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[Resumen] La epidemiología basada en aguas residuales (EAR) es fundamental para la monitorización de patógenos responsables de enfermedades infecciosas. Esta Tesis Doctoral presenta en detalle el proyecto COVIDBENS, un programa multidisciplinar que integra las áreas de microbiología, estadística y bioinformática, implementado en el área metropolitana de A Coruña durante la pandemia de COVID-19, con el objetivo de monitorizar el virus SARS-CoV-2 en las aguas residuales de la depuradora de EDAR Bens, que da servicio a los municipios de A Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo y Oleiros. COVIDBENS operó como un sistema de alerta temprana de brotes de SARS-CoV-2 y de sus variantes emergentes, proporcionando información crucial para comprender la verdadera magnitud de la epidemia en la población y facilitando la toma de decisiones por parte de las autoridades. Además, se monitorizó la carga viral de SARS-CoV-2 (copias de ARN/L) a nivel local a partir de las aguas residuales de residencias de mayores ubicadas en el área metropolitana de A Coruña para prever nuevos brotes entre los residentes y evaluar la eficacia de la campaña de vacunación. Este trabajo demostró una vez más que la EAR es una estrategia rentable para prevenir brotes de enfermedades emergentes o futuras amenazas pandémicas., [Resumo] A epidemioloxía baseada en augas residuais (EAR) é fundamental para o rastrexo de patóxenos responsables de enfermidades infecciosas. Esta Tese Doutoral presenta en detalle o proxecto COVIDBENS, un programa multidisciplinar que integra as áreas de microbioloxía, estatística e bioinformática, implementado na área metropolitana da Coruña durante a pandemia de COVID-19, co obxectivo de rastrexar o virus SARS-CoV-2 nas augas residuais da depuradora de EDAR Bens, que serve aos municipios da Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo e Oleiros. COVIDBENS operou como un sistema de alerta temperá de gromos de SARS-CoV-2 e das súas variantes emerxentes, proporcionando información crucial para comprender a verdadeira magnitude da epidemia na poboación e facilitando a toma de decisións por parte das autoridades. Ademais, rastrexouse a carga viral de SARS-CoV-2 (copias de ARN /L) a nivel local a partir das augas residuais de residencias de maiores situadas na área metropolitana da Coruña para prever novos gromos entre os residentes e avaliar a eficacia da campaña de vacinación. Este traballo demostrou unha vez máis que a EAR é unha estratexia rendible para prever gromos de enfermidades emerxentes ou futuras ameazas pandémicas., [Abstract] Wastewater-based epidemiology (WBE) is essential for monitoring pathogens responsible for infectious diseases. This Doctoral Thesis presents in detail the COVIDBENS project, a multidisciplinary program that integrates the areas of microbiology, statistics and bioinformatics, implemented in the metropolitan area of A Coruña with the aim of monitoring SARS-CoV-2 in wastewater from the wastewater treatment plant of Bens, which serves to the municipalities of A Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo and Oleiros. COVIDBENS worked as an early warning system for SARS-CoV-2 outbreaks and its emerging variants, providing crucial information to understand the true magnitude of the epidemic in the population and facilitating decision-making by authorities. Furthermore, the viral load of SARS-CoV-2 (RNA copies/L) at local level was monitored from the wastewater of nursing homes located in the metropolitan area of A Coruña to predict new outbreaks among residents and to evaluate the effectiveness of the vaccination campaign. This work once again demonstrated that the WBE is a cost-effective strategy to prevent emerging diseases outbreaks or future pandemic threats.

