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Particular interest to harness the innate immune system for cancer immunotherapy is fueled by limitations of immune checkpoint blockade. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are detected in a variety of solid tumors and correlate with poor clinical outcome. Release of type I interferons in response to toll-like-receptor (TLR)7 and TLR9 activation is the pDC hallmark. Mouse and human pDC differ substantially in their biology concerning surface marker expression and cytokine production. Here, we employed humanized mouse models (HIS) to study pDC function. We performed a comprehensive characterization of transgenic, myeloid-enhanced mouse strains (NOG-EXL and NSG-SGM3) expressing human interleukin-3 (hIL-3) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) using identical humanization protocols. Only in HIS-NOG-EXL mice sufficient pDC infiltration was detectable. Therefore, we selected this strain for subsequent tumor studies. We analyzed pDC frequency in peripheral blood and tumors by comparing HIS-NOG-EXL with HIS-NOG mice bearing three different ovarian and breast tumors. Despite the substantially increased pDC numbers in peripheral blood of HIS-NOG-EXL mice, we detected TLR7/8 agonist responsive and thus functional pDCs only in certain tumor models independent of the mouse strain employed. However, HIS-NOG-EXL mice showed in general a superior humanization phenotype characterized by reconstitution of different myeloid subsets, NK cells and B cells producing physiologic IgG levels. Hence, we provide first evidence that the tumor milieu but not genetically introduced cytokines defines intratumoral (i.t.) frequencies of the rare pDC subset. This study provides model systems to investigate in vivo pro- and anti-tumoral human pDC functions.

The type I interferon (IFN) response is a principal component of our immune system that allows to counter a viral attack immediately upon viral entry into host cells. Upon engagement of aberrantly localised nucleic acids, germline-encoded pattern recognition receptors convey their find via a signalling cascade to prompt kinase-mediated activation of a specific set of five transcription factors. Within the nucleus, the coordinated interaction of these dimeric transcription factors with coactivators and the basal RNA transcription machinery is required to access the gene encoding the type I IFN IFNβ (IFNB1). Virus-induced release of IFNβ then induces the antiviral state of the system and mediates further mechanisms for defence. Due to its key role during the induction of the initial IFN response, the activity of the transcription factor interferon regulatory factor 3 (IRF3) is tightly regulated by the host and fiercely targeted by viral proteins at all conceivable levels. In this review, we will revisit the steps enabling the trans-activating potential of IRF3 after its activation and the subsequent assembly of the multi-protein complex at the IFNβ enhancer that controls gene expression. Further, we will inspect the regulatory mechanisms of these steps imposed by the host cell and present the manifold strategies viruses have evolved to intervene with IFNβ transcription downstream of IRF3 activation in order to secure establishment of a productive infection.

Fungal carbohydrate active enzymes (CAZy) are vital for various industrial applications such as the conversion of plant biomass to biofuels and bio-based chemicals. The thermophilic filamentous fungus Thermoascus aurantiacus is an intriguing host for cellulase production and produces considerable quantities of cellulases and xylanases which retain high activity above 65 °C. The goal of this thesis was to uncover (1) CAZy induction and (2) CAZy gene regulation in T. aurantiacus and (3) learn from classical fungal CAZy hypersecreting Neurospora crassa mutants how to improve fungal enzyme secretion to design improved genetic- and bioprocess engineering strategies. This work involved extensive methods development and established vital knowledge for improving cellulase production with T. aurantiacus. Xylan lead to secretion of high amounts of cellulases and xylanases, while simple C5 and C6 sugars and cellobiose failed to significantly induce CAZy expression in batch cultures, presumably due to carbon catabolite repression (CCR). The development of a continuous feed setup allowed to circumvent CCR while feeding low amounts of potential inducers into 50 mL shake flask cultures. One major obstacle that prevents employing new fungal strains is the lack of genetic transformation systems. Here we report on successful Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the thermophilic fungus T. aurantiacus, a producer of highly heat-stable plant cell wall degrading enzymes. We optimized the transformation efficiency of the newly developed protocol and overexpressed the transcriptional xylanase regulator xlnR, clr1 and clr2, which led to increase in xylanase activity of the mutant strain. Finally, we sought to learn from classical fungal CAZy hypersecreting mutants how to increase enzyme secretion in T. aurantiacus. The mutation causing CAZy hypersecretion in the long-known N. crassa exo-1 mutant was identified through genome resequencing and genetic tests: a premature stop in the F-box protein-encoding gene exo-1. As known for the exo-1 mutant, high invertase, amylase and pectinase activity was found in the corresponding deletion strain upon sugar depletion. While the exo-1 gene homolog is missing in T. aurantiacus, the enzyme hypersecretion phenotype could be successfully reverse-engineered through collaborators into the industrially employed thermophilic fungus Myceliophthora thermophila through CRISPR/Cas9, leading to high amylase secretion., Kohlenhydrat-aktive Enzyme (CAZy) von filamentösen Pilzen sind für verschiedene industrielle Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Der thermophile filamentöse Pilz Thermoascus aurantiacus ATCC 26904 produziert beträchtliche Mengen an Cellulasen und Xylanasen, die auch bei Temperaturen über 65 °C eine hohe Aktivität beibehalten. Wärmestabile Enzyme bieten zahlreiche Vorteile für die kosteneffiziente Herstellung von Biokraftstoffen. Das Ziel dieser Arbeit war es, (1) die CAZy-Induktion und (2) die CAZy-Genregulation von T. aurantiacus aufzuklären und (3) von klassischen CAZy hypersekretierenden Neurospora crassa Mutanten zu lernen, wie die Pilzenzymsekretion erhöht werden kann, um mit diesem Wissen verbesserte Genmodifikations- und Bioprozessentwicklungsstrategien zu generieren. Xylan führte zur Sekretion hoher Mengen an Cellulasen und Xylanasen, während einfache C5- und C6-Zucker und Cellobiose die CAZy-Expression in Batch-Kulturen nicht signifikant induzierten. Dies ist vermutlich auf Kohlenstoffkatabolitrepression (Englisch: carbon catabolite repression, CCR) zurückzuführen. Die Entwicklung eines neuartigen Testverfahrens zur Induktorenidentifikation, basierend fed-batch Prozessen von Zuckerinduktoren, ermöglichte es jedoch CCR zu umgehen. In dieser Arbeit wurde zudem eine erfolgreiche Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation des thermophilen Pilzes T. aurantiacus etabliert. Wir optimierten die Transformationseffizienz des neu entwickelten Protokolls und nutzten es zur Überexpression des Xylanasenegulators xlnR, clr1 und clr2 was zu einem Anstieg der Xylanaseaktivität der generierten Mutantenstämme führte. Zusätzlich wollten wir von klassischen CAZy hypersekretierenden Pilzmutanten lernen, wie die Enzymsekretion erhöht werden kann. Die Mutation, die eine CAZy-Hypersekretion in der seit langem bekannten N. crassa exo-1-Mutante verursacht, wurde durch Genom-Resequenzierung und genetischen Tests identifiziert: ein vorzeitiges Stoppcodon im F-Box-Protein-kodierenden Gen exo-1. Wie für die klassische exo-1-Mutante bekannt, wurde auch in einem entsprechenden Gen-Deletionsstamm nach dem Konsum freier Zucker im Medium eine hohe Invertase-, Amylase- und Pektinaseaktivität gefunden. Kooperationspartner konnten den Phänotyp der Enzymhypersekretion erfolgreich in den industriell eingesetzten thermophilen Pilz Myceliophthora thermophila über CRISPR/Cas9 reproduzieren.

Modern PCR-based analytical techniques have reached sensitivity levels that allow for obtaining complete forensic DNA profiles from even tiny traces containing genomic DNA amounts as small as 125 pg. Yet these techniques have reached their limits when it comes to the analysis of traces such as fingerprints or single cells. One suggestion to overcome these limits has been the usage of whole genome amplification (WGA) methods. These methods aim at increasing the copy number of genomic DNA and by this means generate more template DNA for subsequent analyses. Their application in forensic contexts has so far remained mostly an academic exercise, and results have not shown significant improvements and even have raised additional analytical problems. Until very recently, based on these disappointments, the forensic application of WGA seems to have largely been abandoned. In the meantime, however, novel improved methods are pointing towards a perspective for WGA in specific forensic applications. This review article tries to summarize current knowledge about WGA in forensics and suggests the forensic analysis of single-donor bioparticles and of single cells as promising applications.

Background Subclinical inflammation was shown to play a role in the context of cardiovascular disorder processes. American College of Cardiology/American Heart Association guidelines on cardiovascular risk assessment in specific clinical contexts recommend the use of C-reactive protein (CRP) measurement with high sensitive (hs)-CRP assays that meet the precision requirements for values Methods A multisite comparative study between hs-CRP and a new conventional CRP assay (Tina-quant) was performed to evaluate the possibility of using regular CRP assays for cardiovascular risk assessment. Results A satisfactory concordance was observed between regular CRP assays and the hs-CRP assay. Both assays met the analytical precision requirements at the different cutpoints tested (1.00, 2.00, and 3.00 mg/L). Conclusion These results suggest that this new regular CRP assay can be used for cardiovascular risk assessment, which is expected to provide substantial operational and financial advantages when compared with hs-CRP assays.

After its recent rediscovery, the Hula painted frog (Latonia nigriventer) has remained one of the world’s rarest and least understood amphibian species. Together with its apparently low dispersal capability and highly disturbed niche, the low abundance of this living fossil calls for urgent conservation measures. We used 18 newly developed microsatellite loci and four different models to calculate the effective population size (Ne) of a total of 125 Hula painted frog individuals sampled at a single location. We compare the Ne estimates to the estimates of potentially reproducing adults in this population (Nad) determined through a capture-recapture study on 118 adult Hula painted frogs captured at the same site. Surprisingly, our data suggests that, despite Nad estimates of only ~234–244 and Ne estimates of ~16.6–35.8, the species appears to maintain a very high genetic diversity (HO = 0.771) and low inbreeding coefficient (FIS = −0.018). This puzzling outcome could perhaps be explained by the hypotheses of either genetic rescue from one or more unknown Hula painted frog populations nearby or by recent admixture of genetically divergent subpopulations. Independent of which scenario is correct, the original locations of these populations still remain to be determined.

