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Die Anpassung des Transkriptoms an veränderte Nahrungsbedingungen ist ein grundlegender Prozess in Bakterien, ganz besonders in natürlichen Lebensräumen. Die bakterielle 6S RNA, ein universeller und wachstumsphasenabhängiger Transkriptionsregulator, bindet an die RNA Polymerase (RNAP) und verhindert die Transkription im stationären Wachstum. Nach erneuter Verfügbarkeit von Nährstoffen, fungiert die RNAP als RNAabhängige RNA polymerase und transkribiert große Mengen einer kurzen RNA (pRNA), wobei sie die 6S RNA als Templat benutzt. Dieser Vorgang führt zur Dissoziation des 6S RNA-RNAP Komplexes. Während in der Mehrheit der Bakterien nur eine einzelne 6S RNA exprimiert wird, gibt es zwei 6S RNAs in Bacillus subtilis (6S-1 und 6S-2), die zwar die gleiche Sekundärstruktur einnehmen, aber unterschiedliche Expressionsprofile haben. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir die beiden 6S RNAs aus B. subtilis untersucht, wobei ein Fokus auf der Synthese der pRNA und deren Funktion lag. Wir begannen unsere Untersuchungen mit zwei Ansätzen: Wir identifizierten zunächst Transkription von pRNA mit 6S-1 RNA als Templat in vivo durch Hochdurchsatz-Sequenzierung und entwickelten außerdem ein neues Northern-Hybridisierungsprotokoll, das es uns erlaubte, pRNAs in bakteriellen Extrakten zu detektieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Dissoziation der RNAP und 6S-1 RNA, dem funktionellen Homolog der gut untersuchten 6S RNA aus E. coli, durch stabile Bindung der pRNA reguliert wird. Wir fanden zusätzlich heraus, dass dieser Vorgang zu strukturellen Veränderungen in der 6S-1 RNA führt; ausgelöst durch Unterschiede in der Länge der pRNA in den verschiedenen Wachstumsphasen. Diese spezifische strukturelle Änderung der 6S RNA scheint außerdem ein Merkmal der 6S RNA in Bakterien generell zu sein. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Dissoziation der RNAP und der Abbau der 6S-1 RNA in vivo verknüpft sind. Zusammenfassend erweitern unsere Ergebnisse das momentane Verständnis der Funktion der 6S RNA und geben Einsicht in den Mechanismus der Dissoziation der RNAP von 6S RNA in Bakterien., Adaptation of the transcriptome to nutrient limitation and resupply is a fundamental process in bacteria, particularly in natural habitats. Bacterial 6S RNA, an ubiquitous and growth phasedependent regulator of transcription, binds to RNA polymerase (RNAP) and inhibits transcription during stationary growth. Upon nutrient resupply, RNAP acts as an RNA-dependent RNA polymerase by transcribing large amounts of short RNAs (pRNAs) from 6S RNA as template, leading to dissociation of 6S RNARNAP complexes. Whereas the majority of bacteria express a single 6S RNA species, Bacillus subtilis encodes two 6S RNAs (6S-1 and 6S-2) of similar secondary structure, but with different expression profiles. In this work, we investigated the two 6S RNAs of B. subtilis, focusing on pRNA synthesis and its role for the function of 6S RNA. Concurrently, we identified pRNA transcription from 6S-1 RNA in vivo using high-troughput sequencing techniques and we developed a novel Northern hybridization protocol for detection of pRNAs in bacterial total cellular extracts. Our results show that the release of RNAP from 6S-1 RNA, the functional homolog of the well investigated E. coli 6S RNA, is regulated by stable pRNA binding. Additionally, we found structural changes of 6S-1 RNA, induced by differences in pRNA length in different growth phases. This specific structural change of 6S RNA seems to be conserved among bacteria. Furthermore, we are able to show that the two processes of RNAP release and 6S-1 RNA degradation are coupled in vivo. Taken together, our results expand the current understanding of 6S RNA function and provide insight into the mechanism of RNAP release from 6S RNA in bacteria. iii

In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben., In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.