[Resumen] La epidemiología basada en aguas residuales (EAR) es fundamental para la monitorización de patógenos responsables de enfermedades infecciosas. Esta Tesis Doctoral presenta en detalle el proyecto COVIDBENS, un programa multidisciplinar que integra las áreas de microbiología, estadística y bioinformática, implementado en el área metropolitana de A Coruña durante la pandemia de COVID-19, con el objetivo de monitorizar el virus SARS-CoV-2 en las aguas residuales de la depuradora de EDAR Bens, que da servicio a los municipios de A Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo y Oleiros. COVIDBENS operó como un sistema de alerta temprana de brotes de SARS-CoV-2 y de sus variantes emergentes, proporcionando información crucial para comprender la verdadera magnitud de la epidemia en la población y facilitando la toma de decisiones por parte de las autoridades. Además, se monitorizó la carga viral de SARS-CoV-2 (copias de ARN/L) a nivel local a partir de las aguas residuales de residencias de mayores ubicadas en el área metropolitana de A Coruña para prever nuevos brotes entre los residentes y evaluar la eficacia de la campaña de vacunación. Este trabajo demostró una vez más que la EAR es una estrategia rentable para prevenir brotes de enfermedades emergentes o futuras amenazas pandémicas., [Resumo] A epidemioloxía baseada en augas residuais (EAR) é fundamental para o rastrexo de patóxenos responsables de enfermidades infecciosas. Esta Tese Doutoral presenta en detalle o proxecto COVIDBENS, un programa multidisciplinar que integra as áreas de microbioloxía, estatística e bioinformática, implementado na área metropolitana da Coruña durante a pandemia de COVID-19, co obxectivo de rastrexar o virus SARS-CoV-2 nas augas residuais da depuradora de EDAR Bens, que serve aos municipios da Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo e Oleiros. COVIDBENS operou como un sistema de alerta temperá de gromos de SARS-CoV-2 e das súas variantes emerxentes, proporcionando información crucial para comprender a verdadeira magnitude da epidemia na poboación e facilitando a toma de decisións por parte das autoridades. Ademais, rastrexouse a carga viral de SARS-CoV-2 (copias de ARN /L) a nivel local a partir das augas residuais de residencias de maiores situadas na área metropolitana da Coruña para prever novos gromos entre os residentes e avaliar a eficacia da campaña de vacinación. Este traballo demostrou unha vez máis que a EAR é unha estratexia rendible para prever gromos de enfermidades emerxentes ou futuras ameazas pandémicas., [Abstract] Wastewater-based epidemiology (WBE) is essential for monitoring pathogens responsible for infectious diseases. This Doctoral Thesis presents in detail the COVIDBENS project, a multidisciplinary program that integrates the areas of microbiology, statistics and bioinformatics, implemented in the metropolitan area of A Coruña with the aim of monitoring SARS-CoV-2 in wastewater from the wastewater treatment plant of Bens, which serves to the municipalities of A Coruña, Arteixo, Cambre, Culleredo and Oleiros. COVIDBENS worked as an early warning system for SARS-CoV-2 outbreaks and its emerging variants, providing crucial information to understand the true magnitude of the epidemic in the population and facilitating decision-making by authorities. Furthermore, the viral load of SARS-CoV-2 (RNA copies/L) at local level was monitored from the wastewater of nursing homes located in the metropolitan area of A Coruña to predict new outbreaks among residents and to evaluate the effectiveness of the vaccination campaign. This work once again demonstrated that the WBE is a cost-effective strategy to prevent emerging diseases outbreaks or future pandemic threats.

606 p., CRM1 bestelako ehunka proteinaren, kargoren, nukleotik zitoplasmaranzko garraioa egikaritzen duen hartzailea da. Horretarako, CRM1ek poltsiko hidrofobiko bat du, zeinetara kargoen esportazio seinaleak, NESak, lotzen diren. Tesi honetan, hainbat kargo edota NES berri identifikatu eta baieztatu dira, horien artean, lehenengoz aktiboki garraiatzen den mikropeptido bat eta horren NESa identifikatu dira. Gainera CRM1 eta NESen arteko lotura testu inguru zelularrean sakontasunean aztertzeko esportazio entsegu berri bat garatu da, zeinak lotura horretan parte hartzen duen aminoazido bakoitzaren zeresana aztertzeko bidea eman duen.Bestetik, CRM1en kargo asko minbiziarekin erlazionatuta, beraz, ez da harritzekoa CRM1 minbiziarekin estuki erlazionaturik egotea. CRM1 minbizian gainadierazita zein mutaturik aurkitu da, eta jada, CRM1 inhibitzaile den selinexor minbizia jakin batzuen tratamendurako onartua izan da. Tesi honetan, CRM1en mutazio onkogenikoak NESen esportazioan duen eragina aztertu da, gainera, selinexor eta beste ituratutako farmakoen arteko sinergia posibleak bilatu dira AML zelulak erabiltzen dituen sistema modelo batean. Eta bukatzeko, CRM1en inhibitzaileek proteoma mailan duten eragina aztertzea ahalbidetuko duen proteinen gertuko biotinilazioan oinarritutako estrategia berri bat garatu da