Unambiguous cell line authentication is essential to avoid loss of association between data and cells. The risk for loss of references increases with the rapidity that new human pluripotent stem cell (hPSC) lines are generated, exchanged, and implemented. Ideally, a single name should be used as a generally applied reference for each cell line to access and unify cell-related information across publications, cell banks, cell registries, and databases and to ensure scientific reproducibility. We discuss the needs and requirements for such a unique identifier and implement a standard nomenclature for hPSCs, which can be automatically generated and registered by the human pluripotent stem cell registry (hPSCreg). To avoid ambiguities in PSC-line referencing, we strongly urge publishers to demand registration and use of the standard name when publishing research based on hPSC lines., In this article Kurtz, Seltmann and colleagues propose a standard nomenclature and registry for human pluripotent stem cells. The nomenclature is based on fixed name elements and provides a unique identifier for PSC lines suitable for referencing over diverse data sources, registries, publications, and cell banks. Rigorous application is needed to reduce risks from misidentification and false referencing of lines and data.

Intimate swabs taken for examination in sexual assault cases typically yield mixtures of sperm and epithelial cell types. While powerful, differential extraction protocols to overcome such cell type mixtures by separate lysis of epithelial cells and spermatozoa can still prove ineffective, in particular if only few sperm cells are present or if swabs contain sperm from more than one individual leading to complex low level DNA mixtures. A means to avoid such mixtures consists in the analysis of single micromanipulated sperm cells. However, the quantity of DNA from single sperm cells is not sufficient for conventional STR analysis. Here, we describe a simple method for micromanipulating individual sperm cells from intimate swabs and show that whole genome amplification can generate sufficient amounts of DNA from single cells for subsequent DNA profiling. We recovered over 80% of alleles of haploid autosomal STR profiles from the majority of individual sperm cells. Furthermore, we demonstrate that in mixtures of sperm from two contributors, Y-STR and X-STR profiles of individual sperm cells can be used to sort the haploid autosomal profiles to develop the diploid consensus STR profiles of the individual donors. Finally, by analyzing single sperm cells from mock sexual assault swabs with one or two sperm donors, we showed that our protocols enabled the identification of the unknown male contributors.

Supplemental Digital Content is Available in the Text. In this interventional case series, 8 patients presenting macular telangiectasia Type 1 with macular edema were treated by intravitreal aflibercept. The favorable clinical response observed with this treatment is consistent with the profile of angiogenic factors analyzed in their aqueous humors., Purpose: To evaluate intravitreal aflibercept in macular telangiectasia Type 1 (MacTel 1) patients and measure their ocular angiogenic profile. Methods: Eight subjects with MacTel 1 refractory to bevacizumab, ranibizumab, or laser therapy and switched to aflibercept were included. Best-corrected visual acuity, central macular thickness, and cystic areas quantified on optical coherence tomography B-scans were assessed during 12 months. Perifoveal capillary densities were measured on optical coherence tomography angiography. Aqueous humor was sampled from six patients and eight control subjects undergoing cataract extraction. Growth factors were quantified using a multiarray immunoassay. Results: Over 12 months, patients received 6.6 ± 1.4 (range, 5–8) intravitreal aflibercept injections. Twelve months after switching to aflibercept, best-corrected visual acuity increased by ≥5 letters in 5 of 8 patients, compared with preaflibercept levels. Mean best-corrected visual acuity improved from 79.6 (∼20/50) to 88.0 (∼20/35) Early Treatment Diabetic Retinopathy Study letters (P = 0.042), and central macular thickness decreased from 434 ± 98 μm to 293 ± 59 μm (P = 0.014). Compared with control subjects, the profile of angiogenic factors in MacTel 1 eyes revealed no difference in vascular endothelial growth factor-A levels but significantly higher levels of placental growth factor (P = 0.029), soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 (sFlt-1; P = 0.013), vascular endothelial growth factor-D (P = 0.050), and Tie-2 (P = 0.019). Placental growth factor levels inversely correlated with both superficial and deep capillary plexus densities on optical coherence tomography angiography (P = 0.03). Conclusion: The clinical response to aflibercept coupled to the angiogenic profile of MacTel 1 eyes support the implication of the placental growth factor/Flt-1 pathway in MacTel 1.

Objective— We aimed to determine whether autoantibodies against apoA-1 (apolipoprotein A-1; anti-apoA-1 IgG) predict incident coronary artery disease (CAD), defined as adjudicated incident myocardial infarction, angina, percutaneous coronary revascularization, or bypass grafting, in the general population. We further investigated whether this association is modulated by a functional CD14 receptor single nucleotide polymorphism. Approach and Results— In a prospectively studied, population-based cohort of 5220 subjects (mean age 52.6±10.7 years, 47.4% males), followed over a median period of 5.6 years, subjects positive versus negative for anti-apoA-1 IgG presented a total CAD rate of 3.9% versus 2.8% ( P =0.077) and a nonfatal CAD rate of 3.6% versus 2.3% ( P =0.018), respectively. After multivariate adjustment for established cardiovascular risk factors, the hazard ratios of anti-apoA-1 IgG for total and nonfatal CAD were: hazard ratio=1.36 (95% confidence interval, 0.94–1.97; P =0.105) and hazard ratio=1.53 (95% confidence interval, 1.03–2.26; P =0.034), respectively. In subjects with available genetic data for the C260T rs2569190 single nucleotide polymorphism in the CD14 receptor gene (n=4247), we observed a significant interaction between anti-apoA-1 IgG and rs2569190 allele status with regards to CAD risk, with anti-apoA-1 IgG conferring the highest risk for total and nonfatal CAD in non-TT carriers, whereas being associated with the lowest risk for total and nonfatal CAD in TT homozygotes ( P for interaction =0.011 and P for interaction =0.033, respectively). Conclusions— Anti-apoA-1 IgG are independent predictors of nonfatal incident CAD in the general population. The strength of this association is dependent on a functional polymorphism of the CD14 receptor gene, a finding suggesting a gene–autoantibody interaction for the development of CAD.

Background Post-stroke infections occur in 20–36% of stroke patients and are associated with high morbidity and mortality rates. Early identification of patients at risk of developing an infection could improve care via an earlier treatment leading to a better outcome. We used proteomic tools in order to discover biomarkers able to stratify patients at risk of post-stroke infection. Methods The post hoc analysis of a prospective cohort study including 40 ischemic stroke patients included 21 infected and 19 non-infected participants. A quantitative, isobaric labeling, proteomic strategy was applied to the plasma samples of 5 infected and 5 non-infected patients in order to highlight any significantly modulated proteins. A parallel reaction monitoring (PRM) assay was applied to 20 additional patients (10 infected and 10 non-infected) to verify discovery results. The most promising protein was pre-validated using an ELISA immunoassay on 40 patients and at different time points after stroke onset. Results Tandem mass analysis identified 266 proteins, of which only serum amyloid A (SAA1/2) was significantly (p = 0.007) regulated between the two groups of patients. This acute-phase protein appeared to be 2.2 times more abundant in infected patients than in non-infected ones. These results were verified and validated using PRM and ELISA immunoassays, which showed that infected patients had significantly higher concentrations of SAA1/2 than non-infected patients at hospital admission, but also at 1, 3, and 5 days after admission. Conclusions The present study demonstrated that SAA1/2 is a promising predictor, at hospital admission, of stroke patients at risk of developing an infection. Further large, multicenter validation studies are needed to confirm these results. If confirmed, SAA1/2 concentrations could be used to identify the patients most at risk of post-stroke infections and therefore implement treatments more rapidly, thus reducing mortality. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1186/s12014-017-9162-0) contains supplementary material, which is available to authorized users.

The ability to rapidly generate and share molecular, visual, and acoustic data, and to compare them with existing information, and thereby to detect and name biological entities is fundamentally changing our understanding of evolutionary relationships among organisms and is also impacting taxonomy. Harnessing taxonomic data for rapid, automated species identification by machine learning tools or DNA metabarcoding techniques has great potential but will require their review, accessible storage, comprehensive comparison, and integration with prior knowledge and information. Currently, data production, management, and sharing in taxonomic studies are not keeping pace with these needs. Indeed, a survey of recent taxonomic publications provides evidence that few species descriptions in zoology and botany incorporate DNA sequence data. The use of modern high-throughput (-omics) data is so far the exception in alpha-taxonomy, although they are easily stored in GenBank and similar databases. By contrast, for the more routinely used image data, the problem is that they are rarely made available in openly accessible repositories. Improved sharing and re-using of both types of data requires institutions that maintain long-term data storage and capacity with workable, user-friendly but highly automated pipelines. Top priority should be given to standardization and pipeline development for the easy submission and storage of machine-readable data (e.g., images, audio files, videos, tables of measurements). The taxonomic community in Germany and the German Federation for Biological Data are researching options for a higher level of automation, improved linking among data submission and storage platforms, and for making existing taxonomic information more readily accessible.

