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Der Ribonukleinsäure (RNS) Stoffwechsel umfasst verschiedene Schritte, beginnend mit der Transkription der RNS über die Translation bis zum RNA Abbau. Poly(A) Schwänze befinden sich am Ende der meisten der Boten-RNS, schützen die RNA vor Abbau und stimulieren Translation. Die Deadenylierung von Poly(A) Schwänzen limitiert den Abbau von RNS. Bisher wurde RNS Abbau meist im Kontext von cytoplasmatischen Prozessen untersucht, ob und wie RNS Deadenylierung und Abbau in Nukleus erfolgen ist bisher unklar. Es wurde daher eine neue Methode zur genomweiten Bestimmung von Poly(A) Schwanzlänge entwickelt, welche FLAM-Seq genannt wurde. FLAM-Seq wurde verwendet um Zelllinien, Organoide und C. elegans RNS zu analysieren und es wurde eine signifikante Korrelation zwischen 3’-UTR und Poly(A) Länge gefunden, sowie für viele Gene ein Zusammenhang von alternativen 3‘-UTR Isoformen und Poly(A) Länge. Die Untersuchung von Poly(A) Schwänzen von nicht-gespleißten RNS Molekülen zeige, dass deren Poly(A) Schwänze eine Länge von mehr als 200 nt hatten. Die Analyse wurde durch eine Inhibition des Spleiß-Prozesses validiert. Die Verwendung von Methoden zur Markierung von RNS, welche die zeitliche Auflösung der RNS Prozessierung ermöglicht, deutete auf eine Deadenylierung der Poly(A) Schwänze schon wenige Minuten nach deren Synthesis hin. Die Analyse von subzellulären Fraktionen zeigte, dass diese initiale Deadenylierung ein Prozess im Nukleus ist. Dieser Prozess ist gen-spezifisch und Poly(A) Schwänze von bestimmten Typen von Transkripten, wie nuklearen langen nicht-kodierende RNS Molekülen waren nicht deadenyliert. Um Enzyme zu identifizieren, welche die Deadenylierung im Zellkern katalysieren, wurden verschiedene Methoden wie RNS-abbauende Cas Systeme, siRNAs oder shRNA Zelllinien verwendet. Trotz einer effizienten Reduktion der RNS Expression entsprechender Enzymkomplexe konnten keine molekularen Phänotypen identifiziert werden welche die Poly(A) Länge im Zellkern beeinflussen., The RNA metabolism involves different steps from transcription to translation and decay of messenger RNAs (mRNAs). Most mRNAs have a poly(A) tail attached to their 3’-end, which protects them from degradation and stimulates translation. Removal of the poly(A) tail is the rate-limiting step in RNA decay controlling stability and translation. It is yet unclear if and to what extent RNA deadenylation occurs in the mammalian nucleus. A novel method for genome-wide determination of poly(A) tail length, termed FLAM-Seq, was developed to overcome current challenges in sequencing mRNAs, enabling genome-wide analysis of complete RNAs, including their poly(A) tail sequence. FLAM-Seq analysis of different model systems uncovered a strong correlation between poly(A) tail and 3’-UTR length or alternative polyadenylation. Cytosine nucleotides were further significantly enriched in poly(A) tails. Analyzing poly(A) tails of unspliced RNAs from FLAM-Seq data revealed the genome-wide synthesis of poly(A) tails with a length of more than 200 nt. This could be validated by splicing inhibition experiments which uncovered potential links between the completion of splicing and poly(A) tail shortening. Measuring RNA deadenylation kinetics using metabolic labeling experiments hinted at a rapid shortening of tails within minutes. The analysis of subcellular fractions obtained from HeLa cells and a mouse brain showed that initial deadenylation is a nuclear process. Nuclear deadenylation is gene specific and poly(A) tails of lncRNAs retained in the nucleus were not shortened. To identify enzymes responsible for nuclear deadenylation, RNA targeting Cas-systems, siRNAs and shRNA cell lines were used to different deadenylase complexes. Despite efficient mRNA knockdown, subcellular analysis of poly(A) tail length by did not yield molecular phenotypes of changing nuclear poly(A) tail length.