An excessive production of lactate by cancer cells fosters tumor growth and metastasis. Therefore, targeting lactate metabolism and transport offers a new therapeutic strategy against cancer, based on dependency of some cancer cells for lactate as energy fuel or as oncogenic signal. Herein we present a family of anionophores based on the structure of click-tambjamines that have proved to be extremely active lactate carriers across phospholipid membranes. Compound 1, the most potent lactate transmembrane carrier, was studied in HeLa cells. The use of a monocarboxylate transporters (MCTs) inhibitor proved that 1 is an active lactate transporter in living cells, confirming the results obtained in phospholipid vesicles. Moreover, an additive effect of compound 1 with cisplatin was observed in HeLa cells. Identification of active lactate anionophores working in living cells opens up ways to exploit this class of compounds as molecular tools and drugs addressing dysregulated lactate metabolism., This research has been financially supported by Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (project BU067P20) and Ministerio de Ciencia e Innovación (project PID2020-117610RB-I00). D.A.-C., I.C.-B. and P.F. thank Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León, European Regional Development Fund (ERDF) and European Social Fund (ESF) for their pre-doctoral (D.A.-C.) and post-doctoral (I.C.-B. and P.F.) contracts. A.A.-B. thanks to PFCHA/Becas Chile (Folio#72200156). The authors gratefully acknowledge Andrea Sancho-Medina for her contributions to transmembrane anion transport experiments.

After more than three decades of extensive investigations on supramolecular polymers, strategies for self-limiting growth still remain challenging. Herein, we exploit a new V-shaped monomer design to achieve anticooperatively formed oligomers with superior robustness and high luminescence. In toluene, the monomer-oligomer equilibrium is shifted to the monomer side, enabling the elucidation of the molecular packing modes and the resulting (weak) anticooperativity. Steric effects associated with an antiparallel staircase organization of the dyes are proposed to outcompete aromatic and unconventional B−F⋅⋅⋅H−N/C interactions, restricting the growth at the stage of oligomers. In methylcyclohexane (MCH), the packing modes and the anticooperativity are preserved; however, pronounced solvophobic and chain-enwrapping effects lead to thermally ultrastable oligomers. Our results shed light on understanding anticooperative effects and restricted growth in self-assembly., We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB858) for funding (B.M. and G.F.). B.S. thanks the MICINN/AEI of Spain for the projects EQC2018-004206-P, RED2018-102331-T, PID2019-107779GA-I00/AEI/10.13039/501100011033 and RYC-2017-21789. M. G.-V. and R.Q. thank funding from Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León and ERDF (project BU067P20) and MICN/AEI/10.13039/501100011033 (grant PID2020-117610RB-100). S.D.-C. and I.C.-B. thank Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León, ERDF (European Regional Development Fund) and European Social Fund for their pre- and post-doctoral contracts, respectively.Conflict of Interest Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.

125 p., Las proteínas son biopolímeros esenciales en todos los organismos vivos encargadas de un gran número de funciones. Tradicionalmente, el paradigma estructura-función dictaba que todas las proteínas debían encontrarse plegadas ya que solo así serían capaces de ejercer su función. Posteriormente, se ha descubierto un tipo de proteínas llamadas intrínsecamente desordenadas (o IDPs) que no se encuentran plegadas en su estado fisiológico. Debido a su desorden estructural, estas proteínas son capaces de adoptar diferentes configuraciones y unirse a diferentes proteínas. Esto les confiere una gran versatilidad funcional, y en consecuencia están muy presentes en vías de señalización y regulación celular. En esta tesis nos centraremos en el estudio de la unión de dos IDPs, HIF-1¿ y CITED2, a uno de los ocho dominios de la proteína de unión a CREB (CREB binding protein o CBP). Este dominio llamado TAZ1regula la activación del mecanismo de hipoxia en el organismo cuando la cantidad de oxígeno tisular es demasiado baja. En condiciones normales HIF-1 se hidroxila con la presencia de oxígeno y es degradado por el proteasoma, sin embargo cuando no hay oxígeno esta proteína no se puede hidroxilar,acumulándose y uniéndose a TAZ1. Esto provoca la activación de un gran número de genes relacionados con la supervivencia celular. Algunos de estos genes son utilizados por las células tumorales para sobrevivir, ya que al estar alejadas del torrente sanguíneo también tienen problemas similares a las células en condiciones hipóxicas. Por esta razón es que el bloqueo de la interacción de estas dos proteínas seria muy beneficioso.

