Search

1. 1. The presence of arylhydrocarbon hydroxylase (cytochrome P-450 IA1 dependent), glutathione S-transferase, two distinct forms of epoxide hydrolases and UDP-glucuronosyltransferases was detected in H5-6 hepatoma cell homogenates using model substrates, selective inhibitors and specific antibodies. 2. 2. The activity of arylhydrocarbon hydroxylase decreased strongly at the first days after plating and remained at a minimal value (1.5 pmol/min per mg) after 5 days of culture. 3. 3. The hydratation of trans -stilbene oxide catalyzed by the soluble form of epoxide hydrolase was very low (11.0 pmol/min per mg), whereas the hepatoma cells contained appreciable amounts of the membrane-bound epoxide hydrolase and glutathione S-transferase measured with cis -stilbene oxide as substrate (maximal specific activity: 1.46 and 2.73 nmol/min per mg, respectively). 4. 4. These cells also glucuronidated 1-naphthol efficiently (6 nmol/min per mg) and, at a lower extent, bilirubin (12 pmol/min per mg). 5. 5. Addition of fenofibrate (70 μM) into the culture medium for 1–3 days failed to significantly stimulate the activity of cytosolic epoxide hydrolase. Only bilirubin glucuronidation increased 2-fold after 2 days of presence of the drug.

After screening different human hepatoma cell lines, we observed that both HepG2 and PLC/PRF/5 naturally produced large amounts of gamma-glutamyltransferase. We optimized HepG2 cell culture conditions and observed that higher cell densities were obtained when cells were cultured on microcarriers, particularly when Cytodex 3 was used and that cell growth was optimal when DMEM, the basic medium, was supplemented with 5% fetal calf serum and 6 mmol/l glutamine. These culture conditions allowed us to produce the highest amounts of GGT after about 150 h of culture. The GGT obtained from HepG2 cells was partially purified and some of its physico-chemical properties characterized. Successive Con A gel chromatography separated the activity into two peaks, suggesting that GGT from HepG2 is not uniformly glycosylated. Papain-treated HepG2 GGT showed a Mr of about 120 kDa and migrated as a single-chain protein in SDS-PAGE. Immunological and kinetic properties of the GGT were similar to other human GGTs (liver, kidney and serum). It appears that HepG2 GGT could be a source for the preparation of a human enzyme reference material.

Eighteen IgGl monoclonal antibodies (blabs) have been produced against gamma-glutamyl transferase (GGT) from rat kidney. They were specific to the light subunit of the enzyme with affinity constants ranging from 0.3 to 7.5 108 M−1, while they did not react with GGT from other sources i.e. human and pig kidney, rat and guinea pig liver, suggesting species and organ specificity. Two of the blabs (N° 11 and 21) lost their immunoreactivities towards rat kidney GGT in the presence of N-acetyl-neuraminic acid, while immunoreactivities of the other blabs were unchanged. Furthermore, Mabs No 11 and 21 did not react with desialylated rat kidney GGT. These findings suggest that N-acetyl-neuraminic acid is involved in the epitopes recognized by these two Mabs.

gamma-Glutamyltransferase ((5-glutamyl)-peptide: amino-acid 5-glutamyltransferase, EC 2.3.2.2) of rabbit liver (detergent form) was purified 1100-fold in order to study its kinetic properties. Kinetic studies were conducted from pH 6.0 to 12.0 in the absence and presence of the acceptor substrate glycylglycine using gamma-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide as the donor. The existence of more than one binding site for both donor and acceptor is postulated on kinetic evidence such as donor substrate activation, donor substrate inhibition and acceptor substrate activation. Homotropic interaction is also observed, in the form of negative cooperativity, in donor substrate binding, in the absence of acceptor at pH less than 9.0 and positive cooperativity (n = 2), in the absence or presence of acceptor at pH greater than 9.0. Hydrolase reaction reaches a maximum of activity at pH 10 (pK 8.6). Transferase activity under conditions of maximal velocity is maximal at pH 9.0 (pK 7.1). The ratio of transferase activity/hydrolase activity is maximal at pH 7.0-7.5. At low donor substrate concentrations, maximal activity is attained at pH 7.5.