The Roborovski dwarf hamster Phodopus roborovskii belongs to the Phodopus genus, one of the seven within Cricetinae subfamily. Like other rodents such as mice, rats, or ferrets, hamsters can be important animal models for a range of diseases. Whereas the Syrian hamster from the genus Mesocricetus is now widely used as a model for mild-to-moderate coronavirus disease 2019, Roborovski dwarf hamster shows a severe-to-lethal course of disease upon infection with the novel human coronavirus severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben., In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.

Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zyto, Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules

Die embryonale Neurogenese in Drosophila ist eine hochgradig koordinierte Abfolge von Zellschicksalsentscheidungen, die viele Ähnlichkeiten mit der Entwicklung des Nervensystems in Wirbeltieren aufweist. Diese Zellschicksalsentscheidungen sind räumlich und zeitlich koordiniert. Diese Zellen entstehen an stereotypen Positionen in jedem Segment und sind entlang zweier räumlicher Achsen angeordnet: der dorsoventralen und der anteroposterioren Achse. Neuroblasten teilen sich, um stereotype Zelllinien zu bilden, und die Zellen weisen charakteristische Zellmorphologien und -ziele auf, wobei die molekularen Mechanismen, die diese Merkmale bestimmen, noch weitgehend unbekannt sind. Jahrzehnte der Genetik haben einige Faktoren aufgedeckt, die für viele dieser Entscheidungen notwendig sind, aber ein Verständnis der einzelnen neurogenen Linien auf Genomebene war bis vor kurzem in vivo unmöglich. Ich habe mRNA aus Einzelzellen verwendet, um die Transkriptomdynamik von Schicksalsentscheidungen in der frühen Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Mein Ziel ist es, zu entschlüsseln, wie sich Zellen unterscheiden, wenn Entscheidungen getroffen werden, die für die Entwicklung des Nervensystems wesentlich sind. Ich habe Transkriptomdaten von einzelnen Zellen aus Zehntausenden von Neuroblasten während der gesamten embryonalen Neurogenese erstellt. Es gelang mir, spezifische neurogene Populationen und ihre Genexpressionsprofile entlang ihrer Differenzierungswege zu identifizieren. Ich konnte die komplizierten zeitlichen Achsen, die das sich entwickelnde embryonale Nervensystem formen, teilweise entschlüsseln - ein Prozess, der von der Fliege bis zum Menschen konserviert ist. Diese Arbeit hat die Identifizierung lokalisierter Marker und sogar spezifischer Neuroblasten ermöglicht. Dieses Verständnis kann nun mit Informationen über die einzelnen Zellschicksale kombiniert werden, aus denen diese Neuroblasten hervorgehen, wie z. B. ihre spezifischen neuronalen und glialen Schicksale., Embryonic neurogenesis in Drosophila is a highly coordinated sequence of cell fate decisions that bears many similarities to the development of the nervous system in vertebrates. These cell fate decisions are spatially and temporally coordinated. These cells arise at stereotypic positions in each segment and are arranged along two spatial axes: the dorsoventral axis and the anteroposterior axis. Neuroblasts divide to give rise to stereotypic lineages and the cells exhibit characteristic cell morphologies, branching patterns, and targets, the molecular mechanisms that determine these characteristics are still largely unknown. Decades of genetics have uncovered some factors necessary for many of these decisions, but understanding individual neurogenic lineages at the genome level has been impossible in vivo until recently. I have used Single cell mRNA to study the transcriptome dynamics that accompany important fate decisions in early nervous system development. My goal is to decipher how cells differ when decisions are made that are essential for nervous system development. This knowledge is invaluable for developing models for the in vivo mechanisms that allow individual cells in the nervous system to specify and differentiate. I have generated transcriptome data of single cells from tens of thousands of neuroblasts throughout embryonic neurogenesis. I was able to identify specific neurogenic populations and their gene expression profiles along their differentiation pathways. I was able to partially decipher the intricate temporal axes that shape the developing embryonic nervous system, a process that is conserved from fly to human. Single-cell transcriptomics has enabled the identification of localized markers and even specific neuroblasts. This understanding can now be combined with information about the individual cell fates that give rise to these neuroblasts, such as their specific neuronal and glial fates.