200 p., Uno de los mayores problemas en la clínica a la hora de tratar el cáncer de mama es el desarrollo de resistencia a las terapias endocrinas, debido a su alta frecuencia y mayor agresividad. Se ha demostrado que las células madre cancerígenas (CSC del inglés cancer stem cells) están involucradas en el inicio y progresión tumoral, así como en el desarrollo de resistencia a diversas terapias. Un análisis computacional identificó a la fosfatidilserina descarboxilasa (PISD), una enzima involucrada en el metabolismo de los fosfolípidos, como un candidato involucrado en ambas resistencias. Se demuestra que la reducción de los niveles de expresión de PISD afecta sobre todo a las células resistentes a tamoxifeno y a inhibidores de aromatasa en cuestión de proliferación y CSC, tanto in vitro como in vivo. El mecanismo por el que las células resistentes se ven más afectadas no está totalmente esclarecido, pero se propone una reactivación de la vía del receptor de estrógeno. Por otro lado, la generación de células que sobre expresan de manera estable PISD muestra que el aumento en la expresión de PISD no es suficiente para alterar la proliferación celular en condiciones adherentes. Sin embargo, el aumento de los niveles de PISD revela una tendencia en el aumento de las poblaciones de CSC. En conclusión, los datos sugieren que las células endocrinas resistentes dependen más de PISD para proliferar, para mantener las poblaciones de CSC y formar tumores, sin embargo, su sobre expresión no es suficiente para impulsar el fenotipo de resistencia a tratamientos endocrinos.

266 p., La naturaleza dinámica y reversible de las modificaciones post-traduccionales por parte de los miembros de la familia de la ubiquitina plantea importantes desafíos durante su investigación. En esta Tesis presentamos dos nuevas estrategias, SUMO-ID y E3-ID, basadas en proteómica de proximidad y marcaje por biotina, que permiten investigar a fondo los fundamentos biológicos de los códigos de ubiquitina y SUMO. Por un lado, SUMO-ID combina la biotinilación de proximidad mediada por la enzima TurboID con la complementación de fragmentos proteicos para identificar interactores de proteínas de interés dependientes de SUMO. Hemos desarrollado un punto de escisión optimizado de TurboID y, fusionando un fragmento a SUMO y el fragmento complementario a PML, hemos podido identificar numerosos interactores de PML dependientes de SUMO. Hemos demostrado que dichos interactores representan un subconjunto del proteoma de los cuerpos nucleares de PML maduros y que participan en procesos nucleares esenciales tales como transcripción, reparación del ADN, respuesta al estrés y SUMOilación, estando altamente enriquecidos en motivos de interacción con SUMO. Asimismo, SUMO-ID nos ha permitido identificar nuevos interactores de SALL1 SUMOilado, cuyo rol es todavía desconocido. Finalmente, utilizando TP53 como sustrato, hemos identificado qué proteínas interactúan preferencialmente vía SUMO1, SUMO2 o ubiquitina, lo que demuestra la gran especificidad de SUMO-ID y que se puede aplicar para estudiar otras interacciones UbL-dependientes. Por otro lado, E3-ID se basa en la enzima BirA que biotinila específicamente la secuencia AviTag. Expresando en células la fusión de AviTag con ubiquitina junto a la fusión de BirA con una E3 ligasa de interés, E3-ID permite identificar sustratos específicos de E3 ligasas de ubiquitina. Mediante un AviTag de baja afinidad, el sistema E3-ID identifica específicamente los substratos de la E3 ligasa tipo RING RNF4, lo que ha permitido caracterizar sus funciones f

257 p., E2F7 forma parte de la familia de factores de transcripción E2F y al igual que el resto de miembros de la familia, juega un papel crítico en la regulación del ciclo celular. Mientras que los mecanismos a través de los cuales los miembros E2F1-6 llevan a cabo la regulación transcripcional se conocen relativamente bien, habiendo identificado los principales complejos proteicos implicados en sus funciones activadoras o represoras, los mecanismos mediante los cuales E2F7 actúa como represor transcripcional para contrarrestar la activación transcripcional de los genes diana de E2F1-3 durante la progresión celular a través de la fase S, sigue sin caracterizarse completamente. Este trabajo de tesis se ha centrado en la investigación de los posibles interactores de E2F7, participes de la maquinaria represora empleada por E2F7. Se presentan evidencias de la interacción directa entre E2F7 y WDR5, una proteína conocida por ser crítica para la estabilidad y la actividad enzimática de los complejos de metilación de la cromatina MLL/SET implicados en la activación transcripcional. Además, los estudios funcionales llevados a cabo muestran un papel modulador de WDR5 sobre la actividad represora de E2F7. De hecho, el análisis de secuenciación masiva de ARN predice la implicación de dicha interacción en procesos de regulación transcripcional. Este análisis también ha permitido la identificación de genes diana de E2F7 no identificados hasta la fecha y regulados por el eje E2F7-WDR5.