The metabolism of albendazole (ABZ), a benzimidazole anthelminthic, was studied in either microsomal preparations of human liver biopsies or cultured human hepatoma cell lines. Metabolites were analyzed by HPLC. Our data show that microsomes from human biopsies and two human cell lines, HepG2 and Hep3B, oxidize the drug to the sulfoxide very efficiently, whereas the third cell line tested, SK-HEP-1, does not. Both cytochrome P-450 dependent monooxygenases and flavin-containing monooxygenases appear to be involved in human ABZ metabolism. Using the cell line displaying the highest ABZ-metabolizing activity, HepG2, the cytotoxic and the inducing effects of the parent drug ABZ and of two primary metabolites, the sulfoxide and the sulfone were studied. These three chemicals provoked a rise in mitotic index resulting from cell division blockage at the prophase or at the metaphase (ABZ metabolites) stage, and ABZ was more cytotoxic than its metabolites. With regard to enzyme-inducing effects, our data clearly demonstrate that the sulfoxide and, to a lesser degree, the sulfone are potent inducers of some drug metabolizing enzymes (i.e., cytochrome P-488 dependent monooxygenases and UDP glucuronyltransferase), whereas ABZ fails to increase and even slightly decreases these enzymatic activities. In conclusion, the HepG2 human hepatoma cell line appears to be suitable for the study of many parameters of metabolism and action of ABZ and other structurally related compounds in humans.

The conditions for the measurement of gamma-glutamyltransferase (EC 2.3.2.2) activity of human plasma were studied at 30°C using the kinetic technique of Szasz [3]. The optimum pH in Tris (hydroxymethylaminomethane) buffer and 2-amino-2-methyl-1. 3-propanediol at a concentration of 100 mmol/l are 8.0 and 8.1. The kinetic characteristics of human plasma gamma-glutamyltransferase were studied using gamma- l -glutamyl p -nitroanilide and its carboxyl derivative as donor substrates. Glycylglycine was chosen as the best acceptor of the gamma-glutamyl radical. Under these conditions, we have shown that the inhibition by the donor substrate was more important at acidic pH and vanished at alkaline pH. This inhibition was obviously related to the presence of the acceptor, but did not vary with glycylglycine concentration. At pH 8.0, by increasing the acceptor concentration some competition occurs at the donor binding site, as reported by other authors in relation to the known ping-pong bi-bi enzyme mechanism for the gammaglutamyltransferase. Some displacement of donor substrate by increasing amounts of acceptor substrate could be observed at all pH values we studied. However, the influence of glycylglycine on the enzyme's maximum velocity and affinity for the donor substrate was also pH dependent. Studying the kinetic characteristics of the enzyme as a function of the pH suggests that the enzyme works with more than one active site at pH 7.5–8.0. Based on the results of this study, we propose measurement conditions for gamma-glutamyltransferase at 30°C in routine clinical chemistry without preference in the choice of substrate.

Summary We compared the effect of three different inducers on rabbit: phenobarbital, β-naphtoflavone and pregnenolone-16-α-carbonitrile. Phenobarbital incites an increase of hepatic cytochrome P-450 and gamma-glutamyltransferase, but it does not alter plasma gamma-glutamyltransferase. β-naphtoflavone induces a cytochrome P-448, whereas, at the proportion used, pregnenolone-16α-carbonitrile did not incite an induction of cytochrome P-450. Neither of the last two drugs increased the hepatic or plasma gamma-glutamyltransferase level.

Aurones [2-benzylidenebenzofuran-3(2H)-ones] are either natural or synthetic compounds, belonging to the flavonoid family. They are isomeric to flavones and provide a bright yellow color to the plants in which they occur. Today, a literature survey indicates that the related flavonoids have been studied not only for their physiological properties and effects on Nature, but also for their therapeutic potential. Aurones are recently attracting the interest of an increasing number of research groups, and, since the last review, some interesting advances have been made in understanding the aurones.In this review, we report the recent advances made on the synthetic routes towards aurones. We also highlight their activity in different biological areas, as well as applied genetic plant modifications to produce these colored compounds. Their synthesis, structure–activity relationships and the importance of the substitution pattern will also be mentioned. Finally, some aspects regarding the possible development of aurones will be discussed briefly.