Diabetes ist ein weltweites Problem, das durch den Verlust oder die Dysfunktion der Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas verursacht wird. In seltenen Fällen entsteht Diabetes durch eine Mutation in einem einzigen Gen. Diese monogenetischen Formen des Diabetes können zur Identifizierung neuer Regulatoren der β-Zellen-Entwicklung und -Funktion beitragen. In der vorliegenden Arbeit habe ich neue putative Diabetes-assoziierte Gene untersucht, die zuvor durch „Next-Generation“ Sequenzierung in einer Gruppe von Kindern und Jugendlichen mit idiopathischem Diabetes festgestellt wurden. Insbesondere analysierte ich neuartige Mutationsvarianten in Genen kodierend für Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) und Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). Basierend auf den folgenden Kriterien wurden diese Transkriptionsregulatoren zur weiteren funktionellen Analyse priorisiert: Genetische Information, Patientenphänotyp und Expressionsprofil der Kandidaten Gene in Mauspankreas-Vorläuferzellen. Um die Rolle der Varianten während der pankreatischen Zelltypspezifizierung zu untersuchen, nutzte ich die CRISPR-Cas9 Methode in Kombination mit Stammzellendifferenzierung. Im Detail generierte ich diverse Stammzellen mittels CRISPR-Cas9, die die Mutationsvarianten der Patienten trugen und differenzierte diese zu β-ähnlichen Zellen. Weitere in vitro und Transkriptionsanalysen zeigten, dass die Variante c.C4661T in GLI2 die Entwicklung der β-ähnlichen Zellen beeinträchtigte, was für eine genetische Prädisposition zur Entwicklung von Diabetes verantwortlich sein kann. Zusätzlich nutzte ich diese Plattform, um neue extrinsische Faktoren zu untersuchen und zeigte, dass die fördernde Rolle von HC toxin (HDAC Inhibitor) und SLIT3 (ROBO Ligand) konserviert ist. Zusammenfassend habe ich eine Differenzierungsplattform etabliert, um die Rolle von genetischen und extrinsischen Faktoren für die Entwicklung des Pankreas und/oder β-Zellen zu untersuchen., Diabetes is a worldwide health problem caused by the loss or dysfunction of the insulin-secreting β-cells in the pancreas. Unelucidated forms of monogenic diabetes, arising from rare mutations in one single gene, represent invaluable models for identifying new targets of β-cell development and function. In this study, I focused on putative disease-associated genes for diabetes that have been previously identified by next-generation sequencing of a cohort of patients with puberty-onset diabetes. In particular, I investigated unique mutant variants in genes coding for Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) and Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). These transcriptional regulators were prioritized for functional analysis based on patient phenotype, expression level in pancreas progenitor cells and available genetic information. To investigate the role of the genetic mutant variants in pancreatic cell fate decisions and cell function, I used the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 genome editing technology in combination with human induced pluripotent stem cell (iPSC)-directed β-cell differentiation. Employing these approaches, I established several patient-like iPSC lines carrying the identified heterozygous missense variants. Specifically, functional experiments and whole transcriptome analysis showed that the variant c.C4661T in GLI2 impairs human β-cell differentiation and β-cell function, which might be responsible for a genetic predisposition to develop diabetes. In addition, I used the same iPSC-based differentiation model system to study novel extrinsic factors, namely the HDAC inhibitor HC toxin and the ROBO ligand SLIT3 and uncovered their conserved role in enhancing human β-cell development. Taking together, I established a human iPSC differentiation platform to study critical genes and extrinsic factors that are necessary for human pancreas development and/or β-cells.