254 p., La autofagia es una vía de degradación conservada entre los eucariotas caracterizada por la formación de una vesícula de doble membrana (autofagosoma) alrededor de lo que se quiere degradar para su posterior eliminación en el lisosoma. Hay un gran número de proteínas implicadas, entre ellas encontramos dos sistemas tipo ubiquitina (UBL) cuyo objetivo es anclar las proteínas de la familia LC3/GABARAP a la membrana. Esta familia está compuesta por seis proteínas ortólogas a la proteína Atg8 de levaduras. El principal objetivo de esta tesis fue explorar los posibles distintos papeles de sus seis miembros. LC3A y LC3B fueron identificadas como las encargadas del reconocimiento de mitocondrias durante la autofagia mediada por la externalización de la cardiolipina. GABARAP y GABARAPL1 una vez unidas a membrana fueron las proteínas capaces de producir una mayor agregación y fusión de vesículas, presentándose como los principales candidatos para participar en la expansión del autofagosoma. Además, uno de los componentes de los sistemas UBL, el complejo E3, se identificó como inhibidor de la capacidad de fusión de estas proteínas.

178 p., Los factores de transcripción Kru¿ppel-like factor (KLF) regulan procesos de organogénesis, diferenciación y homeostasis celular, a través de su interacción con importantes vías de señalización. En algunos tipos de cáncer, la expresión y/o actividad de ciertos KLFs se encuentran alteradas, favoreciendo la progresión tumoral. En este estudio se investigó el papel de en el desarrollo y progresión del colangiocarcinoma (CCA), así como su potencial valor diagnóstico, pronóstico y como diana terapéutica. Para ello, se analizó la expresión de KLF15 en tejido de pacientes con CCA e hígado sano adyacente al tumor, así como en líneas celulares humanas de CCA en comparación a colangiocitos humanos normales (NHC), observando que el descenso en la expresión de KLF15 parece ser un evento general en CCA. Por otro lado, analizamos el perfil de metilación del gen KLF15 en tejido de pacientes de CCA, verificándose hipermetilación en regiones promotoras del gen que se correlaciona inversamente con la expresión de KLF15 e incubamos líneas celulares humanas de CCA con un agente hipometilante, recuperando parcialmente la expresión del factor de transcripción. Simultáneamente, generamos mediante transducción lentiviral líneas celulares de CCA con sobrexpresión de KLF15, que presentaron una menor capacidad proliferativa y agresividad in vitro y un crecimiento más lento en tumores subcutáneos in vivo. Además, realizamos un análisis proteómico para identificar aquellas proteínas diferencialmente expresadas en las líneas celulares de CCA con sobrexpresión de KLF15. En conclusión, el factor de transcripción KLF15 actúa como supresor tumoral en CCA, presentándose como un posible biomarcador diagnóstico y pronóstico, así como una importante diana terapéutica.

268 p., Tesi honetan, aurretiaz Drosophila melanogaster eulian eta saguetan identifikatutako UBE3Aren balizko substratuak balioztatu ditugu, horretarako moldatutako purifikazio estrategia bat erabiliz ¿GFP pull-down estrategia¿. Halaber, estrategia hori masa espektrometriarekin konbinatuz UBE3Ak edozein substratutan sortutako ubikitina kate-motak eta substratu horien ubikitinazio-guneak identifikatzeko baliogarria dela egiaztatu dugu. Horrez gain, giza deubikitinasa (DUB) ezberdinak testatu ditugu, eta USP9X identifikatu dugu UBE3Aren aurkako funtzioa burutzen duen DUB gisa. USP9Xren inhibizioak UBE3Aren substratu den DDI1 proteinaren ubikitinazioa emendatzen du. Era berean, Angelman sindromearen modelo diren eulien fenotipoa ere hobetzen du, eta horrek, etorkizunean ASrentzako tratamenduak garatzen lagundu dezake. Inhibitzaile horren ondorioz, ubikitinazio-maila aldatzen duten, eta beraz, eulien fenotipoa hobetzearen eragile izan daitezkeen proteinak identifikatu ditugu masa espektrometrian oinarritutako esperimentu baten bidez. UBE3Arekin elkarrekin eta ligasaren funtzioa erregulatu dezaketen hainbat proteina ere identifikatu ditugu, baita proteina horiek UBE3Aren amino muturrarekin, karboxilo muturrarekin edo proteina osoarekin elkarrekiten duten zehaztu ere. Azkenik, UBE3Aren egitura osoa definitzeko helburuarekin, ligasa modu eraginkorrean purifikatzeko protokoloa ezarri dugu, eta UBE3A gainadierazten duten saguen portaera ikertu dugu.