Today, cancer has become a major public health problem and we estimate more than 1.3 million cancer-related deaths in Europe in 2013. The emergence of cancer resistances towards chemotherapeutic treatments forces to the discovery of new drugs. Natural organisms are a virtually inexhaustible source of molecules structurally very heterogeneous and having varied therapeutic applications. In the first part of this project, we studied the effect of curcumin, a molecule isolated from the roots of Curcuma longa, on the Wingless (Wnt) signalling pathway in the case of prostate cancer. Our results emphasize the chemopreventive potential of curcumin in prostate cancer. This natural molecule can be considered as an alternative modality, non-toxic to prevent the progression of prostate cancer and to eradicate the androgen-dependent early stage. The second part of the project involved the isolation of anti-cancer molecules from the carnivorous plant Dionaea muscipula. After selection and identification of a substance which turned out to be plumbagin, we investigated the possible reasons for the differential plumbagin sensitivity of hematopoietic cell lines. Our results suggest that this molecule affects the thiol groups of some proteins. In conclusion, the example of curcumin as chemopreventive agent in the development of prostate cancer and plumbagin in the treatment of leukemia have shown that naturally occurring substances are excellent candidates for the development of future anti-cancer drugs, Le cancer est un problème majeur de santé public avec une estimation de plus de 1,3 millions de décès en Europe pour l'année 2013. La recrudescence de résistances vis-à-vis des traitements chimio-thérapeutiques conduit à la recherche de nouvelles substances actives, notamment au sein d'organismes naturels, qui représentent une source infinie de molécules de structure très hétéroclite pouvant avoir des applications thérapeutiques très variées. Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié l'effet de la curcumine, molécule extraite à partir du rhizome du Curcuma longa, sur la voie de signalisation Wingless (Wnt) dans le cas du cancer de la prostate. Nos résultats ont démontré que cette molécule naturelle peut être considérée comme une alternative non-toxique pour prévenir la progression du cancer de la prostate et en éradiquer le stade précoce androgéno-dépendant. La seconde partie de notre projet a consisté en l'isolement de molécules anti-cancéreuses à partir de la plante carnivore Dionaea muscipula. Après avoir sélectionné et identifié une substance qui s'est révélé être de la plumbagine, nous avons étudié les raisons pouvant expliquer la différence de cytotoxicité de cette dernière sur des lignées hématopoïétiques. Nos résultats laissent penser que cette molécule affecte les groupements thiols de certaines protéines. En conclusion, ces études du potentiel chimiopréventif de la curcumine dans le cancer de la prostate et celui de la plumbagine dans les leucémies présentent ces molécules d'origine naturelle comme de bons candidats pouvant servir de base au développement des futurs médicaments anti-cancéreux

Au cours de mon doctorat puis de mes différents stages post-doctoraux, j'ai développé des approches de physiologie et génomique comparatives pour identifier et caractériser des médiateurs moléculaires impliqués dans le contrôle de la prolifération des cellules eucaryotes en réponse aux variations de l'environnement. Je me suis également attachée, dans des modèles biologiques divers, à replacer les mécanismes moléculaires et cellulaires étudiés dans un contexte plus général de physiologie de l'organisme. Depuis ma nomination en tant que Maître de Conférences à l'Université Nancy 1, je me suis focalisée sur l'influence des hormones stéroïdes sur la prolifération et la différenciation normale ou pathologique des cellules germinales. Le projet de recherche que je souhaite développer s'articule autour de 3 mots-clefs : tumeurs hormono-sensibles, perturbateurs endocriniens, voie non conventionnelle de signalisation oestrogénique. Le premier axe renferme un projet concernant les effets d'un mélange d'alkylphénols sur l'initiation et la progression tumorale dans un modèle de cancer testiculaire d'origine germinale puis de cancer mammaire, in vitro et in vivo. Le but est de caractériser le rôle éventuel de ERa36 dans ces processus afin de valider cette forme du récepteur des oestrogènes comme marqueur d'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les cellules hormono-. Le second axe s'inscrit dans un objectif à plus long terme qui sera de valider ERa36 comme marqueur prédictif de réponse aux traitements anti-tumoraux dans les cancers hormono-sensibles et en particulier dans le cancer du sein.