Primitive extraembryonale Endoderm (pXEN) Stam-Zelllinien der Ratte repraesentieren wahrscheinlich die festgelegten Vorläufer des extraembryonalen. Die im mesenchymalen Zustand gehaltenen pXEN-Zellen können in vitro weiter zu parietalen und viszeralen Endoderm-ähnlichen Zellen differenzieren. pXEN-Zellen zusätzlich halten moderate Konzentrationen des ICM-Markers Oct4 aufrecht. Die Bedeutung von Oct4 in pXEN-Zellen ist jedoch unbekannt. Bei höheren Zelldichten, beobachteten wir eine erhöhte Oct4-Expression und gleichzeitig eine Tendenz zu Epithelialisierung (MET) und viszeral endodermaler (VE) Differenzierung. Um zu klären, ob die Oct4-Expression kausal beteiligt ist, modulierten wir die Oct4-Konzentration. Transienter Knockdown von Oct4 reduzierte tendenziell die Expression von MET / VE-assoziierten Genen; umgekehrt förderte die Doxycycline-induzierte Expression eines menschlichen Oct4-Transgens die MET / VE-Differenzierung und verhinderte die Bildung charakteristischer Gang-Strukturen. Im letzteren Fall ging dem MET eine anfängliche Zell-Verlängerung und eine erhöhte Zellmotilität voraus. Da ein GSK3-Inhibitor und Activin A auch den MET / VE-Phänotyp stimulierten, fragten wir uns, ob Oct4 über die Wnt/β-Catenin oder TGFβ Signalwege wirkt. Die verschiedene Schritte der Wnt/β-Catenin Signalgebung hemmen, blockierten die hOct4-induzierte MET- und VE-Expression nicht. Im Gegensatz dazu verhinderte Repsox, ein Inhibitor von Alk5 (TGFBR1), das hOct4-induzierte MET und die Expression von MET- und VE-Genen und stimulierte eher die Expression von parietalen Endoderm (PE) Genen. Zusammengefasst zeigen diese Daten eine Rolle für Oct4 bei der MET / VE-Differenzierung auf, wahrscheinlich durch Stimulation eines TGFβ Signalweges. Weiterführende Experimente sind erforderlich um zu bestimmen, wie die zwei Prozesse der MET- und VE-Differenzierung innerhalb der extraembryonalen Endoderm-Linie unterschieden und in Beziehung gesetzt werden., Rat primitive extraembryonic endoderm (pXEN) cell lines appear to represent the committed precursors of the extraembryonic endoderm. The pXEN cells maintained in the mesenchymal state can further differentiate to the parietal endoderm and visceral endoderm like-cells in vitro. In addition, pXEN cells maintain moderate levels of the ICM marker Oct4, a transcription factor that plays important roles in pluripotency, plasticity, and differentiation. However, the significance of Oct4 in pXEN cell lineage specification is unknown. We observed that rat pXEN cells show increased Oct4 expression at higher densities, a condition that also promotes their epithelialization (MET) and visceral endodermal (VE) differentiation. In order to elucidate whether the Oct4 expression is causally involved, we modulated the Oct4 levels. Transient knockdown of Oct4 tended to reduce the expression of MET/VE-associated genes; conversely, the doxycycline-induced expression of a human Oct4 transgene promoted MET/VE differentiation and prevented the formation of characteristic duct structures. In the latter case, the MET was preceded by an initial elongation and increased cell motility. Since GSK3 inhibitor and Activin A also stimulated the MET/VE phenotype, we then asked whether Oct4 acts through the Wnt/β-catenin or TGFβ pathways. Wnt inhibitors did not block the hOct4-induced MET and VE expression. By contrast, Repsox, an inhibitor of Alk5 (TGFBR1), prevented the hOct4-induced MET and the expression of MET and VE genes and rather stimulated the expression of parietal endoderm (PE) genes. Taken together, these data indicate a role for Oct4 in MET/VE differentiation via stimulation of TGFβ signaling. Further work is needed to determine how the two MET and VE differentiation processes are distinguished and related within the extraembryonic endoderm lineage.