224 p., Las vesículas extracelulares (EVs) son pequeñas partículas delimitadas por membranas lipídicas que las células generan y secretan al espacio extracelular. Su función principal es facilitar la comunicación intracelular, y actuar como portadoras de una amplia gama de moléculas, incluyendo proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Se ha observado que el daño hepático afecta de manera significativa la composición proteica de las EVs liberadas, y se ha constatado que las EVs secretadas por hepatocitos contienen enzimas activas, como la Catecol-O-metiltransferasa (COMT), una proteína previamente identificada como biomarcador de daño hepático. El objetivo principal de la tesis es investigar la composición de las EVs derivadas del hígado y su posible impacto en los órganos receptores, además de explorar la posible implicación de la COMT en dichos efectos. Este estudio ha revelado que los hepatocitos bajo condiciones de síndrome metabólico acumulan lípidos que son liberados a través de EVs en cultivo, alterando también significativamente el contenido lipídico de las EVs, enriqueciendo las especies de triglicéridos. A través de estudios In Vivo se han observado interacciones mediada por EVs entre el cerebro y el hígado aumentadas con dieta grasa. En relación con el estudio de la COMT, se ha encontrado una mayor expresión de esta enzima en las mitocondrias, y se ha determinado que la vía endocítica y el transporte vesicular desempeñan un papel importante en la regulación de la localización subcelular de la COMT. En resumen, se ha establecido una estrecha relación entre la COMT y las mitocondrias, evidenciándose una desviación hacia estas últimas al bloquear distintas vías de tráfico vesicular.

Los capítulos 3, 4 y 5 están sujetos a confidencialidad por el autor. 99 p., La presente Tesis Doctoral se basa en el desarrollo de tres nuevos sistemas de producción de PRP. El objetivo fue mejorar su contenido molecular, enriqueciendo, además de los factores de crecimiento plaquetarios como en el PRP convencional, también los extraplaquetarios. Así, el trabajo incluye el desarrollo del protocolo de los tres nuevos métodos de obtención de PRP, la caracterización celular y molecular del PRP resultante y el análisis de su bioactividad en cultivos celulares. La Tesis es de carácter internacional, ya que se ha realizado una estancia de investigación en la Universidad de Twente, donde se testó el nuevo PRP en un modelo de articulación osteoartrítica de rodilla en chip.

394 p., The skin is a complex vital organ composed of several layers. The middle layer, the dermis, is mainly composed of fibroblasts that produce the extracellular matrix (ECM) providing structural support. Recent research using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) has revealed previously unrecognized heterogeneity among dermal fibroblasts, challenging the traditional understanding of their organization.The work conducted in this thesis thoroughly analyses multiple human and mouse dermal scRNAseq datasets , uncovering a functional heterogeneity of fibroblasts never described. Fibroblast heterogeneity can be divided in major axes and minor populations, and more than 15 populations are described in each species. These populations were associated with specific functions, such as ECM production, immune response, involvement in skin adnexa such as hair follicles, or specialised supportive functions related to vasculature and nerve fibres. Additionally, while there are similarities between mouse and human fibroblasts, differences in their arrangement suggest species-specific variations in overall fibroblast function. This atlas serves as a valuable resource for researchers investigating skin function and diseases, enabling unbiased annotation of their datasets and facilitating the identification of compositional differences and novel fibroblast types associated with various skin conditions.

Anti-SARS-CoV-2 vaccines induce the production of IgG neutralizing antibodies against the Receptor Binding Domain of the S protein of the virus (IgG-antiRBD). In Bolivia, Sinopharm and Sputnik V were widely used vaccines during the pandemic. However, the mutations and changes suffered in SARS-CoV-2 were responsible for the new contagion outbreaks. Objective: To determine the sequence and structure alterations of RBD-SARS-CoV-2, which affect its complementarity by IgG-antiRBD neutralizing antibodies. Material and Methods: The sequences and crystallographic structures of RBD-SARS-CoV-2 were obtained from the Protein Data Bank database. For Multiple Sequence Alignment and Structural Alignment, Mega6 and Chimera1.15 were used. Results: The Multiple Sequence Alignment and Structural Alignment of the main epidemiological variants of SARS-CoV-2 showed that krakenXBB1.5 was the most divergent at the sequence level, while omicronBA2.75 presented more structural changes and greater steric hindrances when interacting withIgG-antiRBD, being the most contagious and most evasive to the immune response. Conclusions: The use of bioinformatics tools for monitoring the molecular changes of SARS-CoV-2 make it possible to predict the epidemiological behavior of new emerging variants and also promote improvement in prevention criteria, Las vacunas anti-SARS-CoV-2 inducen la producción de anticuerpos neutralizantes IgG contra el Dominio de Unión al Receptor de la proteína S del virus (IgG-antiRBD). En Bolivia, Sinopharm y Sputnik V fueron vacunas ampliamente utilizadas durante la pandemia. Sin embargo, las mutaciones y los cambios sufridos en SARS-CoV-2 fueron responsables de las nuevas olas de contagio. Objetivo: determinar las alteraciones a nivel de secuencia y de estructura del RBD-SARS-CoV-2, que afectan su complementariedad por anticuerpos neutralizantes IgG-antiRBD. Material y Métodos: se obtuvieron las secuencias y estructuras cristalográficas del RBD-SARS-CoV-2 a partir de la base de datos Protein Data Bank. Para el Alineamiento Múltiple de Secuencias y el Alineamiento Estructural, se emplearon Mega6 y Chimera1,15. Resultados: el Alineamiento Múltiple de Secuencias y Alineamiento Estructural de las principales variantes epidemiológicas de SARS-CoV-2 evidencian que, krakenXBB1.5 fue la más divergente a nivel de secuencia, mientras que, omicronBA2.75 presentó más cambios estructurales y mayores impedimentos estéricos al interaccionar con IgG-antiRBD, siendo la más contagiosas y más evasiva a la respuesta inmunológica. Conclusiones: el uso de herramientas bioinformáticas para el seguimiento en los cambios moleculares de SARS-CoV-2 permiten predecir el comportamiento epidemiológico de nuevas variantes emergentes y además promover el mejoramiento en los criterios de prevención.