Die chloroplastidäre und mitochondriale Genexpression ist abhängig von einer großen Anzahl an RNA-Bindeproteinen (RBPs). Eine besonders abundante Familie sind die chloroplastidären Ribonukleoproteine (cpRNPs). Während Ziel-RNAs mehrerer cpRNPs und die Phänotypen entsprechender Mutanten beschrieben wurden, bleibt ihre molekulare Funktion weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit wurden Studien der cp29a Mutante durch genomweite Analysen erweitert. Diese legen nahe, dass die eigentliche Rolle von CP29A in phänotypisch erkennbarem Mutanten-Gewebe durch sekundäre Defekte maskiert wird. Um primäre Defekte zu identifizieren, wurden in vivo Bindestellen von CP29A mit einer neuen Chloroplasten-adaptierten Methode, die UV-Licht zur Quervernetzungen nutzt, bestimmt. Transkripte, die für Untereinheiten des Photosystem II und des Cytochrom-b6f-Komplexes kodieren, waren unter den Zielen von CP29A überrepräsentiert. Weiterhin wurden mehrere Bindestellen in Nachbarschaft zu Bindestellen von PPR-Proteinen identifiziert. Mit einer alternativen Methode, die chemische Quervernetzung nutzt, wurden Ziel-RNAs eines weiteren cpRNP, CP31A, identifiziert. Transkripte, die für Untereinheiten des NADH-Dehydrogenase Komplexes kodieren, waren überrepräsentiert. Diese Daten führten zu einer neuen Hypothese, die die Funktion von cpRNPs im Zusammenspiel mit PPR-Proteinen in der Prozessierung funktionell verwandter RNAs postuliert. Ein weiterer für die Genexpression relevanter Mechanismus ist die Bildung membranloser Kompartimente durch flüssig-flüssig Phasentrennung. Es wurde eine in silico Analyse durchgeführt, um organelläre Proteine mit Domänen, die auf flüssig-flüssig Phasentrennung hindeuten, zu identifizieren. Funktionen mit Bezug zu Genexpression, insbesondere RNA-Edierung, waren bei diesen Proteinen mit Prionen-ähnlichen Domänen (PLDs) überrepräsentiert. Zwei Kandidaten wurden auf ihre Neigung zur flüssig-flüssig Phasentrennung durch in vitro Experimente und in vivo Mikroskopie untersucht. Gene expression in chloroplasts and mitochondria relies on a large number of RNA-binding proteins (RBPs), which are involved in the processing of polycistronic precursor transcripts. A particular abundant family are the chloroplast ribonucleoproteins (cpRNPs). While target RNAs and mutant phenotypes of several cpRNPs were described, insights on their molecular function remained sparse. In this thesis, analyses of cp29a mutants were extended by genome-wide transcriptome data, which suggest that in phenotypically noticeable mutant tissue the actual role of CP29A might be masked by secondary effects. To identify primary defects, in vivo binding sites of CP29A on its target transcripts were determined using a novel chloroplast-adapted approach using crosslinking by UV-light. Identified targets of CP29A are functionally enriched in mRNAs encoding subunits of the photosystem II and the cytochrome b6f complex. Moreover, several binding sites were identified in close proximity to characterized binding sites of PPR proteins. Using an alternative approach, employing chemical crosslinking, targets of another cpRNP, CP31A, were identified. Targets are enriched in genes encoding subunits of the NADH-like dehydrogenase complex. In combination, these data led to a novel hypothesis on the molecular function of cpRNPs working together with PPR proteins in the processing of functionally related RNAs. Another increasingly recognized mechanism in gene expression is the formation of membraneless organelles by liquid-liquid phase separation. An in silico screen for organellar proteins containing domains indicative of phase separation was performed. The identified set of proteins with prion-like domains (PLDs) is enriched in functions related to gene expression, particularly RNA-editing. Two selected candidate proteins were characterized for their propensity to undergo phase separation by in vitro phase separation assays and in vivo microscopy.