Zellen der glatten Muskulatur sind überall im menschlichen Körper vorzufinden und übernehmen eine Vielzahl von Funktionen. Ihre Hauptfunktion ist die starke und effiziente Kontraktion. Damit regulieren sie unter anderem die Peristaltik im Magen-Darm-Trakt sowie den Druck in den Gefäßen und Bronchien. Glattmuskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Erkrankungen wie Asthma, COPD oder Bluthochdruck und besitzen daher einen hohen Stellenwert als Testsysteme für die präklinische Forschung. Für die Entwicklung neuer Wirkstoffe werden Zellsysteme benötigt, die möglichst genau die in-vivo Situation außerhalb des Organismus widerspiegeln. Dafür wurden im Zuge dieser Arbeit mittels der CI-SCREEN Immortalisierung neuartige glattmuskuläre Testsysteme generiert. Neben Glattmuskelzelllinien des Bronchus, der Pulmonalarterie und der Aorta gesunder Spender wurden Atemwegsglattmuskelzelllinien eines COPD Spenders etabliert. Die Analyse der Genintegration und –expression zeigt, dass für die Immortalisierung primärer Glattmuskelzellen die Gene Bmi1, E7, MYC, Nanog und E6 eine wichtige Rolle spielen. Die Aufrechterhaltung des Glattmuskelphänotyps wurde anhand von Genexpressionsanalysen und immunzytochemischen Färbungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass spezifische Markergene wie α-smooth muscle actin, Sm22-α oder Calponin in den generierten Linien sowie in den primären Zellen kaum exprimiert wurden. Die Expression dieser Gene konnte mittels der Medienzusätze TGF-β1 und B27 deutlich gesteigert werden. Außerdem wurde die Kontraktion der Zelllinien untersucht. Dabei wurde zunächst auf molekularer Ebene die Ausschüttung von Calciumionen nach Histamin-, Serotonin- oder Methacholinstimulation und somit die Expression der entsprechenden GPCRs festgestellt. Der Nachweis der Kontraktion der Zelllinien erfolgte anhand der Besiedelung dezellularisierter Lungenpräzisionsschnitte. Die Anwendung der Zelllinien und deren Potential für die Wirkstoffentwicklung wurde mittels eines klinisch relevanten Medikaments, dem Antihistaminikum Levocetirizin, getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass sich gesunde und erkrankte Glattmuskellinien deutlich unterscheiden und für die Inhibition des Histaminrezeptors gesunder Zellen 10-fach geringere Mengen an Levocetirizin ausreichten, verglichen mit den Zellen des COPD Spenders. Die Daten dieser Arbeit zeigen somit das große Potential der entwickelten Glattmuskelzelllinien als in-vitro Testsysteme für die Wirkstoffentwicklung., Smooth muscle cells are found throughout the human body and show a variety of functionalities. The most important function is the strong and efficient contraction. Thus, they are able to regulate the peristalsis in the gastrointestinal tract as well as the pressure of the vessels and bronchi. Smooth muscle cells are involved in diseases as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or hypertension and are important as test systems for preclinical studies. According to the development of new efficacious drugs, in vitro test systems, mimicking the human physiology, are highly desirable. Therefore, the aim of the present study has been the generation of novel and functional smooth muscle cell lines by the CI-SCREEN technology. In addition to smooth muscle cell lines of the bronchus, the pulmonary artery and the aorta of healthy donors, airway smooth muscle cell lines of a COPD donor have been established. The analysis of the integration and expression of the immortalizing genes show that the genes Bmi1, E7, MYC, Nanog and E6 play an important role in the immortalization of primary smooth muscle cells. The maintenance of the smooth muscle phenotype has been investigated by gene expression analysis and immunocytochemistry. It was found that specific marker genes, such as α-smooth muscle actin, calponin or Sm22α, were hardly expressed in the generated cell lines as well as in the primary cells. In order to increase the expression of these genes, various culture conditions have been tested. It turned out that TGF-β1 und B27 significantly increase the expression of smooth muscle specific genes. The usage of a calcium assay revealed the presence of important GPCRs, such as histamine, serotonin, and methacholine receptors, on the surface of the cells. The contraction has been shown by analysing resettled decellularized precision cut lung slices (PCLS). Related to the drug development, the usage of the cell lines has been investigated by a clinically relevant drug, the antihistamine levocetirizine. As result, differences between healthy and diseased smooth muscle cell lines were detected. Consequently, 10-times higher amounts of levocetirizine were necessary to inhibit the histamine receptor of the COPD cells in comparison to the amount for the inhibition of healthy cells. The data of the present study show the enormous potential of the developed smooth muscle cell lines as in vitro test systems for the drug development process.

Select residues in the biantennary sugar moiety attached to the fragment crystallizable of immunoglobulin G (IgG) antibodies can modulate IgG effector functions. Thus, afucosylated IgG glycovariants have enhanced cytotoxic activity, whereas IgG glycovariants rich in terminal sialic acid residues can trigger anti- inflammatory effects. More recent evidence suggests that terminal α2, 6 linked sialic acids can be attached to antibodies post IgG secretion. These findings raise concerns for the use of therapeutic antibodies as they may change their glycosylation status in the patient and hence affect their activity. To investigate to what extent B cell extrinsic sialylation processes modify therapeutic IgG preparations in vivo, we analyzed changes in human intravenous IgG (IVIg) sialylation upon injection in mice deficient in B cells or in mice lacking the sialyltransferase 1, which catalyzes the addition of α2, 6 linked sialic acid residues. By performing a time course of IgG glycan analysis with HILIC-UPLC-FLR (plus MS) and xCGE-LIF our study suggests that therapeutic IgG glycosylation is stable upon injection in vivo. Only a very small fraction of IgG molecules acquired sialic acid structures predominantly in the Fab- but not the Fc-portion upon injection in vivo, suggesting that therapeutic antibody glycosylation will remain stable upon injection in vivo.

Transcriptional regulators belonging to the PadR family contribute to resistance against antibiotics and small toxic compounds in many bacteria. The genome of the Gram-positive human pathogen Listeria monocytogenes contains 5 genes encoding proteins belonging to the PadR family. The transcriptome of mutants in four different PadR-like proteins was determined for L. monocytogenes EGD-e using RNA-sequencing. The RNA-sequencing data revealed that all four PadR-like transcription factors strongly repress a small set of genes comprising one or two transcriptional units. Using promoter-lacZ reporter strains, a natural compound collection was screened for substances inducing transcription of genes controlled by members of the PadR family. This screen identified the depsipeptide antibiotic aurantimycin A as an inducer of LftR-controlled gene expression. It could be shown that the lftR-controlled lieAB genes mediate resistance against aurantimycin. The LieAB transporter was shown to protect L. monocytogenes from aurantimycin induced lysis. This is the first description of an aurantimycin resistance mechanism. The system discovered may play a vital role for the survival, spread and persistence of L. monocytogenes in the soil, where it may come into contact with the aurantimycin-producing bacterium Streptomyces aurantiacus. Additionally, the operator of the transcriptional regulator LftR was characterized in systematic truncation and mutation studies. Genes controlled by another PadR-type transcription factor, LstR, were shown to be induced by the 16-membered macrolide antibiotic josamycin, but they were not involved in resistance against this antibiotic. One of the genes controlled by LstR, lmo0421, encodes a homolog to RodA or FtsW, which are involved in cell wall biosynthesis. However, under the conditions investigated, Lmo0421 did not possess RodA or FtsW functionality. The padR-like gene lmo0599 (renamed lltR) was important for growth of L. monocytogenes at low temperatures. The inactivation of lmo0599 impaired the growth of L. monocytogenes at 6°C. It was also shown that this phenotype depended on the overexpression of the gene lmo0600 in the absence of lltR., In vielen Bakterien regulieren PadR-typ Transkriptionsfaktoren Resistenz-mechanismen gegen toxische Substanzen oder Antibiotika. Im Genom des Gram-positiven Listeriose Erregers Listeria monocytogenes sind insgesamt fünf Gene enthalten, welche Proteine aus der PadR Proteinfamilie codieren. Mittels RNA-Sequenzierung wurden die Transkriptome von Mutanten in vier PadR-ähnlichen Proteinen bestimmt. Die Daten zeigten, dass die PadR-Typ-Transkriptionsfaktoren eine kleine Zahl an Genen sehr stark reprimieren. Mithilfe von Promoter-lacZ Fusionen der am stärksten reprimierten Gene wurde eine Naturstoffsammlung des DZIF auf Substanzen, welche die Genexpression induzieren, untersucht. Diese Experimente zeigten, dass LftR-kontrollierte Gene vom Depsipeptidantibiotikum Aurantimycin A induziert werden. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die LftR-kontrollierten Gene lieAB Resistenz gegen Aurantimycin vermitteln, da der LieAB Transporter L. monocytogenes vor Lyse durch Aurantimycin schützt. Dies ist die erste Beschreibung eines Resistenzmechanismus gegen Aurantimycin. Der entdeckte Mechanismus könnte eine wichtige Rolle für das Überleben und die Verbreitung von L. monocytogenes im Boden spielen, wenn es dort mit dem Aurantimycin-produzierenden Bakterium S. aurantiacus zusammentrifft. Zusätzlich wurde der Operator des Repressors LftR durch systematische Trunkierungs- und Mutationsstudien bestimmt. Gene, welche von einem weiteren Transkriptionsfaktor, LstR, reguliert werden, wurden durch das Makrolidantibiotikum Josamycin induziert. Sie hatten jedoch keinen Einfluss auf die Resistenz gegenüber Josamycin. Ein von LstR kontrolliertes Gen, lmo0421, kodiert für ein Protein mit Homologie zu RodA oder FtsW, welche an der Zellwandbiosynthese beteiligt sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass unter den getesteten Bedingungen Lmo0421 die Funktion von RodA oder FtsW nicht übernehmen konnte. Das Gen lmo0599 (umbenannt in lltR) war wichtig für das Wachstum von L. monocytogenes bei niedrigen Temperaturen. Nach Inaktivierung von lmo0599 war Wachstum bei 6°C nur eingeschränkt möglich. Es wurde auch gezeigt, dass dieser Phänotyp von der Überexpression des Genes lmo0600 verursacht wurde.