Background: the Molecular Biology subject has presented insufficiencies in the teaching-learning process Holguín Faculty of Medical Sciences, which require a solution.Objective: to assess the effectiveness of a project-based professional learning methodology in the Molecular Biology subject as a way to improve the teaching-learning process.Methods: a development investigation was carried out at the Holguín Faculty of Medical Sciences during the 2021 academic year. Theoretical methods were used: historical-logical, analytical-synthetic and inductive-deductive; Empirical ones: the documentary analysis and the record of the qualifications of the questions of the first call of the final exam of the subject. Statistical tests were performed on the results of the final evaluation. A project-based learning methodology was used for the implementation of Molecular Biology, applied to a part of the content of the analytical program of the subject, which used didactic guides for students and methodological orientations for teachers, with the support of complementary videos to the lectures and hidden curriculum contents, related to the basic-clinical link with a professional orientation.Results: the final exam questions where its content was treated according to the learning project methodology showed significantly better results than those treated conventionally.Conclusions: the project-based learning methodology for the Molecular Biology subject was determined feasible for its application and provided the necessary flexibility for the transition from face-to-face teaching to distance learning., Fundamento: la asignatura Biología Molecular ha presentado insuficiencias en el proceso enseñanza aprendizaje en la Facultad de Ciencias Médicas de Holguín, las que requieren solución.Objetivo: valorar la efectividad de una metodología de aprendizaje profesional basada en proyectos en la asignatura Biología Molecular como forma de perfeccionar el proceso de enseñanza aprendizaje.Métodos: se realizó una investigación de desarrollo en la Facultad de Ciencias Médicas de Holguín durante el curso 2021. Se emplearon los métodos teóricos: histórico–lógico, analítico–sintético y el inductivo–deductivo; empíricos: el análisis documental y el registro de las calificaciones de las preguntas de la primera convocatoria del examen final de la asignatura. Se realizaron pruebas estadísticas a los resultados de la evaluación final. Se utilizó una metodología de aprendizaje basada en proyectos para la implementación de la Biología Molecular, aplicada a una parte del contenido del programa analítico de la asignatura, que utilizó guías didácticas para los estudiantes y orientaciones metodológicas a los profesores, con el soporte de videos complementarios a las conferencias y a contenidos de currículo oculto, relacionados con la vinculación básico–clínica con orientación profesionalizante.Resultados: las preguntas del examen final cuyo contenido fue tratado según la metodología de proyecto de aprendizaje mostraron significativamente mejores resultados que aquellas tratadas de forma convencional.Conclusiones: la metodología de aprendizaje basada en proyectos para la asignatura Biología Molecular se determinó factible para su aplicación y proporcionó la flexibilidad necesaria para el tránsito de la docencia presencial a la modalidad a distancia.