Au cours de mon doctorat puis de mes différents stages post-doctoraux, j'ai développé des approches de physiologie et génomique comparatives pour identifier et caractériser des médiateurs moléculaires impliqués dans le contrôle de la prolifération des cellules eucaryotes en réponse aux variations de l'environnement. Je me suis également attachée, dans des modèles biologiques divers, à replacer les mécanismes moléculaires et cellulaires étudiés dans un contexte plus général de physiologie de l'organisme. Depuis ma nomination en tant que Maître de Conférences à l'Université Nancy 1, je me suis focalisée sur l'influence des hormones stéroïdes sur la prolifération et la différenciation normale ou pathologique des cellules germinales. Le projet de recherche que je souhaite développer s'articule autour de 3 mots-clefs : tumeurs hormono-sensibles, perturbateurs endocriniens, voie non conventionnelle de signalisation oestrogénique. Le premier axe renferme un projet concernant les effets d'un mélange d'alkylphénols sur l'initiation et la progression tumorale dans un modèle de cancer testiculaire d'origine germinale puis de cancer mammaire, in vitro et in vivo. Le but est de caractériser le rôle éventuel de ERa36 dans ces processus afin de valider cette forme du récepteur des oestrogènes comme marqueur d'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les cellules hormono-. Le second axe s'inscrit dans un objectif à plus long terme qui sera de valider ERa36 comme marqueur prédictif de réponse aux traitements anti-tumoraux dans les cancers hormono-sensibles et en particulier dans le cancer du sein.