Der Sekretionsweg ist essenziell für die Funktion von Zellen und beginnt, wenn mRNAs, die für Membran- und Sekretionsproteine codieren, an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebracht werden. Allerdings ist wenig darüber bekannt, inwiefern RNA-bindende Proteine zur Erkennung und Translation von ER lokalisierten mRNAs beitragen. In dieser Arbeit haben wir das humane RNA-bindende Protein HDLBP charakterisiert. Wir haben durch PAR-CLIP-, Zellfraktionierungs- und RNA-Seqeuenzierexperimente festgestellt, dass HDLBP an mehr als 80% aller ER lokalisierten mRNAs bindet. Analysen zu HDLBPs Bindungsmotiv haben gezeigt, dass HDLBP vorwiegend an ein CU-haltiges Motiv in der codierenden Sequenz (CDS) hauptsächlich von ER lokalisierten mRNAs bindet. Im Gegensatz dazu enthalten zytosolische HDLBP gebundene mRNAs weniger Bindungsstellen und diese treten sowohl in der CDS als auch in 3‘ untranslatierten Regionen auf. Dies zeigt, dass sich ER lokalisierte mRNAs von Zytosol lokalisierten mRNAs in ihrer Sequenzzusammensetzung hinsichtlich der HDLBP Bindungsstellen unterscheiden. Weitere Analysen des PAR-CLIP-Experiments ergaben, dass HDLBP mit RNA-Komponenten des Signalerkennungspartikels (SRP) und der 40S ribosomalen Untereinheit interagiert. Durch BioID-Experimente haben wir Proteine in unmittelbarer Nähe zu HDLBP bestimmt und konnten damit die Assoziation von HDLBP mit Komponenten des Translationsapparates und des SRPs bestätigen. Funktionelle Studien, bei denen wir CRISPR-Cas9 erzeugte HDLBP Knockout (KO) Zelllinien in Kombination mit Ribosomen-Profiling verwendet haben, haben gezeigt, dass HDLBP die Translation von mRNAs fördert, die an HDLBP gebunden und am ER lokalisiert sind. Letztlich haben in vivo Experimente mit Nacktmäusen ergeben, dass HDLBP KO eine Abnahme der Lungentumorbildung verursacht, was die Relevanz von HDLBP für die Tumorprogression hervorhebt. Insgesamt zeigt unsere Arbeit eine generelle Funktion von HDLBP bei der Translation von ER lokalisierten mRNAs., The secretory pathway is essential for proper cell functioning and starts when mRNAs encoding membrane and secretory proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER). However, little is known about the contribution of RNA-binding proteins to the recognition, localization and translation of ER-localized mRNAs. In this work, we characterized the human RNA-binding protein HDLBP. We identified that HDLBP binds to more than 80% of all ER-localized mRNAs by PAR-CLIP, cell fractionation and RNA-sequencing experiments. Analysis of the HDLBP binding motif showed that it predominantly binds to a CU-containing motif and forms high affinity multivalent interactions primarily in the coding sequence (CDS) of ER-localized mRNAs. In contrast, we identified that cytosolic HDLBP mRNA targets show less HDLBP binding sites randomly distributed between the CDS or 3’ untranslated regions. This indicates that ER-localized mRNAs per se differ from cytosol-localized mRNAs in their sequence composition with regard to HDLBP binding sites. Further PAR-CLIP analysis revealed that HDLBP interacts with RNA components of the signal recognition particle (SRP) and the 40S ribosomal subunit. We identified by BioID experiments proteins in close proximity to HDLBP and confirmed the association of HDLBP with components of the translational apparatus and the SRP. Functional studies using CRISPR-Cas9 HDLBP knockout (KO) cell lines in combination with ribosome profiling demonstrated that HDLBP promotes the translation of its ER-localized target mRNAs. We validated this finding by pSILAC experiments and detected the corresponding decrease in protein synthesis of proteins encoded by mRNAs that are bound by HDLBP and ER-localized. Lastly, in vivo experiments with nude mice showed that HDLBP KO resulted in a decrease of lung tumor formation highlighting the relevance of HDLBP for tumor progression. Overall, these results demonstrate a general function for HDLBP in the translation of ER-localized mRNAs.