Der Sekretionsweg ist essenziell für die Funktion von Zellen und beginnt, wenn mRNAs, die für Membran- und Sekretionsproteine codieren, an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebracht werden. Allerdings ist wenig darüber bekannt, inwiefern RNA-bindende Proteine zur Erkennung und Translation von ER lokalisierten mRNAs beitragen. In dieser Arbeit haben wir das humane RNA-bindende Protein HDLBP charakterisiert. Wir haben durch PAR-CLIP-, Zellfraktionierungs- und RNA-Seqeuenzierexperimente festgestellt, dass HDLBP an mehr als 80% aller ER lokalisierten mRNAs bindet. Analysen zu HDLBPs Bindungsmotiv haben gezeigt, dass HDLBP vorwiegend an ein CU-haltiges Motiv in der codierenden Sequenz (CDS) hauptsächlich von ER lokalisierten mRNAs bindet. Im Gegensatz dazu enthalten zytosolische HDLBP gebundene mRNAs weniger Bindungsstellen und diese treten sowohl in der CDS als auch in 3‘ untranslatierten Regionen auf. Dies zeigt, dass sich ER lokalisierte mRNAs von Zytosol lokalisierten mRNAs in ihrer Sequenzzusammensetzung hinsichtlich der HDLBP Bindungsstellen unterscheiden. Weitere Analysen des PAR-CLIP-Experiments ergaben, dass HDLBP mit RNA-Komponenten des Signalerkennungspartikels (SRP) und der 40S ribosomalen Untereinheit interagiert. Durch BioID-Experimente haben wir Proteine in unmittelbarer Nähe zu HDLBP bestimmt und konnten damit die Assoziation von HDLBP mit Komponenten des Translationsapparates und des SRPs bestätigen. Funktionelle Studien, bei denen wir CRISPR-Cas9 erzeugte HDLBP Knockout (KO) Zelllinien in Kombination mit Ribosomen-Profiling verwendet haben, haben gezeigt, dass HDLBP die Translation von mRNAs fördert, die an HDLBP gebunden und am ER lokalisiert sind. Letztlich haben in vivo Experimente mit Nacktmäusen ergeben, dass HDLBP KO eine Abnahme der Lungentumorbildung verursacht, was die Relevanz von HDLBP für die Tumorprogression hervorhebt. Insgesamt zeigt unsere Arbeit eine generelle Funktion von HDLBP bei der Translation von ER lokalisierten mRNAs., The secretory pathway is essential for proper cell functioning and starts when mRNAs encoding membrane and secretory proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER). However, little is known about the contribution of RNA-binding proteins to the recognition, localization and translation of ER-localized mRNAs. In this work, we characterized the human RNA-binding protein HDLBP. We identified that HDLBP binds to more than 80% of all ER-localized mRNAs by PAR-CLIP, cell fractionation and RNA-sequencing experiments. Analysis of the HDLBP binding motif showed that it predominantly binds to a CU-containing motif and forms high affinity multivalent interactions primarily in the coding sequence (CDS) of ER-localized mRNAs. In contrast, we identified that cytosolic HDLBP mRNA targets show less HDLBP binding sites randomly distributed between the CDS or 3’ untranslated regions. This indicates that ER-localized mRNAs per se differ from cytosol-localized mRNAs in their sequence composition with regard to HDLBP binding sites. Further PAR-CLIP analysis revealed that HDLBP interacts with RNA components of the signal recognition particle (SRP) and the 40S ribosomal subunit. We identified by BioID experiments proteins in close proximity to HDLBP and confirmed the association of HDLBP with components of the translational apparatus and the SRP. Functional studies using CRISPR-Cas9 HDLBP knockout (KO) cell lines in combination with ribosome profiling demonstrated that HDLBP promotes the translation of its ER-localized target mRNAs. We validated this finding by pSILAC experiments and detected the corresponding decrease in protein synthesis of proteins encoded by mRNAs that are bound by HDLBP and ER-localized. Lastly, in vivo experiments with nude mice showed that HDLBP KO resulted in a decrease of lung tumor formation highlighting the relevance of HDLBP for tumor progression. Overall, these results demonstrate a general function for HDLBP in the translation of ER-localized mRNAs.