Recent studies suggest that the regulation of phosphatases by hydrogen peroxide may play an important role in cell signaling. In cancer cells, which often possess a pro-oxidative redox state, this regulation could be essential for tumor growth. CDC25 phosphatases (A, B and C) are key regulators of cell cycle progression. Sohn and Rudolph have shown that CDC25B and C are inactivated by hydrogen peroxide and reactivated by the thioredoxin/thioredoxin reductase system (trx/trxR), in vitro. Such regulation in cancer cells could open new therapeutic avenues since the inhibition of trxR or trx could induce a CDC25 inhibition and so prevent tumor cell multiplication. After verifying that CDC25 activity is sensitive to H202 and could be restored by trx/trxR system in vitro, the effects of hydrogen peroxide and that of two trx/trxR inhibitors (Auranofin and Acrolein) was tested on human breast adenocarcinoma cells (MCF7 and MDA-MB 231). These two cell lines exhibit differential expression level for trx1. In both cell lines, H202 could induce a cell cycle arrest in spite of the lack of a full CDC25 inhibition. The maintenance of the CDK phosphorylation state suggests that an efficient protective system exists for these phosphatases. The total inhibition of trxR by Auranofin led to cytotoxic effects and peroxide production in both cell lines. Similar results were obtained for MDA-MB 231 cells treated with Acrolein while MCF7 cells were found to be resistant to this compound. Auranofin could trigger a moderate oxidative stress in treated cells without affecting intracellular GSH content, trx1 oxidation and cell cycle distribution. However, this treatment could trigger double-strand DNA breaks, which could explain the cytotoxicity of Auranofin. Conversely, Acrolein could provoke a strong GSH depletion associated with a full oxidation of trx1 and a cell cycle arrest in MDA-MB 231 cells. Nevertheless, this cell cycle disruption was not due to CDK hyper-phosphorylation, suggesting that a total inhibition of the trx/trxR system does not trigger a full CDC25 inhibition. Furthermore, in order to bring additional knowledge about CDC25 and cell cycle oxidative regulation in breast cancer cells, we have studied the effects of the Mn-SOD over-expression in MCF7 cells. In this cell line, Mn-SOD expression level was found to be lower than in MDA-MB 231 cells. Our results showed that the cell cycle distribution and CDK phosphorylation are not affected by Mn-SOD over-expression. In conclusion, we have shown in this work that the CDC25 function in cell cycle regulation is independent of both a functional trx/trxR system and Mn-SOD expression level but that, under pro-oxidative conditions, a potent protective system maintains at least partially CDC25 dephosphorylation activity in breast cancer cells, De récentes études suggèrent que la régulation des phosphatases par le peroxyde d'hydrogène pourrait jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire. Dans les cellules cancéreuses qui possèdent un statut redox souvent pro-oxydant, ce mécanisme de régulation pourrait être crucial pour la prolifération tumorale. Les phosphatases CDC25 (A, B et C) sont des régulateurs de la progression du cycle cellulaire. Sohn et Rudolph ont montré que les CDC25B et C peuvent être inactivées par le peroxyde d'hydrogène et réactivées en présence du système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (trx/trxR), in vitro. L?existence d'une telle régulation dans des cellules cancéreuses pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques puisqu'une inhibition des trxR ou des trx pourrait induire une inhibition des CDC25 et ainsi prévenir la croissance tumorale. Après avoir vérifié que CDC25A était également sensible au peroxyde d'hydrogène et réactivable in vitro par le système trx/trxR, les effets du peroxyde d'hydrogène et de deux inhibiteurs du système trx/trxR, l'Auranofine et l'Acroléine, ont été testés sur des lignées d'adénocarcinome mammaire humain (MCF7 et MDA-MB 231). Ces deux lignées présentent des niveaux d'expression variables pour la trx1. Dans les deux types de cellules, H2O2 induit un arrêt du cycle cellulaire malgré l'absence d'inhibition totale des CDC25. La conservation de l'état de phosphorylation des CDK lors de ce traitement témoigne donc de l'existence d'un système protecteur efficace pour ces phosphatases. L'inhibition totale des trxR par l'Auranofine engendre des effets cytotoxiques et une production de peroxydes dans les deux lignées. Il en est de même pour les cellules MDA-MB 231 traitées par l'Acroléine alors que les cellules MCF7 sont totalement résistantes à cette molécule. Le traitement des cellules par l'Auranofine induit un stress oxydant modéré car il n'altère pas le taux intracellulaire de glutathion, n'induit pas d?oxydation des trx1 et ne modifie pas la répartition des cellules dans le cycle cellulaire. Toutefois, ce traitement induit des cassures de l'ADN qui peuvent expliquer la cytotoxicité de ce composé. L'acroléine au contraire provoque, dans les cellules MDA-MB 231, une importante déplétion en glutathion associé à une oxydation majeure des trx1 et à un arrêt du cycle cellulaire. Ce dernier ne semble toutefois pas dû à une hyper-phosphorylation des CDK, ce qui suggère qu'une altération complète du système trx/trxR n'induit pas une inhibition totale des CDC25. Afin d'apporter des éléments nouveaux pour la compréhension des mécanismes de régulation redox des CDC25 et du cycle cellulaire dans les cellules de cancer du sein, nous avons ensuite étudié les impacts d'une surexpression de la Mn-SOD dans les cellules MCF7 puisque ces dernières sous-expriment cette protéine par rapport aux cellules MDA-MB 231. Les résultats obtenus révèlent que la répartition des cellules dans le cycle cellulaire et la phosphorylation des CDK ne sont pas sensibles à ce changement d'expression. Dans ce travail nous avons donc pu mettre en évidence que le rôle des CDC25 dans la régulation du cycle cellulaire n'est pas dépendant de l'état de fonctionnalité du système trx/trxR ou du niveau d'expression des Mn-SOD mais qu'il existe un système protecteur puissant qui permet de maintenir au moins en partie l'activité de déphosphorylation des CDC25 en milieu pro-oxydant dans les cellules de cancer du sein