Trotz der rasanten Entwicklung molekulargenetischer Analysemethoden sind die Auslöser vieler Erbrankheiten bislang ungeklärt. Eine Identifikation der genetischen Ursache einer Erkrankung ist jedoch essenziell, um zusätzliche invasive Tests vermeiden, adäquate Therapiemaßnahmen in die Wege leiten, akkurate Prognosen stellen und eine entsprechende genetische Beratung anbieten zu können. Next Generation Sequencing (NGS)-basierte Techniken wie die Whole Exome Sequenzierung (WES) haben die humangenetische Forschung und Diagnostik in den letzten Jahren revolutioniert. Die WES ermöglicht die Sequenzierung der Exons aller proteincodierenden Gene von mehreren Individuen gleichzeitig und stellt ein hilfreiches Werkzeug bei der Suche nach neuen kranheitsrelevanten Genen im Menschen dar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung genetischer Ursachen verschiedenster Erkrankungen in konsanguinen Familien aus dem nahen und mittleren Osten mittels WES. Insgesamt wurden 43 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern untersucht, darunter viele mit Skelettdysplasien oder Neuropathien. In 22 Fällen (51%) konnte die entsprechende krankheitsverursachende Mutation ausfindig gemacht werden. In 21% der aufgeklärten Fälle wurden Sequenzvarianten detektiert, die in der Literatur bereits als pathogen beschrieben wurden, während 63% bisher noch unbekannte Mutationen in bereits als krankheitsrelevant beschriebenen Genen darstellten. Zudem konnten im Rahmen dieser Arbeit drei neue, für den Menschen krankheitsrelevante Gene identifiziert werden, solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) und MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 codiert für einen Transporter aus der Familie der solute carrier, der in der Plasmamembran verankert ist. In dieser Arbeit geleistete Analyseergebnisse konnten zu der Erstbeschreibung von homozygoten pathogenen SLC10A7-Mutationen als Ursache für eine Skelettdysplasie mit Amelogenesis imperfecta beitragen. Bei TBX4 handelt es sich um einen hochkonservierten Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung an der Ausbildung der unteren Extremitäten beteiligt ist. Homozygote pathogene TBX4-Mutationen wurden im Kontext dieser Arbeit erstmalig mit einer posterioren Amelie mit Becken- und Lungenhypoplasie in Verbindung gebracht. MIA3 ist ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das eine essenzielle Rolle bei der Proteinsekretion spielt. Die hier vorgestellten Patienten mit homozygoten pathogenen MIA3-Mutationen zeigen eine komplexe syndromale Erkrankung, die sich hauptsächlich in einer Kollagenopathie, Diabetes mellitus und milder mentaler Retardierung manifestiert und ein neues Krankheitsbild darstellt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erweitern somit zum einen das Mutationsspektrum verschiedener bekannter Krankheitsbilder und offenbaren zum anderen neue krankheitsrelevante Gene im Menschen., Despite the rapid development of molecular genetic analysis methods, the causes of many hereditary diseases are still unknown. However, it is essential to identify the genetic cause of a disease in order to avoid additional invasive tests, to initiate adequate therapeutic measures, to be able to provdide accurate prognoses, and to offer appropriate genetic counselling. Over the past years, Next Generation Sequencing (NGS)-based technologies such as Whole Exome Sequencing (WES) have revolutionized research and diagnostics in human genetics. WES enables sequencing of the exons of all protein-coding genes from several individuals simultaneously and is a powerful tool in identifying new disease-relevant genes in humans. The present work deals with the elucidation of genetic disease causes in consanguineous families from the Near and Middle East by means of WES. A total of 43 patients with various clinical phenotypes were examined, including many with skeletal dysplasias or neuropathies. In 22 cases (51%), the genetic cause of the disease could be found. In 21% of the solved cases, sequence variants were detected that were already described as pathogenic in the literature, while 63% showed previously unknown mutations in genes already described as disease-relevant in humans. In addition, three new disease-relevant genes could be identified within the scope of this work: solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) and MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 encodes a transporter from the family of solute carriers, which is anchored in the plasma membrane. The analysis results performed in this study could contribute to the first description of homozygous pathogenic SLC10A7 mutations as the cause of a novel skeletal dysplasia with amelogenesis imperfecta. TBX4 is a highly conserved transcription factor that is involved in the formation of the lower extremities during embryonic development. Homozygous pathogenic TBX4 mutations were associated for the first time with posterior amelia with pelvic and pulmonary hypoplasia in the context of this study. MIA3 is a transmembrane protein of the endoplasmic reticulum that plays an essential role in the secretory pathway. The patients presented here with homozygous pathogenic MIA3 mutations show a complex syndromal disease manifesting mainly in a collagenopathy, diabetes mellitus, and mild mental retardation, representing a novel clinical picture. The results obtained within the scope of this work expand on the one hand the range of mutations of various known diseases and on the other hand reveal novel disease-relevant genes in humans.

In der vorliegenden Arbeit werden die beiden Gene RHOBTB2 und CTCF in Zusammenhang mit geistiger Behinderung und neuronaler Funktion anhand von klinischen Daten, funktionell in humaner Zellkultur, und mit Hilfe der schwarzbäuchigen Taufliege Drosophila melanogaster als Modellorganismus charakterisiert und erforscht. Während von typischen Rho-GTPasen bekannt ist, dass sie eine wesentliche Rolle bei der kognitiven Funktion spielen, ist die Rolle der atypischen Rho-GTPase RHOBTB2 bei der Neuroentwicklung weitgehend unbekannt. Für den Chromatin-Organisator CTCF haben bereits frühere Untersuchungen gezeigt, dass Varianten eine Störung mit variabler geistiger Behinderung und häufig anderen begleitenden Anomalien verursachen. Bisher ist die Rolle von RHOBTB2 und CTCF für kognitive Funktionen jedoch nur unzureichend erforscht. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Charakterisierung von RHOBTB2- und CTCFassoziierter geistiger Behinderung. Darüber hinaus wird der Effekt einer Dosisänderung beider Gene in zellbasierten Untersuchungen sowie im Modellorganismus Drosophila umfassend charakterisiert, um mehr über ihre Rolle in neuronaler Entwicklung zu erfahren. Wir haben de novo Punktmutationen in den BTB-Domänen von RHOBTB2 als neue Ursache für eine epileptische Enzephalopathie identifiziert. Der Phänotyp von zehn Individuen umfasst eine schwere geistige Behinderung, eine früh einsetzende Epilepsie, eine postnatale Mikrozephalie und Bewegungsstörungen. Wir fanden heraus, dass in HEK293 Zellen der Spiegel an mutierten RHOBTB2 erhöht war. Zellen, die mit Proteasom-Inhibitoren behandelt wurden, wiesen interessanterweise vergleichbare RHOBTB2-Mengen zwischen Wildtyp und Mutante auf, was auf einen beeinträchtigten Abbau des mutierten RHOBTB2 Proteins über das Proteasom hinweist. In Übereinstimmung mit den humanen Phänotypen führten erhöhte Spiegel des orthologen Proteins RhoBTB in Drosophila zu schweren Bewegungsstörungen und Anfälligkeit für Krampfanfälle. Verringerte Spiegel führten zu verkümmerten multidendritischen Neuronen der Klasse IV mit stark reduzierten dendritischen Verzweigungen, was eine mögliche Rolle von RhoBTB bei der dendritischen Entwicklung impliziert. Darüber hinaus haben wir Mutations- und klinische Daten von 39 Patienten mit CTCF-Varianten gesammelt. Die Mutationen umfassten Deletionen, Punkt-, Spleiß- und Rastermutationen. Interessanterweise häuften sich alle Punktmutationen in den Zinkfingerkodierenden Regionen, während die meisten wahrscheinlich disruptiven Mutationen sich vor diesen Regionen befanden. Der Phänotyp der Patienten war sehr variabel und reichte von normalem IQ und leichter Lernbehinderung bis zu schwerer geistiger Behinderung und Verhaltensanomalien wie autistischen Merkmalen. Häufig traten zusätzliche Anomalien wie Mikrozephalie, Gedeihstörungen, Herzfehler, und Gaumenspalten auf. In HEK293- und HeLa- Zellen verursachten Punktmutationen in CTCF keine abnormale subzelluläre Lokalisation oder Aggregation. Die Transkriptomanalyse aus Lymphozyten von fünf Patienten ergab im Vergleich zu gesunden Kontrollen 3.828 deregulierte Gene, die für bekannte Gene für neurologische Entwicklungsstörung angereichert waren. Eine Dosisänderung des Drosophila- Orthologs Ctcf führte zu einer Beeinträchtigung der neurologischen Gesamtfunktion und einer Beeinträchtigung der Lern- und Gedächtnisleistung. Der Schweregrad der kognitiven Beeinträchtigung schien mit einer Verringerung der Ctcf-Dosis zu korrelieren. Eine hirnspezifische Rekonstitution der Ctcf-Dosis konnte die kognitiven Phänotypen in dem Courtship-Conditioning-Paradigm Assay beseitigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Punktmutationen in RHOBTB2 als ursächlich für eine entwicklungsbedingte und epileptische Enzephalopathie charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass das Drosophila-Ortholog RhoBTB eine wichtige Rolle für die neurologische Funktion und in der Dendritenentwicklung spielt. Darüber hinaus wurde die CTCF-bedingte geistige Behinderung und neurologische Entwicklungsstörung umfassend charakterisiert und der Pathomechanismus als Haploinsuffizienz oder Funktionsverlust abschließend bestätigt. Des Weiteren wurde die Wirkung einer Dosisänderung von Ctcf bei Drosophila hinsichtlich der neuronalen Entwicklung und der kognitiven Funktion weiter untersucht, was zur weiteren Aufklärung der spezifischen Rolle von CTCF für kognitive Funktion und Dysfunktion beiträgt. Die Ergebnisse dieser Studie leisten einen Beitrag zu der Verbesserung der Diagnose von Patienten in der molekularen Diagnostik. Darüber hinaus trägt diese Arbeit zum Verständnis der Pathogenese von Intelligenzstörungen bei. In the present work, the role of RHOBTB2 and CTCF in intellectual disability and neuronal function are characterized using clinical data, Drosophila melanogaster as a model organism and cell-based assays. While typical Rho GTPases are known to play essential roles in cognitive function, the role of the atypical Rho GTPase RHOBTB2 in neurodevelopment is largely unknown. For the chromatin organizer CTCF, previous research has shown that variants cause a disorder of variable intellectual disability with frequent other anomalies. So far however, the role of RHOBTB2 and CTCF in cognitive function is poorly understood. The focus of this thesis was the characterization of RHOBTB2 and CTCF-related intellectual disability. Moreover, the effect of dosage alteration of both genes in cell-based assays as well as in the model organism Drosophila is comprehensively characterized to specifically learn more about their role in neurodevelopment. We identified de novo missense variants clustering in the BTB domains of RHOBTB2 as causative for a developmental and epileptic encephalopathy. The phenotype of ten individuals includes severe intellectual disability, early-onset epilepsy, postnatal microcephaly, and movement disorders. We found that in HEK293 cell culture, mutant RHOBTB2 levels were elevated. Cells treated with proteasomal inhibitors, however, exhibited comparable RHOBTB2 levels between wildtype and mutant, indicating an impaired degradation of mutant RHOBTB2 via the proteasome. In accordance with the phenotype in humans, increased levels of the orthologue RhoBTB in Drosophila resulted in seizure susceptibility and severe gross neurological impairment. Decreased levels resulted in stunted outgrowth of dendrites of class IV dendritic arborization neurons, implying a probable role of RhoBTB in dendritic development. Furthermore, we gathered mutational and clinical data of 39 novel patients with variants in CTCF, encompassing deletions, missense, splice-site, and frameshift variants. Interestingly, all missense variants clustered in the zinc finger encoding regions, while most of the likely gene-disruptive variants were found prior to said regions. The phenotype was highly variable ranging from normal IQ and minor learning deficits to severe intellectual disability and behavioural anomalies like autistic features. Frequent additional anomalies were microcephaly, failure to thrive, heart defects, and cleft palate. In HEK293 and HeLa cells, missense variants in CTCF caused no abnormal subcellular localization or aggregation. Transcriptome analysis of lymphocytes of five individuals revealed 3,828 deregulated genes compared to healthy controls which were enriched for known NDD genes. Dosage alteration of the Drosophila orthologue Ctcf resulted in impaired gross neurological functioning and impaired learning and memory performance, and the severity of cognitive impairment seemed to correlate with decreasing Ctcf dosage. Brain-specific reconstitution of Ctcf dosage was able to rescue the cognitive phenotypes in the courtship conditioning paradigm assay. As part of this thesis, missense variants in RHOBTB2 were characterized as causative for a developmental and epileptic encephalopathy. The Drosophila orthologue RhoBTB was found to play an important role in neurological function and dendrite development. Furthermore, CTCF-related intellectual disability and neurodevelopmental disorder were comprehensively characterized and the pathomechanism confirmed as haploinsufficiency or loss-of-function. Moreover, the effect of dosage alteration of Ctcf in Drosophila was characterized regarding neurodevelopment and cognitive function, contributing to the elucidation of the specific role of CTCF in cognitive function and dysfunction. The findings in this study contribute to improve diagnosis of patients in molecular diagnostics. Ultimately, this thesis contributes to the understanding of pathogeneses of intelligence disorders.