Bakterien haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt, um sich an ständig wechselnde Umweltbedingungen anzupassen, darunter auch post-transkriptionelle regulatorische Mechanismen. Die Genexpression kann hierbei durch gezielten Abbau oder Stabilisierung von RNA durch Ribonukleasen (RNasen) reguliert werden. RNasen weisen je nach Spezies allerdings unterschiedliche Effekte auf Genexpression und bakterielle Physiologie, sowie verschiedene Strategien der Substraterkennung auf. Dies zeigt, dass unser Verständnis des RNA-Abbaus bei weitem nicht vollständig ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die Eigenschaften und Funktionen der endoRNase Y des humanpathogenen Bakteriums Streptococcus pyogenes zu studieren. Um Einblick in Funktion und Spezifität dieser RNase zu gewinnen, wurden deren genomweite Schnittpositionen (“targetome”) mit Hilfe von RNA-Sequenzierung identifiziert. Zur weiteren Analyse des RNase Y-abhängigen RNA-Abbaus wurde dieses Ergebnis mit dem “targetome” der drei 3′-5′-Exoribonukleasen (ExoRNasen) PNPase, YhaM und RNase R verglichen. Schließlich wurden die Anforderungen für die Prozessierung durch RNase Y und deren Rolle in der Regulation von Virulenzgenen in vivo anhand der speB mRNA, die einen wichtigen Virulenzfaktor codiert, untersucht. Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass RNase Y Substrate bevorzugt nach einem Guanosin schneidet und dieses Nukleosid essenziell für die Prozessierung der speB mRNA in vivo ist. Obwohl RNase Y die speB mRNA schneidet, unterstützen die Daten ein Modell nach dem RNase Y die Expression von speB auf transkriptioneller Ebene reguliert. Mit Hilfe des “targetome”-Vergleichs konnten wir ferner zeigen, dass RNase Y den RNA-Abbau in S. pyogenes initiiert und die dabei generierten 3′-Enden der RNA hauptsächlich von den 3′-5′-exoRNasen PNPase und/oder YhaM prozessiert werden. Zusammenfassend erweitern diese Erkenntnisse unser Verständnis der Funktionalität von RNase Y und des RNA-Abbaus in Gram-positiven Bakterien., Bacteria have developed a plethora of strategies to cope with constantly changing environmental conditions, including post-transcriptional regulatory mechanisms. With this regard, regulation of gene expression can be achieved by either the rapid removal or stabilization of RNA molecules by ribonucleases (RNases). RNases exhibit species-specific effects on gene expression, bacterial physiology and different strategies of target recognition, indicating that our understanding of the RNA degradation machinery is not yet complete. The aim of this thesis was to investigate the features and functions of endoRNase Y from the strict human pathogen Streptococcus pyogenes. To gain insight into the role and specificity of this RNase, we identified RNase Y cleavage positions (i.e. targetome) genome-wide by RNA sequencing. Next, to investigate the RNA degradation pathway depending on RNase Y, we compared the RNase Y targetome with the ones of the three 3′-to-5′ exoribonuclease (exoRNases), namely PNPase, YhaM and RNase R. Finally, to dissect the requirements for RNase Y processing and to decipher the role of RNase Y in virulence gene regulation, we studied the impact of RNase Y on speB mRNA, encoding a major virulence factor. This study reveals that RNase Y preferentially cleaves RNAs downstream of a guanosine and for the first time we were able to show that the presence of a guanosine residue is essential for the processing of speB mRNA, in vivo. Although RNase Y cleaves the speB mRNA, our data underpin a model in which RNase Y-mediated regulation of speB expression occurs at the transcriptional level. Using the targetome comparative approach, we demonstrated that RNase Y initiates RNA decay in S. pyogenes and that the RNase Y-generated RNA 3′ ends are usually further trimmed by PNPase and/or YhaM. Overall, these findings increase our understanding of RNase Y functionality and RNA degradation in Gram-positive bacteria.