CDC25 phosphatases play an important role in cell cycle progression. Moreover, an overexpression of CDC25 was reported in numerous cancers, particularly in breast cancer, and is often correlated with a poor prognosis. CDC25 are represented by three isoforms: A, B and C encoded by distinct genes, all three submitted to an alternative splicing mechanism. Few studies suggested that some CDC25 splicing variants could be more involved in cancers than others, but no such study has so far been conducted in breast cancer.The first aspect of this study, referred to clinic, consists in the evaluation of different CDC25 splicing variants proportion in breast cancer, from the perspective of developing a new prognostic tool. This study was performed on two models. On the one hand, several mammary cancerous cell lines were characterized concerning CDC25 variants expression thanks to the development of a novel quantitative RT-PCR method. Interestingly, we observed an overexpression of A2 and B2 transcripts and an increase of C5/C1 ratio in multidrug resistant cell lines, suggesting a link between the expression of these variants and the resistance phenotype. On the other hand, this study was extended to the determination of CDC25 variants expression in mammary tumoral tissues in comparison to that of matched peritumoral tissues. Quantitative PCR results obtained for the 75 pairs of tissues tested showed an overexpression of CDC25A in 64% of tumors, mainly due to A1 variant (69%); of CDC25B in 55% of tumors, partially linked to B1 and B2 variants expression (47% and 21% respectively); and of CDC25C in 75% of tumors, the C5 variant being clearly more involved than C1 (overexpression in 86% and 43% respectively). We have finally established correlations between CDC25 transcripts expression and some tumor characteristics, as the tumor grade and a lack of estrogens receptors for CDC25A and CDC25B and the tumor size for CDC25C.The second part of this project consists in a mechanistic study regarding the regulation of CDC25 splicing in DNA damage conditions. The treatment of several breast cancer cell lines with different genotoxic agents (doxorubicin, camptothecin, etoposide, cisplatin and tert-butyl hydroperoxide) induces a modification of CDC25C splicing profile, consisting in a large increase in C5 variant proportion compared to that of C1 (both at mRNA and protein levels). This regulation occurs during the early response to DNA damage, before the onset of apoptosis and is associated with a cell cycle arrest. We have also shown that this modulation of CDC25C splicing is dependent of ATM/ATR kinases and independent of p53. Finally, these results allowed to highlight an additional regulation pathway in the cellular response to genotoxic stress in breast cancer cells., Les phosphatases CDC25 jouent un rôle important dans la progression du cycle cellulaire. En outre, une surexpression des CDC25 a été rapportée dans de nombreux cancers, notamment dans le cancer du sein, et est souvent corrélée à un pronostic défavorable. Les CDC25 sont constituées de trois isoformes : A, B et C codées par des gènes distincts, tous trois soumis à un mécanisme d?épissage alternatif. Quelques études ont suggéré que certains variants d?épissage de CDC25 pourraient être plus impliqués dans les cancers que d?autres, mais aucune étude de ce type n?a jusqu?à présent été menée dans le cancer du sein. Le premier aspect de cette étude, à visée clinique, consiste donc en l?évaluation de la proportion de différents variants d?épissage de CDC25 dans le cancer du sein, dans l?optique de développer un nouvel outil pronostique. Cette étude a été réalisée sur deux modèles. D?une part, différentes lignées cellulaires cancéreuses mammaires ont été caractérisées concernant l?expression des variants de CDC25 grâce à la mise au point d?une méthode de RT-PCR quantitative inédite. De manière intéressante, nous avons observé une surexpression des transcrits A2 et B2 et une augmentation du rapport C5/C1 dans les cellules résistantes aux traitements anticancéreux, laissant supposer un lien entre l?expression de ces variants et le phénotype de résistance. D?autre part, cette étude a été étendue à la détermination de l?expression des variants de CDC25 dans des tissus mammaires tumoraux par comparaison à celle des tissus péritumoraux appariés. Les résultats de PCR quantitative obtenus pour les 75 paires de tissus testées ont mis en évidence une surexpression de CDC25A dans 64% des tumeurs, principalement due au variant A1 (69%) ; de CDC25B dans 55% des tumeurs, en partie liée à l?expression des variants B1 et B2 (47% et 21% respectivement) ; et de CDC25C dans 75% des tumeurs, le variant C5 étant clairement plus impliqué que C1 (surexpression dans 86% et 43% des tumeurs respectivement). Nous avons finalement pu établir des corrélations entre l?expression des transcrits CDC25 et certaines caractéristiques anatomopathologiques des tumeurs, telles que le grade de la tumeur et un faible statut des récepteurs aux ?strogènes pour CDC25A et CDC25B et la taille de la tumeur pour CDC25C.Le second volet de ce projet consiste en une étude plus mécanistique portant sur la régulation de l?épissage des CDC25 en conditions de dommages à l?ADN. Le traitement de plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein par différents agents génotoxiques (doxorubicine, camptothécine, étoposide, cisplatine et tert-butyl hydroperoxyde) induit une modification du profil d?épissage de CDC25C, consistant en une forte augmentation de la proportion du variant C5 par rapport à celle de C1 (au niveau de l?ARNm et des protéines). Cette régulation a lieu au cours de la réponse précoce aux dommages à l?ADN, avant la mise en place de l?apoptose et est associée à un arrêt du cycle cellulaire. Nous avons par ailleurs montré que cette modulation de l?épissage de CDC25C est dépendante des kinases ATM/ATR et indépendante de p53. Ces résultats ont permis de mettre en lumière un mécanisme additionnel de réponse cellulaire à un stress génotoxique dans les cellules de cancer du sein.