RNA-Bindungsproteine spielen Schlüsselfunktionen bei der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression. Durch Bindung an RNA steuern sie die RNA-Aufbereitung, den Transport, die Stabilität und die Translation. In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung bakterieller post-transkriptioneller Mechanismen erzielt. Es wird immer deutlicher, dass diese Regulierungsebene auch bei der Pathogenese und Antibiotikaresistenz eine wichtige Rolle spielt. Die Analyse von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) auf Proteomebene wurde durch die (m)RNA-interactome-capture Technologie vorangetrieben, die den Teil des Proteoms isoliert, welcher mit polyadenylierter (m)RNA vernetzt ist. Dies hat zur Identifizierung von Hunderten von neuen RBPs in einer Vielzahl von eukaryontischen Arten, vom Menschen bis zur Hefe, geführt. Allerdings fehlt die Poly-Adenylierung in der funktionellen RNA von Bakterien und anderen Klassen von -eukaryontischen- regulatorischen RNAs. Ziel dieser Arbeit war es, diese Einschränkung durch die Entwicklung einer neuartigen und unvoreingenommenen Methode zur Aufreinigung von UV-vernetzten RNPs in lebenden Zellen zu überwinden: PTex (Phenol-Toluol-Extraktion). Das Reinigungsprinzip basiert ausschließlich auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften von vernetzten RNPs gegenüber ungebundenen Proteinen oder RNA; es ist dabei unparteiisch gegenüber spezifischen RNAs oder Proteinen und ermöglicht somit erstmals eine systemweite Analyse von nicht-poly-(A)-RNA-interagierenden Proteinen sowohl in eukaryontischen (HEK293) als auch in prokaryontischen (Salmonella Typhimurium) Zellen., RNA binding proteins play key functions in post-transcriptional regulation of gene expression. By binding to RNA, they control RNA editing, transport, stability and translation. In the last decade, significant advances have been made in the elucidation of bacterial post-transcriptional mechanisms. It is becoming increasingly clear that this layer of regulation also plays an important role in pathogenesis and antibiotic resistance. The analysis of RNA-protein complexes (RNPs) at the proteome level has been driven by the (m)RNA interactome capture technology which isolates the proteome cross-linked to poly-adenylated (m)RNA. This has resulted in the identification of hundreds of novel RBPs in a diversity of eukaryotic species ranging from humans to yeast. However, poly-adenylation is absent in functional RNA from bacteria and other classes of -eukaryotic- regulatory RNAs. This work was aimed to overcome that limitation by developing a novel and unbiased method for the purification of UV-cross-linked RNPs in living cells: PTex (Phenol Toluol extraction). The purification principle is solely based on physicochemical properties of cross-linked RNPs versus unbound proteins or RNA, and it is impartial towards specific RNA or proteins; enabling for the first time a system-wide analysis of non-poly(A) RNA interacting proteins in both eukaryotic (HEK293) and prokaryotic (Salmonella Typhimurium) cells.

Die Detektion sogenannter Vitalitäts-assoziierte molekularer Muster (vita-PAMPs), signalisiert dem Immunsystem die Präsenz lebender Mikroorganismen und ruft verstärkte Immunantworten hervor. Die vorliegende Studie untersuchte die Erkennung bakterieller Vitalität durch humane Antigen-präsentierenden Zellen (APC), sowie die Effekte auf die adaptive Immunität. Transkriptomanalysen von humanen Monozyten zeigten eine selektive transkriptionelle Antwort auf lebendige im Vergleich zu hitzegetöteten Bakterien. Die inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF wurden nahezu ausschließlich in Reaktion auf lebende Bakterien exprimiert. Die Detektion bakterieller Vitalität ist in Menschen, Schweinen, Mäusen und Fischen konserviert. In Mäusen wurde bakterielle RNA als bakterielles vita-PAMP identifiziert. In menschlichen Monozyten führte die Supplementierung toter Bakterien mit bakterieller RNA oder mit synthetischen Liganden des Toll-like-Rezeptors (TLR) 7 und TLR8, jedoch nicht mit anderen TLR-Liganden, zur Rekonstitution der TNF- und IL-12-Antwort. Umgekehrt hemmte silencing von TLR8- vita-PAMP-induzierte Zytokinproduktion. T-follikuläre Helferzellen (TFH) spielen eine zentrale Rolle in der Initiierung humoraler Immunantworten. Hier wurde die Erkennung lebender Bakterien, bakterieller RNA oder synthetischer TLR8-Liganden durch APC als Stimulus für robuste TFH-Zelldifferenzierung identifiziert. Die TFH-Differenzierung ist abhängig von der Erkennung bakterieller RNA über TLR8 und der Produktion von IL-12. Immunisierung von Schweinen mit einem bakteriellen Lebendimpfstoff löste deutlich robustere TFH-Zell- und Antikörperreaktionen als eine Immunisierung mit der hitzegetöteten Version des gleichen Impfstoffs aus. Zusammenfassend haben wir TLR8 als den ersten bekannten vita-PAMP-Rezeptor identifiziert und seine zentrale Rolle für TLR8-vermittelte “Vitalitätserkennung” für die Induktion von TFH-Zellen und Impfreaktionen demonstriert. The detection of the so-called vitality-associated molecular patterns (vita-PAMPs) signals to the immune system the presence of living microorganisms and triggers