Endophytes live in partial symbiosis inside a plant and have been detected in all tested plants. They belong to the group of fungi or bacteria and their ecological function is mostly unknown. The fungal endophytes of the genus Epichloë belong to a special group of endophytes. Epichloë endophytes live symbiotically inside cool season grass species and some of them are able to produce alkaloids toxic to vertebrates and insects. Their symbiosis is seen as mutualistic for the following reasons: the fungus provides the plant herbivore resistance by producing alkaloids, and it increases the plant’s drought tolerance as well as its biomass production. In return, the grass provides the fungus shelter, nutrients and dispersal. Epichloë endophytes are host specific and the ability to produce alkaloids differs between species. In order to estimate intoxication risks in grasslands, it is necessary to detect infection rates of different grass species with Epichloë endophytes, and to determine the genotypes and chemotypes of the Epichloë species as well as the produced alkaloid concentrations. Factors like land-use intensity or season may have an influence on infection rates and alkaloid concentrations. Also, different methodological approaches may lead to different results. In this doctoral thesis my general aim was to evaluate intoxication risks in German grasslands caused by Epichloë endophytes. For that I investigated infection rates of different grass species and the genotypes and chemotypes of their Epichloë endophytes in German grasslands (Chapter II). Furthermore, I compared alkaloid concentrations detected with dry and fresh plant weight and different analytical methods. I also detected possible changes on the influence of season or land-use intensity (Chapter III). Additionally, I examined infections with Epichloë endophytes and alkaloid concentrations in commercially available grass seed mixtures and determined how that influences the intoxication risk of grazing animals in Europe (Chapter IV). It is of agricultural interest to estimate intoxication risks for grazing livestock on German grasslands due to Epichloë infected grass species. Therefore, it is important to investigate which grasses are infected with the Epichloë endophyte, if the endophytes have the ability to produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids and if the alkaloids are indeed produced. I showed that Epichloë festucae var. lolii infecting agriculturally important Lolium perenne lacked the starting gene for ergovaline biosynthesis. Hence, vertebrate toxic ergovaline was not detected in the majority of the collected L. perenne plants. The detection of alkaloid concentrations is an important tool to estimate intoxication risk for vertebrates, but also invertebrates. My studies showed that the usage of dry plant material is crucial to quantify the correct alkaloid concentrations, and that alkaloid concentrations can vary depending on the detection method. Hence, the usage of validated, similar detection methods is important to be able to compare alkaloid concentrations from different studies. Nevertheless, the trends of seasonal changes and the influence of land-use intensity stayed the same, regardless if dry or fresh plant weight was used. Also, alkaloid concentrations were below toxicity thresholds on population level, regardless of the method used. Two commercially available forage grass and two commercially available turf grass seed mixtures were infected with Epichloë endopyhtes and alkaloids were detected. This might contribute to the spreading of Epichloë endopyhtes in Germany, therefore seed mixtures should be tested for Epichloë infections. My results indicate that the intoxication risk is generally low in Germany at the moment, although that might change due to climate change, an increase of monocultural land-use, or the seeding of Epichloë infected grass seeds., Endophyten leben, zumindest zeitweise, symbiontisch in Pflanzen und sind bisher in allen untersuchten Pflanzen nachgewiesen worden. Es handelt sich dabei um Pilze oder Bakterien und ihre ökologische Funktion ist meistens unbekannt. Eine spezielle Gruppe der Endophyten sind Pilzendophyten der Gattung Epichloë. Diese leben symbiontisch innerhalb von kaltgemäßigten Grasarten und einige sind in der Lage vertebraten- und/oder insektentoxische Alkaloide herzustellen. Die Symbiose wird meist als mutualistisch bezeichnet, weil der Pilz der Pflanze einen Herbivorenschutz durch die Produktion der Alkaloide und eine gesteigerte Trockenresistenz und Biomassesteigerung bietet. Das Gras hingegen bietet dem Pilz Unterkunft, Nährstoffe und Verbreitung. Epichloë Endophyten sind wirtsspezifisch und die Fähigkeit Alkaloide zu produzieren schwankt zwischen den Arten. Um das Vergiftungsrisiko im Grünland einzuschätzen, ist es nötig Infektionsraten verschiedener Grasarten mit Epichloë Endophyten, die Geno- und Chemotypen der Epichloë Arten, und die produzierten Alkaloidkonzentrationen zu bestimmen. Faktoren wie Landnutzungsintensität oder die Jahreszeit können Infektionsraten und Alkaloidkonzentrationen beeinflussen. Ebenso können Alkaloidkonzentrationen von methodischen Faktoren abhängen. In dieser Doktorarbeit habe ich Infektionsraten verschiedener Grasarten in Deutschland und die Geno- und Chemotypen ihrer Epichloë Endophyten untersucht (Kapitel II). Außerdem habe ich Alkaloidkonzentrationen mit Frisch- bzw. Trockengewicht gemessen und mit verschiedenen analytischen Methoden verglichen, um mögliche Änderungen beim Einfluss von Jahreszeiten oder der Landnutzungsintensität zu detektieren. Des Weiteren habe ich das Vergiftungsrisiko auf deutschen Grasflächen abgeschätzt (Kapitel III). Zusätzlich habe ich kommerziell erhältliche Grassaatgutmischungen auf Epichloë Infektionen und Alkaloidgehalt untersucht und habe versucht einzuschätzen, wie sich das auf das Vergiftungsrisiko von Weidevieh in Europa auswirkt (Kapitel IV). Die Einschätzung von Vergiftungsrisiken für Weidevieh aufgrund von Epichloë infizierten Grasarten auf deutschen Graslandflächen ist von landwirtschaftlichem Interesse. Deshalb ist es wichtig zu untersuchen, welche Grasarten mit Epichloë Endophyten infiziert sind, ob der Endophyt in der Lage ist vertebraten- oder insektentoxische Alkaloide zu produzieren und ob diese tatsächlich produziert werden. Ich konnte zeigen, dass Epichloë festucae var. lolii, welches das landwirtschaflich wichtige Lolium perenne infiziert, das Startgen für die Ergovalinbiosynthese fehlt. Deshalb wurde das vertebraten-toxische Ergovalin in der Mehrheit der gesammelten L. perenne Pflanzen nicht nachgewiesen. Die Detektion von Alkaloidkonzentrationen ist ein wichtiges Werkzeug, um das Vergiftungsrisiko für Vertebraten aber auch Invertebraten einschätzen zu können. Ich konnte zeigen, dass die Verwendung von trockenem Pflanzenmaterial essenziell ist, um korrekte Alkaloidkonzentrationen zu quantifizieren und dass Alkaloidkonzentrationen in Abhängigkeit von der Detektionsmethode schwanken können. Deshalb ist die Verwendung von validierten, ähnlichen Detektionsmethoden wichtig, um die Alkaloidkonzentrationen von verschiedenen Studien vergleichen zu können. Dennoch blieben die jahreszeitlichen Trends und der Einfluss von Landnutzungsintensität gleich, egal ob Trocken- oder Frischgewicht der Pflanze verwendet wurde und Alkaloidkonzentrationen lagen unter der Toxizitätsschwelle auf Populationsebene. Ich konnte außerdem zeigen, dass zwei kommerziell erwerbliche Futtergrasmischungen, sowie zwei Rasengrasmischungen mit Epichloë Endophyten infiziert waren und auch Alkaloide detektiert werden konnten. Das könnte zu einer weiteren Ausbreitung von Epichloë-Endophyten in Deutschland beitragen, weshalb Saatgutmischungen auf Epichloë Infektionen getestet werden sollten. Meine Ergebnisse zeigen, dass das Vergiftungsrisiko in Deutschland im Moment generell eher niedrig ist. Allerdings kann sich das auf Grund von Klimawandel, zunehmenden Monokulturen in der Landnutzung, aber auch der Aussaat von Epichloë infiziertem Saatgut ändern.