Transkriptionsfaktoren (TFs) empfangen Signale in Signaltransduktionskaskaden und übersetzen diese in eine zelluläre Antwort. Dadurch ermöglichen sie es Zellen, Organen und Organismen sich an verändernde Umgebungsbedingungen anzupassen. In früheren Studien wurde gezeigt, dass viele TFs nach Aktivierung Oszillationen im Zellkern aufweisen. Ein Beispiel dafür ist p53. Als zentrales Protein im Rahmen der zellulären Stressantwort reguliert es nach DNA Schaden die Expression hunderter Zielgene die das Zellschicksal steuern. Anomalien in der Aktivität von p53 stehen im Zusammenhang mit schwerwiegenden Erkrankungen wie der Krebsentstehung. Die Dynamik der Akkumulation von p53 im Zellkern ist abhängig von der Art des DNA Schadens und korreliert mit der resultierenden zellulären Antwort. Obwohl dieser Zusammenhang mehrfach gezeigt wurde, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen jedoch weitgehend unerforscht. Mit der vorliegenden Arbeit soll ein Beitrag zum Verständnis dazu geleistet werden, wie p53 Oszillationen im Zellkern die Transkription von Zielgenen auf Einzelzellebene modulieren. Dazu wurden sieben Zielgene ausgewählt und mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in situ Hybridisierung und mathematischer Analyse charakterisiert. Es werden Ergebnisse der quantitativen, zeitaufgelösten mRNA Expression und der bursting Aktivität von Zielgenpromotoren mit Einzelzell- und Einzelmolekülauflösung dargestellt. Diese Analyse weist darauf hin, dass die Aktivierung von p53 nach DNA Doppelstrangbrüchen primär die Frequenz des stochastischen bursting der untersuchten Zielgene reguliert. Diese können anhand ihrer Promotoraktivität in drei Archetypen eingeteilt werden: anhaltend, transient und pulsierend, die jedoch nicht ausschließlich durch veränderte p53 Menge im Zellkern erklärt werden können. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Veränderungen im Acetylierungszustand der C-terminalen Lysinreste von p53 entscheidend für diese Gen-spezifische Regulation sind., Transcription factors (TFs) are receiver and compiler of cell signaling, transmitting incoming inputs into cellular responses that enable cells, organs and organisms to respond and adapt to a changing environment. In the past, it has been shown that many TFs exhibit oscillations of nuclear abundance over time when activated. One of these TFs is the tumor suppressor p53, a central hub in the signaling network regulating the cellular stress response, controlling cell fate decisions by changing the expression of hundreds of target genes. Aberrations in p53’s activity are related to severe human malignancies such as cancer. The dynamics of its nuclear accumulation are stimulus dependent and enable the p53 pathway to mediate distinct responses to cellular stress. However, the molecular mechanisms translating such dynamics to altered gene expression remain elusive. In this thesis, I analyzed how oscillations of p53 affect the transcriptional regulation of target genes in single-cells and at individual promoters. I chose a panel of seven targets and employed a combinatorial approach of single-molecule fluorescence in-situ hybridization and mathematical analysis. I present quantitative, time-resolved measurements of target gene mRNA expression and transcriptional bursting activity with single-cell and single-molecule resolution. The resulting data show characteristic principles how p53 nuclear accumulation increases transcriptional bursting upon stimulation and reveal gene-specific modulations. P53 target promoters are regulated by changing the fraction of active promoters, indicating burst frequency regulation. Based on this, genes can be grouped along three archetypes of promoter activity: sustained, transient and pulsatile. These archetypes cannot solely be explained by nuclear p53 levels or promoter binding of total p53. Instead, I provide evidence that the time-varying acetylation state of p53’s C-terminal lysine residues is critical for this gene-specific regulation.

Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen von Virulenz-assoziierten Genen in den Pathogenen Francisella novicida und Streptococcus pyogenes zu untersuchen. Kapitel eins befasst sich mit der Regulation des Virulenzfaktors Streptolysin S (SLS) von S. pyogenes. Wir untersuchten die Rolle der Ribonuklease (RNase) Y in der transkriptionellen und posttranstrikptionellen Regulation des Gens sagA. RNase Y begünstigte die Produktion einer kleinen RNA (sRNA) vom sagA Transkript, war jedoch nicht an der posttranskriptionellen Regulierung der sagA RNA beteiligt. Dennoch förderte RNase Y die Transkription von sagA indirekt. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die 5′- untranslatierte Region (UTR) der sgaA RNA eine Sekundärstruktur besitzt, die möglicherweise einen Liganden bindet und damit die Zugänglichkeit der ribosomalen Bindungsstelle beeinflusst. Die Deletion einzelner Abschnitte der 5′ UTR hat einen negativen Effekt auf die sagA Expression. Wir haben eine Methode entwickelt um die Aktivität von Riboswitches, (u.a. die sagA 5‘ UTR) zu analysieren und konnten damit drei putative Riboswitches in S. pyogenes validieren. In Kapitel zwei charakterisierten wir den Mechanismus mit dem CRISPR-Cas9 aus F. novicida (FnoCas9) die Expression bakterieller Lipoproteine (BLPs) unterdrückt, um dem Immunsystem des Wirtes zu entgehen. Wir zeigen, dass FnoCas9 eine duale Funktion besitzt, die es dem Protein ermöglicht nicht nur DNA zu schneiden, sondern auch Transkription zu regulieren. In dieser erstmals beschriebenen Aktivität bindet FnoCas9 an den tracrRNA:scaRNA Duplex, wodurch der Protein-RNA Komplex an einen DNA Abschnitt hinter dem Promoter der blp Gene bindet und somit deren Transkription verhindert. Diese Bindungsstelle besitzt ein protospacer-adjacent motif (PAM) und eine scaRNA-komplementäre Sequenz, an die der FnoCas9-RNA Komplex bindet, allerdings nicht schneidet. Dieses System könnte in Zukunft das Repertoire an CRISPR-basierten Anwendungsmöglichkeiten erweitern., The aim of this thesis was to study regulatory mechanisms of virulence-related genes in the bacterial pathogens Francicella novicida and Streptococcus pyogenes. Chapter one focuses on the regulation of the virulence factor streptolysin S (SLS) in S. pyogenes. First, we investigated the role of the ribonuclease (RNase) Y in the transcriptional and post-transcriptional regulation of SLS-coding gene, sagA. We found that RNase Y promotes the production of a small RNA (sRNA) from the sagA transcript but we observed no regulation at the post-transcriptional level. Yet, RNase Y promotes sagA transcription indirectly and affects hemolysis levels. We next showed that the sagA 5′ untranslated region (UTR) contains a secondary structure that is is possibly modulated by direct binding to a ligand and may affect the accessibility to the ribosomal binding site (RBS). Our results indicate that removing fragments of the 5′ UTR has a negative effect on sagA expression. We developed a method for testing the activity of putative riboswitches, including sagA 5′ UTR. Using this method, we validated three predicted riboswitches in S. pyogenes. In chapter two, we characterized the mechanism by which F. novicida CRISPR-Cas9 (FnoCas9) represses the expression of bacterial lipoproteins (BLPs), allowing evasion of the host immune system. We show that FnoCas9 is a dual-function protein that, in addition to its canonical DNA nuclease activity, evolved the ability to regulate transcription. In this newly-described mechanism, the non-canonical RNA duplex tracrRNA:scaRNA guides FnoCas9 to the DNA target located downstream of the promoter of the BLP-coding genes, causing transcriptional interference. The endogenous targets contain a protospacer-adjacent motif (PAM) and a sequence that is complementary to scaRNA, promoting FnoCas9 binding but not DNA cleavage. Engineering this system expands the toolbox of CRISPR applications by allowing repressing other genes of interest.