an increased immune response. The present study investigated the detection of bacterial vitality by human antigen-presenting cells (APC), as well as the effects of this recognition events on adaptive immunity. Transcriptome analysis of human monocytes showed a selective transcriptional response to live versus heat-killed bacteria. Among others, the inflammatory cytokines IL-12 and TNF were expressed almost exclusively in response to live bacteria. Moreover, the detection of bacterial vitality is conserved in humans, pigs, mice and fish. In mice, bacterial RNA was identified as a bacterial vita-PAMP. In human monocytes, supplementation of dead bacteria with bacterial RNA or with synthetic ligands of toll-like receptor (TLR) 7 and TLR8, but not with other TLR ligands, resulted in the reconstitution of the TNF and IL-12 responses. Conversely, silencing of TLR8 inhibited vita-PAMP-dependent cytokine production. T-follicular helper cells (TFH) play a central role in the initiation of humoral immune responses. Here, the recognition of living bacteria, bacterial RNA or synthetic TLR8 ligands by APCs was identified as a stimulus for robust TFH cell differentiation. TFH differentiation is dependent on the recognition of bacterial RNA via TLR8 and the production of IL-12. Immunization of pigs with a live bacterial vaccine elicited significantly more robust TFH cell and antibody responses than immunization with the heat-killed version of the same vaccine. In summary, we identified TLR8 as the first known vita-PAMP receptor in human and demonstrated its pivotal role in TLR8-mediated “viability recognition” for the induction of TFH cells and vaccine reactions.

Neutrophile Granulozyten produzieren „Neutrophil Extracellular Traps“ (NETs), ein mit antimikrobiellen Molekülen bestücktes Netzwerk aus Chromatinfasern, das während eines Zelltodprogramms namens „NETosis“ von den sterbenden Neutrophilen ausgestoßen wird. Ihre netzartige Struktur erlaubt es ihnen, eine weitere Verbreitung des Infektionserregers zu verhindern; zudem erzeugen sie eine hohe lokale Konzentration an toxischen Molekülen, die Mikroorganismen töten können. Unter normalen Bedingungen werden NETs von Nukleasen zerkleinert und anschließend von Makrophagen entfernt. Wenn dieser Aufräummechanismus gestört ist, aktivieren NETs das Immunsystem und führen zur Produktion von Autoantikörpern oder entzündungsfördernden Zytokinen. NETs werden mit einer wachsenden Liste von inflammatorischen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Wie genau dabei NETs durch das Immunsystem erkannt werden, ist noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass NETs durch den zytosolischen DNA Sensor „cyclic GMP-AMP synthase“ (cGAS) detektiert werden können und dass dadurch die Expression von Typ I Interferonen (TIIFN) induziert wird. Zu Beginn demonstriere ich, dass NETs durch rekombinantes cGAS erkannt werden und dass mit isolierten NETs stimulierte Immunzellen cGAS-abhängig TIIFN produzieren. Des Weiteren zeige ich, dass Neutrophile, die NETosis begehen, in Nachbarzellen ebenfalls cGAS-anhängig TIIFN induzieren können. Abschließend konnte ich diese Ergebnisse in einem in vivo Mausmodel für systemische NET-Produktion bestätigen. Die vorliegende Arbeit zeigt einen Mechanismus, wie NETs durch das Immunsystem erkannt werden und dadurch sowohl zur Entstehung als auch zur Progression von Krankheiten beitragen kann. Sie ermöglicht dementsprechend die Entwicklung neuer Interventionsstrategien, welche zur Heilung oder Linderung einer Vielzahl von Erkrankungen beitragen können., The first line of cellular defense of the immune system are neutrophils. They are the most abundant white blood cell, which exert an array of antimicrobial effector functions. Neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), a composite of chromatin and antimicrobial molecules, into the extracellular space during a form of regulated cell death called NETosis. Their net-like structure prevent further dissemination of the invader and establishes a high local concentration of toxic molecules that mediate pathogen killing. NETs provide a platform for undesired immune activation and contribute to the production of autoantibodies and pro-inflammatory cytokines. NETs are implicated in a growing list of inflammatory and autoimmune diseases, but the exact mechanism how NETs are recognized by the immune system is not fully understood. In this study, I demonstrate that the cytosolic DNA sensor cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) senses NETs and induces the production of type I interferons (TIIFN). I first showed that NETs are recognized by recombinant cGAS and that cells treated with isolated NETs produce TIIFN in a cGAS dependent mechanism. Secondly, I demonstrate that neutrophils undergoing NETosis are taken up by neighboring immune cells and induce cGAS-dependent TIIFN expression. Lastly, I confirmed our in vitro results in a mouse model of systemic NET induction. Wildtype mice injected with Concanavalin A significantly upregulate the expression of interferon stimulated genes, while cGAS-/- mice and Cybb-/- mice, which are incapable of producing NETs, fail to induce this response.