Tigecyclin ist ein Reserveantibiotikum der Stoffklasse der Glycylcycline und ein Tetracyclinderivat. Es findet Anwendung bei der Behandlung von Infektionen mit MRSA, VRE und gramnegativen Bakterien. Im NRZ für Staphylokokken und Enterokokken sind zwischen 2010 und 2015 über 90 tigecyclinresistente E.-faecium- und E.-faecalis-Isolate eingegangen. Aufgrund der umfangreichen Stammsammlung und des Modelcharakters für Antibiotikaresistenz bei grampositiven Bakterien sollte der Resistenzmechanismus gegenüber Tigecyclin bei Enterokokken aufgeklärt werden. Mithilfe von Effluxpumpeninhibitorexperimenten und Ganzgenomanalysen konnten sowohl eine Effluxpumpe tet(L) als auch ein ribosomales Protektionsprotein tet(M) als putative Resistenzgene bestimmt werden. Diese Tetracyclinresistenzgene sind in der Regel nicht in der Lage, eine Tigecyclinresistenz zu vermitteln. In weiteren Experimenten konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl eine Überexpression beider Resistenzgene als auch Mutationen innerhalb der Resistenzgene zu einem Resistenzphänotyp führen können. Dies wurde mit Expressionsanalysen innerhalb von L. monocytogenes als auch E. faecium bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass bei den plasmidkodierten Resistenzgenen tet(L) und tet(M) die Regulation der Transkription über die Plasmidkopienzahl erfolgte. Für das chromosomal kodierte Resistenzgen tet(M) konnte dies wiederlegt werden. Hier war vermutlich eine Deletion des sogenannten tet(M) Signalpeptides verantwortlich. Dieses Signalpeptid, direkt 5‘ seitig von tet(M) lokalisiert, ist für eine Dämpfung der Transkription verantwortlich. Eine Deletion führte zu einer verstärkten Expression. Ein weiterer Resistenzmechanismus ist die Mutation des ribosomalen Proteins S10. Das Protein befindet sich in direkter Nachbarschaft zur Tigecyclin-Bindestelle. Mutationen und Deletion führten zu einer geringen Steigerung der minimalen Hemmkonzentration. Eine Veränderung innerhalb des ribosomalen Proteins S10 konnte in 92 % der getesteten tigecyclinresistenten Isolate festgestellt werden. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung von tigecyclinsensiblen Enterokokken mit Tetracyclin einen direkten Einfluss auf den Tigecyclinresistenzmechanismus hatte und zu einer gesteigerten minimalen Hemmkonzentration führte. Diese Ergebnisse sind besonders besorgniserregend, da eine antibiotische Behandlung von Viehbeständen zu einer Verbreitung von resistenten zoonotischen Pathogenen beitragen könnte. Aufgrund des seltenen Einsatzes von TGC ist in den kommenden Jahren in Deutschland mit einem verstärkten Auftreten von TGC-resistenten Enterokokken nicht zu rechnen. Tigecyclin is a last line antibiotic of the glycylcycline class and a tetracycline derivative. It is used for the treatment of infections with MRSA, VRE and Gram-negative bacteria. Between 2010 and 2015, the NRZ for staphylococci and enterococci received more than 90 tigecycline-resistant E. faecium and E. faecalis isolates. Due to the large collection and the model character for antibiotic resistance in Gram-positive bacteria, the mechanism of resistance to tigecycline should be elucidated in enterococci. Using efflux pump inhibitor experiments and whole genome analysis, both an efflux pump tet(L) and a ribosomal protection protein tet(M) were identified as putative resistance genes. These tetracycline resistance genes are usually unable to mediate tigecycline resistance. In further experiments it could be shown that an overexpression of both resistance genes and mutations can lead to a resistance phenotype. This results were confirmed by expression in L. monocytogenes as well as E. faecium. The level of tigecycline resistance was in direct correlation to the transcription level of the plasmid-encoded resistance gene tet(L) and tet(M), regulated via the plasmid copy number. For an chromosomal coded tet(M) gene, an increase of copy’s on the genome could not be detected. For that a deletion within the signal peptide is responsible for an overexpression. This signal peptide, located 5' to the side of tet(M), is responsible for attenuation of transcription. A deletion led to an increased expression. Another mechanism is the mutation of the ribosomal protein S10. The protein is in close proximity to the tigecycline binding pocket. Mutations and deletions resulted in a slightly increase of the minimal inhibitory concentration. Alteration within the ribosomal protein S10 was found in 92 % of the tested tigecycline-resistant isolates. In a further experiment it was shown that the treatment of tigecycline-sensitive enterococci with tetracycline had a direct influence on the tigecycline resistance mechanism and led to an increased minimal inhibitory concentration. These results are of particular concern due to the high antibiotic consumption during livestock farming. This could possibly contribute to the spread of resistant zoonotic pathogens. An increased incidence of TGC-resistant enterococci is not expected in Germany within the next years due to the rare use as an antibiotic of last resort.

Siglec-H ist ein muriner Rezeptor, der hauptsächlich auf plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) und Mikroglia vorkommt. Aus pDCs ist bereits bekannt, dass es bei Verlust von Siglec-H zu einer erhöhten Expression von Typ-I IFN kommt. Da dies bei einer Infektion mit MCMV (dsDNA-Virus) zu einer Lupus-ähnlichen Autoimmunität 26 Wochen nach Infektion führt, sollte im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss anderer Virusarten auf die Entstehung einer Autoimmunerkrankung im Siglec-H ko untersucht werden. Dazu wurden Influenza und LCMV-Virus als Modelle gewählt. Sowohl das akute Infektionsmodell mit Influenza (ssRNA-Virus) als auch das chronische Modell mit LCMV (ssRNA-Virus) lösten keine Anzeichen einer Autoimmunität nach einem Zeitraum von ca. 6 Monaten aus. Es konnten nur geringe Mengen von Autoantikörpern sowie keine Nierenschäden detektiert werden. Da die Defizienz von Siglec-H eine erhöhte Typ-I IFN Antwort nach Stimulation hervorruft, sollten auch die Auswirkungen auf die Typ-III IFN Produktion in Stimulationsversuchen untersucht werden. Hierbei bestätigte sich der spezifische Einfluss von Siglec-H auf die IFN-I Signalkaskade, da die Produktion des Typ-III IFN IFNλ bei wt und Siglec-H ko gleichblieb. Des Weiteren konnten mittels RNA-Sequenzierung von naiven wt und ko pDCs insgesamt 33 verändert exprimierte Gene gefunden werden, 17 davon hoch- und 16 davon herunterreguliert. Der Großteil dieser Gen-Expression konnte wiederum mittels qPCR und ein Gen (CCR9) nochmals mittels Durchflusszytometrie validiert werden. Für die reduzierte Expression von CCR9 konnte zudem auch eine Auswirkung auf das Wanderverhalten der pDCs in vitro gezeigt werden. Zuletzt wurde auch die Rolle von Siglec-H auf pDCs in zwei Tumormodellen untersucht. Hierfür wurden B16F10 Melanomzellen entweder subkutan oder intravenös injiziert und das Tumorwachstum beurteilt. Hierbei gab es in beiden Modellen keine Unterschiede in WT- und Siglec-H ko Mäusen in Tumorwachstum und Gewicht. Da Siglec-H auch auf Mikroglia exprimiert wird, die Funktion dieses Rezeptors auf diesen Zellen aber noch nicht bekannt ist, wurde im Rahmen dieser Dissertation auch ein zweiter Fokus auf diese Fragestellung gelegt. Um dies zu beantworten, wurden zum einen primäre Mikroglia mit LPS, CpG oder R848 stimuliert und die Genexpression von Trem2, Ifnb und Tnfa mittels qPCR untersucht. Hierbei zeigte sich, dass im Siglec-H ko die Expression von Ifnb und Tnfa tendenziell nach der Stimulation mit CpG erhöht war. Im Krankheitsmodell der EAE waren allerdings keine Unterschiede in der Schwere der Ausprägung festzustellen. Auch zum Höhepunkt der Erkrankung gab es keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Zahl der Tregs und der Restimulierbarkeit der Zellen mit MOG-Peptid in der Milz. Sortierte Mikroglia zeigten an dem Zeitpunkt keine Unterschiede in der Expression der Gene Trem2, Ifnb, Tnfa, Spp1 und Msr1. Siglec-H is a murine receptor mainly expressed on plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and microglia. In pDCs it is already known, that the loss of Siglec-H leads to an increased expression of type-I IFNs. Since this induces a severe lupus-like autoimmune disease in a MCMV infection model (dsDNA virus), the question arose whether other virus types would also have an impact on the induction of autoimmunity in Siglec-H ko mice. For that, two infection models were used: Influenza (ssRNA virus) and chronic LCMV (ssRNA virus). In both models the mice did not show any signs of autoimmunity like ANAs, anti-dsDNA autoantibodies or blood urea-nitrogen, several weeks after infection. Since the deficiency of Siglec-H shows increased amounts of type-I IFN in pDCs after stimulation, it was also important to investigate the impact on the production of type-III IFNs. In stimulation assays of wt and ko pDCs no differences could be found in the expression of the type-III IFN IFNλ showing the specific impact of Siglec-H on the IFN signaling cascade. Through RNA-sequencing of naive wt and Siglec-H ko pDCs 33 differently expressed genes could be detected. 17 were upregulated and 16 downregulated. Most of them could be also validated through qPCR analysis and one gene (CCR9) additionally through flow cytometry. In correlation with the reduced expression of CCR9, it was also possible to show that Siglec-H ko pDCs display a reduced migration capacity towards the respective chemokine ligand CCL25. Lastly, two tumor models were used to investigate the role of Siglec-H on pDCs in a tumor environment. B16F10 melanoma cells were injected s.c. or i.v. and the tumor growth and weight were analysed. In both models no differences could be detected between wt and Siglec-H ko recipient mice. Another part of this dissertation focused on the function of Siglec-H on microglia, since its function is unknown. On the one hand primary microglia were used in an in vitro culture where they were stimulated with LPS, CpG or R848. The gene expression of genes and cytokines like Trem2, Ifnb and Tnfa was analysed via qPCR. Ifnb and Tnfa tended to be increased after stimulation with CpG in Siglec-H ko microglia, which was not significant due to lack of biological replicates. On the other hand, the autoimmune disease model of EAE was used. No differences could be detected in the EAE disease score between wt and ko mice. The amount of Tregs on the peak of disease was also comparable as well as the restimulatory capacity of splenocytes after MOG-treatment. Sorted microglia from this time point showed no differences in the gene expression levels of Trem2, Ifnb, Tnfa and Msr1.