Las técnicas de biología molecular son fundamentales en medicina porque permiten el estudio a nivel molecular de enfermedades, el diagnóstico temprano, el desarrollo de terapias específicas y la medicina personalizada. Estas herramientas son esenciales para entender la base genética de las enfermedades y diseñar tratamientos precisos. El objetivo del estudio fue describir la cantidad y tipos de artículos que utilizaron técnicas de biología molecular, publicados en cuatro revistas de medicina peruana durante los años 2010 y 2019. En este trabajo se describieron 1415 artículos en cuatro revistas médicas peruanas entre artículos originales y reportes de casos. A pesar de un aumento en los reportes de casos sin técnicas de biología molecular, no hubo diferencias significativas entre artículos originales y reportes de casos. Las técnicas más comunes fueron: PCR, ELISA y electroforesis. Los hospitales e institutos de salud lideraron en cantidad de publicaciones. Estos resultados proporcionan valiosos datos para futuros estudios y perspectivas sobre el uso de estas técnicas en la producción científica médica peruana., Molecular biology techniques are fundamental in medicine because they allow the study of diseases at the molecular level, early diagnosis, the development of specific therapies and personalized medicine. These tools are essential to understand the genetic basis of diseases and design precise treatments. The objective of the study was to describe the number and types of articles that used molecular biology techniques, published in four Peruvian medical journals from 2010 to 2019. In this articles, one thousand, four hundred fifteen articles were described in four Peruvian medical journals, including original articles and reports of cases. Despite an increase in case reports without molecular biology techniques, there were no significant differences between original articles and case reports. The most common techniques were: PCR, ELISA and electrophoresis. Hospitals and health institutes led in the number of publications. These results provide valuable data for future studies and perspectives on the use of these techniques in Peruvian medical scientific production.

Changes in cellular homeostasis, such as oxidative stress, can trigger neurodegeneration, producing cellular pathological changes such as lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, and DNA damage. Reactive Oxygen Species (ROS), key deregulators of cellular stability, can be produced by different oxidoreductase enzymes and by the mitochondrial electron transport chain (mETC). Many of these enzymes are located in liquid-ordered membrane domains, so-called lipid rafts, dynamic platforms that participate in various signaling pathways. Moreover, changes in the lipidic environment of membrane proteins can lead to important functional disruptions. Lipidomic and enzymatic activity assays have been successfully performed in printed cell membrane homogenates (cell membrane microarrays, CMMAs). Based on that technology and the importance of liquid-ordered subdomains, we have developed a printed lipid raft and non-raft platform (raft membranes microarrays, RMMAs), with preserved native protein structure and lipidic environment. To evaluate the differences over lipidic environment in raft and non-raft subdomains in control, metabolic and oxidative stress conditions MALDI-MS assay was performed on RMMAs. Raft and non-raft subdomains presented a distinguishable fingerprint in every condition in both cell types (astrocytes and neurons). Distinguishable lipid fingerprints were also observed comparing raft subdomains obtained from cells in control, metabolic and oxidative stress situations. In the same way, raft and non-raft domains from control astrocytes and neurons are also distinguishable. Therefore, the lipidomic data obtained with this methodology can be used as a classification tool for samples of raft and non-raft subdomains with different treatments. As the lipidic environment is a key aspect for proper physiological enzymatic activity, changes over lipidome can lead to differences between enzymatic activities. To evaluate the differences in enzymatic activities, Los cambios en la homeostasis celular, como el estrés oxidativo, pueden desencadenar procesos neurodegenerativos, produciendo cambios patológicos celulares como la peroxidación lipídica, la modificación oxidativa de las proteínas y daños en el ADN. Las especies reactivas de oxígeno (ROS), los cuales son desreguladores clave de la estabilidad celular, pueden ser producidas por diferentes enzimas oxidorreductasas y por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (mETC). Muchas de estas enzimas se localizan en subdominios de membrana "ordenados", las llamadas balsas lipídicas (Raft), las cuales son plataformas dinámicas que participan en diversas vías de señalización. Además, los cambios en el entorno lipídico de las proteínas de membrana pueden provocar importantes alteraciones funcionales. Se han realizado con éxito ensayos lipidómicos y de actividad enzimática en homogeneizados impresos de membranas celulares (microarrays de membranas celulares, CMMA). Basándonos en esa tecnología y en la importancia de los subdominios ordenados en líquido, hemos desarrollado una plataforma impresa de muestras de membrana procedentes de membrana plasmática al uso y balsas lipídicas (Microarrays de membranas Raft, RMMAs), con estructura proteica nativa y entorno lipídico preservado. Para evaluar las diferencias sobre el entorno lipídico en los subdominios Raft y en las membranas no-Raft en condiciones de control, y de estrés metabólico y oxidativo, se realizó un ensayo MALDI-MS en las RMMAs. Estos subdominios presentaron una huella lipidica distinguible en cada condición en ambos tipos celulares (astrocitos y neuronas). También se observaron huellas lipídicas distinguibles comparando subdominios Raft obtenidos de células en situaciones de control, metabólicas y de estrés oxidativo. Del mismo modo, también son distinguibles los dominios Raft y no Raft procedentes de astrocitos y neuronas control. Por tanto, los datos lipidómicos obtenidos con esta metodología pueden utilizarse, Escuela de Doctorado, Doctorado en Investigación Biomédica