PB2 ist ein essentieller Bestandteil der trimeren RNA abhängigen RNA Polymerase von Influenzaviren und ist bekannt für seine Schlüsselrolle in der Bestimmung des Viruswirtsspektrums. Diese Arbeit diente der Identifizierung neuer Interaktionspartner von PB2 eines saisonalen und eines hochpathogenen Influenzavirus Stammes im Kontext infizierter humaner alveolar Epithelzellen (A549) unter Einsatz massenspektrometrischer Analysen. Die anschließende Untersuchung ausgewählter zellulärer Interaktoren hatte zum Ziel, deren Einfluss auf den Replikationszyklus der Influenzaviren zu bestimmen, sowie Unterschiede in ihrer Relevanz für das saisonale und das hochpathogene Virus aufzuzeigen. Die Erzeugung und Nutzung von Influenzaviren die einen Strep-tag an ihrem PB2 Protein tragen ermöglichte eine Anreicherung von PB2 und seiner Interaktionspartner. Die anschließende massenspektrometrische Analyse identifizierte 22 potentielle PB2 Interaktionspartner. Eine Auswahl an 13 Proteinen wurde tiefer gehend analysiert und eine Komplexbildung mit PB2 konnte für 9 Proteine bestätigt werden. Darüber hinaus zeigten 11 Proteine einen Polymerase stimulierenden bzw. hemmenden Effekt. Das Polymerase stimulierende Protein HSPA8 wurde zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Während ein Einfluss von HSPA8 auf den hochpathogenen Influenzastamm nicht abschließend geklärt werden konnte, wurde seine Bedeutung für den Vermehrungszyklus des saisonalen Stammes aufgezeigt. Die Überexpression von HSPA8 führte zu einer Steigerung der Polymerase-Aktivität, wohingegen die Erniedrigung des HSPA8 Spiegels in einer Verringerung der viralen Replikation und der Polymerase-Aktivität resultierte. Interessanterweise führte die Erniedrigung des HSPA8 Spiegels auch zu stark verminderter PB2-Expression, jedoch nur im Falle des saisonalen Influenzastammes. Dieser Befund deutet auf eine Rolle von HSPA8 als PB2-Chaperon, notwendig für Proteinstabilität von saisonalen aber nicht hochpathogenen Influenzaviren, hin. PB2 is an essential component of the influenza virus trimeric RNA dependent RNA polymerase and is known to play a key role in virus host range determination. Here, a combined affinity-purification/mass spectrometric approach was performed to identify novel interaction partners of PB2 of seasonal and highly pathogenic viral strains in infected human alveolar epithelial cells (A549). The subsequent analysis of selected cellular interaction partners aimed to determine the influence of these proteins on the replication cycle, as well as to determine differences in their relevance for the seasonal and the highly pathogenic influenza virus strain. Generation and use of recombinant influenza viruses carrying a Strep-tag at their PB2 protein allowed for enrichment of PB2 and its interaction partners. The subsequent mass spectrometric analysis identified 22 potential PB2 interaction partners. A selection of 13 proteins was further analyzed, and co-precipitation with PB2 was confirmed for 9 proteins. Moreover, an inhibitory or stimulatory effect on polymerase activity was observed for 11 proteins. The polymerase stimulating protein HSPA8 was selected for further investigation. While the influence of HSPA8 on the highly pathogenic strain remained unclear, its importance for seasonal influenza virus life cycle was demonstrated. Overexpression of HSPA8 resulted in increased polymerase activity while HSP8 knock down resulted in reduction of viral replication and viral polymerase activity. Intriguingly, the knock down of HSPA8 led to a strong decrease of PB2 protein expression. However, this was only observed for seasonal PB2. These results indicate a role of HSPA8 as a PB2 chaperone, necessary for protein stability of seasonal but not highly pathogenic influenza virus.