“Woher wissen die Zellen, in welche Richtung sie sich teilen sollen?“ Zellschicksals-induktionen hängen von Zell-Zell-Kontakten im frühen Caenorhabditis elegans Embryo ab. Die stereotype Orientierung der Zellteilungsrichtungen garantiert eine korrekte Nachbarschaft der Zellen. Seit 1988 stehen die par-Gene für die Spezifizierung der anterior-posterior Asymmetrie der Zygote und für ihre erste Teilung. Nun wird hier gezeigt, dass PAR-3 und PAR-6 die links-rechts Richtung der frühen Teilung spezifizieren. 1997 wurde berichtet, dass der Wnt-Signalweg die ABar Spindel steuert, um den Kontakt zwischen ABara und MS zu garantieren. 2009 wurde LAT-1 identifiziert, das die ABal Teilung orientiert. 1987 und 2006 wurde ein autonomer Grundzustand für die Spindelausrichtung vorgeschlagen. Allerdings führt eine Inaktivierung von GPB-1, einem Gbeta-protein, zu zufälligen Teilungsrichtungen. Eine epistatische Analyse zeigt, dass GPB-1 downstream von MOM-5 (frizzled, ein Rezeptor für Wnt) und LAT-1 wirkt. Theoretisch sind zwei Kräfte ausreichend, um die Spindelausrichtung auf einer Zelle/Kugel zu definieren. Jedoch könnten diese vermutlich kein robustes System bilden, da die beiden Kräfte den nicht-linearen Sinus/Kosinus-Funktionen unterliegen, wenn sie die Teilungsrichtung in 3D präzise steuern müssen. Nicht nur deswegen sind mehr beteiligte Kräfte zu erwarten, sondern auch, weil LAT-1 und MOM-5 bisher nur die ABal oder ABar, aber nicht die ABpl und ABpr Teilungen beeinflussten. Mit einer systematischen Analyse wurden zwei Rezeptoren für die Spindelausrichtung identifiziert. Der erste ist EGL-15, ein Fibroblast-Growth-Factor-Rezeptor. Nach einer EGL-15 Inaktivierung teilen sich ABal und ABar nicht schräg zur a-p Achse wie im WT sondern parallel. Dies indiziert, dass EGL-15 die laterale Richtung spezifiziert. Der zweite ist GLP-1, ein Notch-Rezeptor, der bisher für die Induktion der ABp, ABalp und ABara Schicksale bekannt ist. Eine GLP-1 Inaktivierung verändert die Spindelausrichtung von ABar und ABpr nur schwach. Allerdings führt die Doppelinaktivierung von GLP-1 und LAT-1 zu einem starken Phänotyp in ABpl und ABpr. Umfängliche statistische und bioinformatische Analysen indizieren, dass jeder Signalweg die Spindelausrichtung spezifisch und abhängig von der Blastomer-Identität reguliert. Letzlich biete ich ein Modell an, das die zuvor mysteriöse, an die Blastomer-Identitäten gebundene Spezifizierung der Spindelausrichtungen mit Hilfe von vier kombinatorischen Codes erklärt., “How do cells know in which orientation to divide?” The inductions of cell fates in the early embryo of Caenorhabditis elegans depend on cell-cell contacts. Therefore, stereotyped cleavage directions are essential to create the appropriate neighborhoods of cells. Starting 1988 it was reported that the par-genes organize the anterior-posterior axis of the zygote and its first cleavage. Suprisingly, this work shows that PAR-3 and PAR-6 specify the left-right cleavage direction in the early embryo. 1997 it was reported that the Wnt-pathway is essential to turn the ABar spindle to guarantee that ABara touches MS and in 2009 that LAT-1 is necessary to prevent ABala touching MS. In 1987 and 2006 an autonomous schedule of cell division orientations was proposed. However, reducing GPB-1, a Gbeta-protein required non-autonomously, causes cells to divide randomly. An epistatic analysis shows that GPB-1 functions downstream of MOM-5 (frizzled, a receptor for Wnt) and LAT-1, which excludes the existance of an autonomous schedule. Theoretically, two forces are sufficient to specify a cleavage axis on a cell/sphere. However, these forces are subjected to the sine or cosine, which require a very fine tuning of forces, which appears incompatible with a robust control of spindle directions. Therefore, more forces may be involved, a conjecture corroborated by the fact that for MOM-5 nor LAT-1 division defects in ABpl or ABpr were reported before. A systematic search uncovered two additional receptors involved in aligning of spindle directions. The first is EGL-15, a Fibroblast Growth Factor Receptor. After a reduction of EGL-15 activity, ABal and ABar divide nearly parallel into the a-p direction compared to wildtype, which indicates that it specifies the lateral direction. The second is GLP-1, a Notch receptor, so far described to induce the ABp, the ABalp and ABara fates. Reducing GLP-1 alters the ABar and ABpr spindle directions only slightly. However, a double inactivation of LAT-1 and GLP-1 causes a strong phenotype in ABpl and ABpr. Both receptors were previously not linked with the coordination of cell cleavage directions. Extensive statistical and bioinformatic analyses are compatible with the notion that the four pathways regulate spindle orientations independently in the four blastomeres. The blastomeres may aquire their initially mysterious individuality/identity coupled to their specific spindle directions via four combinatorial codes assigned by the pathways.

