están suficientemente caracterizados. En este trabajo se usaron análisis genómicos funcionales para el estudio de la respuesta global de C. albicans a dos estreses que encuentra durante la invasión del cuerpo humano: estrés oxidativo e hipóxico. En el análisis se encontraron varios genes implicados en la adaptación a estos estreses, lo cual se vio reflejado en la regulación de sus niveles de RNA mensajero y proteína. Un hallazgo interesante de este estudio fue que la regulación de los genes implicados en la respuesta a estrés oxidativo ocurre principalmente a nivel post-transcripcional. Para estudiar la posible implicación de RNAs no codificantes en la respuesta a estos estreses, se creó una aplicación web que permitió la detección de aquellos ncRNAs cuya expresión se vio alterada durante el estrés. Dos grupos de 154 y 159 nRNAs, incluyendo intergénicos y antisentido a ORFs, se identificaron como implicados en la respuesta a estrés hipóxico y oxidativo, respectivamente. Para el estudio de cambios en transcripción naciente durante estos estreses, la técnica de Genomic run-on (GRO), ya establecida para el estudio del nascentoma de Saccharomyces cerevisiae, se implementó para su uso en C. albicans en su versión más actualizada, el BioGROseq. La técnica de GRO fue después usada para el estudio de cambios en parámetros de estudio de la expresión génica a distintas temperaturas de crecimiento, tales como la densidad de RNApol II o la tasa de traducción, usando el organismo modelo S. cerevisiae como herramienta. Los resultados mostraron que la densidad de RNApol II disminuye con el incremento en la temperatura de crecimiento, y que esta disminución en densidad se compensa con un incremento en la velocidad de elongación de la RNApol II para mantener la homeostasis de los niveles de mRNA. Esta compensación está regulada a nivel de iniciación de la RNApol. Dentro del rango óptimo de temperaturas de crecimiento en S. cerevisiae (26-34 oC), tanto los niveles de RNA total como los de mRNA se mantienen en homeostasis, disminuyendo marcadamente a temperaturas inferiores o superiores. Finalmente, con el aumento en la temperatura de crecimiento se observó un aumento en la tasa de traducción. En general, los resultados presentados en este trabajo proporcionan nuevos hallazgos sobre los mecanismos de regulación que las levaduras utilizan para su crecimiento a distintas temperaturas, y ayudan a entender cómo C. albicans sobrevive durante su invasión en el cuerpo humano. Candida albicans is the most prevalent human fungal pathogen. Despite being a harmless commensal organism, it is also an opportunistic fungus which can cause life-threatening infections in immunocompromised people. Although major virulence factors have been characterized, the exact mechanism of Candida pathogenesis still remains unknown. Mechanisms of adaptation under the different environments it faces during body invasion are yet poorly characterized. In this thesis, functional genomic analyses were utilized to study the global response of C. albicans to two environmental insults it faces during invasion of the human body: oxidative and hypoxic stress. Several genes were found to be involved in the adaptation to these stresses, as reflected by the up or down regulation of their mRNA and protein products. Interestingly, the expression of the genes involved in the response to oxidative stress was found to be regulated mainly at the post-transcriptional level. To explore the possible implication of non-coding RNAs in the response to these stresses, an online web application was created to enable the detection of ncRNAs which levels change under stress conditions. Two groups of 154 and 159 ncRNAs, including intergenic and antisense to ORFs, were found to be involved in the responses to hypoxia and oxidative stress respectively. To study changes in nascent transcription under these stresses, Genomic run-on (GRO), a well-established technique used for the study of the nascentome in Saccharomyces cerevisiae, was implemented for its use in C. albicans in its most up-to-date version, BioGROseq. The GRO technique was later used for the study of changes in gene expression parameters at different growth temperatures, such as RNApol II density or translation rate, using the model yeast S. cerevisiae as a tool. The results showed that RNA pol II density decreases as growth temperature increases, and that this decrease in density is compensated with an increase in RNA pol II speed to maintain mRNA homeostatic levels, compensation that is regulated at the RNA pol II initiation level. Within the optimal range of growth temperatures in S. cerevisiae (26-34 oC) both total RNA and mRNA amounts were found to be kept at homeostatic levels, decreasing markedly at temperatures above and below. Finally, an increase in translation rate was observed with the increase in growth temperatures. Overall, the results presented in this thesis provide clues into the regulatory mechanisms that yeast utilize to grow at different temperatures and contribute to the understanding of how C. albicans thrives during infection of the human body.