The CDC25 phosphatases are important regulators of eukaryotic cell cycle progression and play a crucial role in the activation of cyclin-dependent kinases (Cdk) by dephosphorylation. CDC25s are attractive targets in cancer therapy because their over-expression was reported in various types of human malignancies, including breast cancer, and this has been correlated with either poor prognosis or tumor aggressiveness.Our study aims to evaluate the CDC25s as interesting targets in breast cancer treatment. This study reports the inhibitory activity of two tetrasulfides : diallyl- (DAS4) and dipropyl- (DPS4) tetrasulfides naturally occurring in garlic and onion, towards the human cell division cycle (CDC) 25 phosphatases. Both compounds have emerged as interesting irreversible inhibitors of the CDC25 isoforms A and C in vitro.Then, we have investigated the anticancer properties of DAS4 et DPS4 on both sensitive (MCF-7 and MDA-MB-231) and resistant (Vcr-R) human breast carcinoma cell lines. Experiments performed on cultured cells have showed that growth of both sensitive and resistant cells was significantly decreased by these tetrasulfides and appeared to be associated with a G2/M cell cycle arrest. In addition, our results also suggested that DAS4 and DPS4 induce apoptotis in MCF-7 cells without affecting reactive oxygen species production. Analysis of mechanisms implicated in apoptosis induction in MCF-7 cells after treatment with DAS4 et DPS4 have suggested the involvement of the Bcl-2 family members. Taken together, these results suggest phosphatases CDC25A and C as possible targets of naturally occuring polysulfides contributing to their anticancer properties., Les phosphatases CDC25 sont des enzymes clés qui interviennent dans la progression du cycle cellulaire en régulant l?activité des kinases dépendantes des cyclines (Cdk) par déphosphorylation. Ces phosphatases sont des cibles thérapeutiques intéressantes car leur surexpression, notamment dans le cancer du sein, a pu être corrélée au développement de résistance à certains agents anticancéreux ainsi qu?à un mauvais pronostic.Ce projet vise à évaluer le système des phosphatases CDC25 en tant que cibles intéressantes dans le traitement du cancer du sein.Lors de cette étude, nous nous sommes intéressés à deux composés organosoufrés naturellement présents dans l?ail et l?oignon, les diallyl- (DAS4) et dipropyl- (DPS4) tétrasulfures. Nous avons montré que ces composés étaient capables d?inhiber, de manière irréversible, les phosphatases CDC25A et C in vitro. Le potentiel anticancéreux des composés DAS4 et DPS4 a été confirmé sur des cellules d?adénocarcinome mammaire humain : MCF-7 et MDA-MB-231 (lignées sensibles) et Vcr-R (lignée résistante). Leur croissance est apparue significativement altérée par ces deux composés qui a pu être associée à un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M. Par ailleurs, nos résultats ont également suggéré l?existence d?une activité pro-apoptotique des composés DAS4 et DPS4 qui est indépendante de la production d?espèces réactives oxygénées. L?étude de l?induction de l?apoptose dans le cas des cellules MCF-7 a révélé l?implication des protéines de la famille Bcl-2.Ces résultats suggèrent que l?inhibition des phosphatases CDC25A et C serait un des mécanismes qui contribuerait à l?activité anticancéreuse des composés organosoufrés.