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die auf posttranskriptionaler Ebene die Genexpression hemmen. Dafür bilden miRNAs Ribonukleoprotein-Komplexe, deren Kernbestandteile aller Bilateria Argonaute (AGO) und GW182 /TNRC6 Proteine sind. GW182 / TNRC6-Proteine rekrutieren CCR4-NOT-Deadenylasen über kurze Tryptophan-reiche Motive (W-Motive), welche additiv wirken und fördern so die translationale Repression und den Abbau von Ziel-mRNAs. Um mehr über die Mechanismen der miRNA-abhängigen Genrepression zu erfahren, habe ich W-Motiv-abhängige Interaktionspartner humaner TNRC6C Proteine bestimmt. Hierzu habe ich, mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie, das Interaktom von wildtyp TNRC6C Proteinen mit dem von TNRC6C Proteinen, deren W-Motive mutiert wurden, verglichen. Neben bekannten Interaktionspartnern, wie Untereinheiten des CCR4-NOT Komplexes, habe ich Komponenten von Clathrin-Vesikeln (CCVs), Stoffwechsel assoziierte Enzyme, mitochondriale Proteine, RNA Helikasen, Kinasen und Phosphatasen mit potentiellen Funktionen in der miRNA-assoziierten Repression identifiziert. Die im ersten Teil dieser Studie vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass CCVs die Speicherung oder das Recycling von TNRC6 und AGO Proteinen vermitteln können und somit das miRNA-Silencing modulieren. Der zweite Teil dieser Studie befasst sich mit der Konservierung von miRNA vermitteltem Gen-Silencing in Cnidaria (Nematostella vectensis), welche sich vor 600 Millionen Jahren von der Ahnenreihe der Metazoa abspalteten. Hier zeige ich anhand humaner Zellen, dass Nematostella GW182, ähnlich wie in Bilateria, von AGO rekrutiert wird und nachfolgend in der Repression der mRNA fungiert, was darauf hinweist, dass dieser Mechanismus der miRNA-vermittelten Geninhibition bereits in den letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria aktiv war., MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that act as post-transcriptional repressors of gene expression. To function miRNAs are assembled in ribonucleoprotein complexes, whose core components in bilaterian animals are Argonaute (AGO) and GW182/TNRC6 proteins. GW182/TNRC6 proteins additively recruit CCR4-NOT deadenylases via short tryptophan-containing motifs (W-motifs), thereby promoting translational repression and the decay of target mRNAs. To gain deeper insights into the mechanisms of miRNA silencing I determined the W-motif-specific interactome of human TNRC6C proteins. Using Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell Culture (SILAC) coupled to affinity purification and Mass Spectrometry (MS) I identified proteins enriched with wild type TNRC6C as compared to two mutants with disrupted W-motifs. Besides known functional interactors, such as subunits of the CCR4-NOT complex, I identified several components of clathrin-coated vesicles (CCVs), metabolic enzymes, mitochondrial proteins, RNA helicases, kinases, and phosphatases with potential functional roles in miRNA-mediated repression. The results presented in the first part of this thesis indicate that CCVs may mediate the storage or recycling of TNRC6 and AGO proteins, thus modulating miRNA silencing. The second part of the thesis addressed the conservation of the mechanisms of miRNA silencing via W-motifs in the cnidarian Nematostella vectensis, separated by 600 million years from other Metazoa. Using cultured human cells, I showed that similarly to bilaterians, GW182 in Nematostella is recruited to the miRNA repression complex via interaction with AGO proteins, and functions downstream to repress mRNA, indicating that this mechanism of miRNA-mediated silencing was already active in the last common ancestor of Cnidaria and Bilateria.