Glutathione S-transferases (GST) and glutathione peroxidases, (GPX), together with glutathione reductase (GSSR) catalyse essential reactions for cell defence from toxic agents such as anticancer drugs and/or reactive oxygen species. With glutathione as the central component, this metabolic pathway is activated in most tumours and linked to resistant phenotype. Two approaches have been developed in this work. 1) An epidemiological study, on 41 patients, showed higher glutathione contents and an increase of the above-mentioned glutathione-dependent enzymes in the breast tumours, resulting in the improvement of the intracellular redox status. The numerous correlations between the components of the glutathione system observed only in non-cancerous breast suggest a highly coordinated and organised system that is disrupted in cancerous breast. The increased levels of GSH contents and its related enzymes activities are correlated with various prognostic factors linked to cell proliferation, suggesting the incidence of these inductions in resistance and tumour aggressivenessin breast cancer. 2) A molecular study was performed on human breast adenocarcinoma cell line MCF-7 sensitive or resistant to doxorubicin and/or vincristine. GST as well as GPX activities and expressions were increased according to cellular resistance levels, whereas GSSR and glutathione contents decreased. We focused on the one hand on the role of GPX, that we selectively induced with selenium, which nonetheless did not improve the antioxidative defence and, on the other hand, on GSTT2 subunit overexpressed in vincristine resistant cells and whose 5' regulatory gene region was isolated in order to further study its expression. Resistant phenotype could result from a concomitantvariation of parai lei metabolic pathways, distinct from the early adaptive response to a defined cytotoxic agent., Les glutathion 5-transférases (GST) et peroxydases (GPX) associées à la glutathion réductase (GSSR) catalysent des réactions essentielles dans la prbtection des cellules contre les molécules toxiques comme les agents anticancéreux et les espèces réactives du stress oxydant. Centrées Sur le glutathion (GSH), les voies métaboliques ainsi composées sont activées dans la plupart des tumeurs et associées au phénotype résistant. Deux approches sont développées dans ce travail. 1)Une étude épidémiologique sur 41 patientes a permis de constater l'élévation des teneurs en glutathion et l'augmentation des activités associées dans le tissu mammaire cancéreux, améliorant nettement les conditions redox intracellulaires. Les nombreuses corrélations entre les composantes du système du GSH dans le sein non malade suggèrent une organisation hautement coordonnée, mais ayant totalement disparu dans le sein cancéreux. Les niveaux de GSH et des enzymes associées sont corrélés à divers facteurs pronostiques associés à la prolifération cellulaire, suggérant l'incidence de ces inductions dans la résistance et l'agressivité du cancer mammaire. 2)Une étude moléculaire a été menée sur des lignées d'adénocarcinome mammaire humain MCF-7 sensibles ou résistantes à la doxorubicine et à la vincristine. Les niveaux d'activité et d'expression des GST et GPX sont augmentés proportionnellement au degré de résistance, alors que la GSSR et les taux de glutathion suivent une évolution inverse. Nous avons focalisé notre attention sur le rôle de la GPX que nous avons induite sélectivement par le sélénium, mais sans amélioration visible de la protection antioxydante, et sur la sous-unité GSTT2, induite dans la lignée résistante à la vincristine et dont la région 5' régulatrice du gène a été isolée en vue d'étudier son expression. Le phénotype résistant résulterait donc de la modification concomitante de voies métaboliques parallèles distincte de la réponse adaptative précoce à un cytotoxique donné.