Misregulation of gene expression can result in broad types of diseases and abnormalities. For elucidating the molecular mechanisms underlying evolution, development and disease, the 2% protein-coding regions in the human genome have been studied for decades, but the the 98% non-coding regions remain less understood. Many studies have revealed that evolutionary conserved non-coding elements (CNEs) act as cis-regulatory elements (CREs). Nevertheless, not all CREs are evolutionary conserved and, hence, the identification of CREs has proved challenging. Some CREs work cooperatively to regulate gene expression. Together with their target gene(s), these CREs form regulatory units. For instance, topologically associating domains (TADs) are large regulatory units in the genome, controlling and restricting the interactions between genes and CREs. Many studies have found the disruption of TADs can lead to gene expression misregulation. This thesis aimed at characterizing regulatory units. In particular, we explored the mechanisms by which regulatory unit disruption can lead to changes in gene expression in evolution, development, and disease. The first part of this thesis focused on the identification and characterization of small regulatory units consisting of two CREs. We identified 5,500 pairs of adjacent CNEs (to which we further refer as “CNE-CNE pairs”) in the human genome with either expanded, conserved or contracted inter-CNE sequences compared to the common mammalian ancestor. Particularly, the CNEs in CNE-CNE pairs with conserved and mildly contracted inter-CNEs sequences were most likely to perform as active or poised enhancers; in addition, both CNEs of the pairs exhibited similar epigenetic profiles, suggesting that the CNE-CNE pairs tend to act as small regulatory units. Furthermore, transposon deletions and insertions were associated with the contraction or expansion of inter-CNE sequences, indicating that transposon activity might disrupt the link between the two CNEs in the CNE-CNE pairs, leading to a loss of cis-regulatory function. Our study identified novel regulatory units, and highlighted the existence of cooperative interaction between adjacent CREs in the regulatory units that are distance-sensitive and can be disrupted by transposon activity. Our findings contribute to understanding the mechanism by which selective forces act on CREs in the context of evolution and human genetic diseases. The second part of this thesis investigated the mechanisms by which regulatory units can be disrupted, leading to gene expression misregulation in disease. To address this, we first constructed 1,467 consensus TADs in the “normal genome” and 1,622 consensus TADs in the “cancer genome”. To evaluate the prognosis value of knowing the location of structural variants such as copy number variants (CNVs) within the TADs in cancer patient survival outcome, we applied Cox regression analysis. In this manner, we identified 35 prognostic TADs; 54% of these TADs did not contain any genes with a known association to cancer causality, indicating that a large fraction of the TADs have prognostic value independently of coding variants. Furthermore, 34% of the 35 prognostic TADs underwent strong structural perturbations in the cancer genome. Hence, the prognostic value of at least a fraction of the 35 TADs appeared to be associated with the disruption of normal CRE interactions. Our study emphasized the importance of identifying perturbed regulatory units in monitoring cancer development and progression. Understanding the molecular mechanisms regulating gene expression will help us to understand the formation and evolution of life and to find cures for diseases. Eine fehlerhafte Regulation der Genexpression kann zu einem breiten Spektrum an Krankheiten und Abnormitäten führen. Zur Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Evolution, Entwicklung und Krankheit zugrunde liegen, werden die 2% protein-kodierenden Regionen im menschlichen Genom seit Jahrzehnten untersucht, die 98% nichtkodierenden Regionen sind bisher deutlich weniger gut verstanden. Viele Studien haben gezeigt, dass evolutionär konservierte nicht-kodierende Elemente (KNEs) als cis-regulatorische Elemente (CREs) fungieren. Jedoch sind nicht alle CREs evolutionär konserviert, weswegen sich die Identifizierung von CREs als schwierig erwiesen hat. Einige CREs regulieren die Genexpression kooperativ. Zusammen mit ihrem Zielgen oder ihren Zielgenen bilden diese CREs Regulationseinheiten. Zum Beispiel sind topologisch assoziierende Domänen (TADs) große Regulationseinheiten im Genom, die die Interaktionen zwischen Genen und CREs kontrollieren und einschränken. Viele Studien haben bestätigt, dass die Störung der TAD-Struktur zu einer fehlerhaften Genexpression führen kann. Diese Arbeit zielte auf die Charakterisierung von Regulationseinheiten ab. Insbesondere hat sie die Mechanismen erforscht, durch die eine Störung von Regulationseinheiten zu Veränderungen der Genexpression führt, im Kontext von Evolution, Entwicklung und Krankheit. Der erste Teil dieser Arbeit hat sich mit der Identifizierung und Charakterisierung kleiner Regulationseinheiten, bestehend aus zwei CREs, befasst. Wir haben 5500 Paare benachbarter KNEs im menschlichen Genom identifiziert (im Folgenden als ”KNE-KNE-Paare” bezeichnet), bei denen die Inter-KNE-Sequenzen im Vergleich zu dem gemeinsamen Vorfahren der Säugetiere entweder expandiert, konserviert, oder kontrahiert sind. Insbesondere die KNEs in KNE-KNE-Paaren mit konservierten oder leicht kontrahierten Inter-KNE-Sequenzen wiesen die größte Wahrscheinlichkeit auf, als aktive Enhancer oder ”poised” Enhancer (d.h., in Bereitschaftsstellung) zu fungieren. Des Weiteren zeigten die zu einem Paar gehörenden KNEs ähnliche epigenetische Profile, was darauf hindeutet, dass die KNE-KNE-Paare als kleine Regulationseinheiten fungieren. Darüber hinaus waren Transposon-Deletionen (respektive Insertionen) mit einer Kontraktion (respektive Expansion) der Inter-KNE-Sequenzen assoziiert. Dies deutet an, dass die Transposonaktivität möglicherweise den funktionellen Zusammenhang zwis chen den beiden KNEs in den KNE-KNE-Paaren stört und so zu einem Verlust ihrer cis-regulatorischen Funktion führt. Unsere Studie hat neue Regulationseinheiten identifiziert und die Existenz kooperativer Interaktionen zwischen benachbarten CREs, die sich in distanzsensitiven und durch Transposonaktivität zerstörbaren Regulationseinheiten befinden, hervorgehoben. Unsere Ergebnisse tragen zum Verständnis des Mechanismus bei, durch den selektive Kräfte auf CREs im Kontext von Evolution und genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen wirken. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Mechanismen untersucht, durch die Regulationseinheiten gestört werden können, was zu einer Fehlregulation der Genexpression bei Krankheiten führt. Hierzu haben wir zunächst 1467 Konsensus-TADs im „normalen Genom“ und 1622 Konsensus-TADs im „Krebsgenom“ konstruiert. Um den prognostischen Wert der Kenntnis der Position von Strukturvarianten wie Kopienzahlvarianten (KZVs) innerhalb der TADs bezüglich der Überlebensdauer von Krebspatienten zu ermitteln, haben wir eine Cox-Regressionsanalyse durchgeführt. Auf diese Weise haben wir 35 prognostische TADs identifiziert; 54% dieser TADs enthielten keine Gene mit einem bekannten Zusammenhang mit der Krebsursache, was darauf hinweist, dass ein großer Teil der TADs unabhängig von kodierenden Varianten einen prognostischen Wert hat. Darüber hinaus zeigten 34% der 35 prognostischen TADs starke strukturelle Störungen im Krebsgenom. Daher schien der prognostische Wert von mindestens einem Bruchteil der 35 TADs mit der Störung normaler CRE-Interaktionen verbunden zu sein. Unsere Studie zeigt, wie wichtig es ist, gestörte Regulationseinheiten zur Überwachung der Krebsentwicklung und -progression zu identifizieren. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Genexpression regulieren, wird uns helfen die Entstehung und Evolution des Lebens zu verstehen und Heilmittel für Krankheiten zu finden.

Die physische Nähe zwischen Genpromotoren und regulatorischen Elementen (Enhancer) spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression, um präzise räumliche und zeitliche Genexpressionmuster während der Embryogenese zu erzeugen. Abhängig von der Aktivität der Zielgene lassen sich zwei Typen von Interaktionen unterscheiden. Zum einen führen dynamische Enhancer-Promoter Interaktionen unmittelbar zur Genexpression, wohingegen in anderen Fällen stabile Interaktionen bereits vor der Genexpression existieren. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der stabilen Interaktion zwischen dem Shh Gen und dem Extremitätenenhancer, der ZRS, während der Embryonalentwicklung in der Maus untersucht. Der Verlust der konstitutiven Transkription, die den ZRS Enhancer abdeckt, führte zu einer Verschiebung innerhalb der Shh-ZRS Kontakte und einer moderaten Reduzierung der Shh Genexpression. Im Gegensatz dazu führte die Mutation von CTCF Bindungsstellen, die den ZRS Enhancer umgeben, zu einem Verlust der stabilen Shh-ZRS Interaktion und einem 50%igen Rückgang in der Shh Genexpression. Dieser Expressionsverlust hatte jedoch keine phänotypischen Auswirkungen in den Deletionsmutanten, was darauf hindeutet, dass die restliche Genaktivität und Enhancer-Promotor-Interaktion über einen zusätzlichen, CTCF-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Erst die kombinierte Deletion von CTCF-Bindungsmotiven und einem hypomorphen ZRS-Allel führte zu einem fast vollständigen Expressionsverlust von Shh und damit zu einem schweren Funktionsverlust und Gliedmaßen-Agenesie. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die stabile Chromatinstruktur am Shh Locus von mehreren Komponenten getragen wird und die physicalische Interaktion zwischen Enhancern und Promotern für eine robuste Transkription während der Embryonalentwicklung benötigt werden. Long-range gene regulation involves physical proximity between enhancers and promoters to generate precise patterns of gene expression in space and time. However, in some cases proximity coincides with gene activation, whereas in others preformed topologies already exist before activation. In this study, we investigate the preformed configuration underlying the regulation of the Shh gene by its unique limb enhancer, the ZRS, in vivo during mouse development. Abrogating the constitutive transcription covering the ZRS region led to a shift within the Shh-ZRS contacts and a moderate reduction in Shh transcription. Deletion of the CTCF binding sites around the ZRS resulted in a loss of the Shh-ZRS preformed interaction and a 50% decrease in Shh expression but no phenotype, suggesting an additional, CTCF-independent mechanism of promoter-enhancer communication. This residual activity, however, was diminished by combining the loss of CTCF binding with a hypomorphic ZRS allele resulting in severe Shh loss-of-function and digit agenesis. Our results indicate that the preformed chromatin structure of the Shh locus is sustained by multiple components and acts to reinforce enhancer-promoter communication for robust transcription.

A compelling question in biology is how form arises in development and is inherited throughout generations. It was the conventional wisdom that the consecutive superposition of tissues, together with inductions, establishes the body plan. However, it was recently shown that cellular organoids even form spontaneously in tissue culture, suggesting an intrinsic order and a capacity of self-organisation of cells. I propose that the C. elegans embryo is suited to unravel the nature of this intrinsic order and self-organisation. The embryo is patterned by extensive migrations that are guided by cell focussing. These migrations are based on constant, independent and short-term random movements – the dance of cells – resembling Brownian motion. This dance of cells is also observed in diverse other bilateral animals and thus defines a new widespread biological phenomenon. The migratory system is highly inert. Only mutants of ced-10, an orthologue to human Rac1, other genes in the Rac signalling pathway, and tag-335, involved in the production of GDP-mannose, cause significant reductions of effective migrations but do not affect the dance of cells. Downstream of CED-10, the SCAR/WAVE complex known to facilitate actin branching is responsible for normal effective migrations. In mutants of this complex only 40 % of cells migrate more than their own radius and leave the position they have been placed at by the mitoses – however, it can be shown that this is just pure chance. This reduction of effective migration is most prominent during the 64- and 128-AB stages, where the ordering migrations guided by cell focussing are occurring in the WT. The loss of ced-10 mediated SCAR/WAVE activity is highly deleterious for pattern formation. To potentially explain the aberrant patterning, an agent-based in silico model was devised, where all cell displacements are based solely on random cell movements and the also random displacements by mitoses. This model reproduces both, the reduced effective migrations and the observed patterning defects in SCAR/WAVE mutants. The guidance of migrations is, thus, independently regulated from the dance itself. SAX-3/ROBO was established as a cell focussing receptor potentially regulating lateral movements. I propose a new principle of pattern formation based on the cell focussing model. The embryo is patterned by translating a random dance of cells into directed effective migrations via RAC signalling to the SCAR/WAVE complex., Eine herausfordernde Fragestellung der Biologie ist, wie Form im Laufe der Entwicklung entsteht und über Generationen hinweg vererbt wird. In Zellkulturen können sich spontan Organoide bilden, was eine intrinsische Ordnung und Fähigkeit der Zellen zur Selbstorganisation anzeigt. Ich nutze C. elegans als Modell zur Ergründung der Natur dieser intrinsischen Ordnung und Selbstorganisation. In Embryonen von C. elegans organisieren sich die Zellen mittels extensiver, über die Zellfokussierung gesteuerter Migrationen. Diese Migrationen basieren auf konstanten, voneinander unabhängigen und auf kurzer zeitlicher Ebene zufälligen Bewegungen, dem Tanz der Zellen, der der brownschen Bewegung ähnelt. Dieser Tanz kann außerdem in weiteren Tieren beobachtet werden und zeigt so ein neues und weit in den Bilateria verbreitetes biologisches Phänomen an. Das Migrationssystem in C. elegans Embryonen ist ausgesprochen inert. Nur bei Mutanten von ced-10, einem Ortholog des humanen Rac1, anderen Genen des Rac Signalweges, und tag-335, welches an der Produktion von GDP-Mannose beteiligt ist, zeigen sich signifikante Reduktionen der Effektivmigrationen, ohne dabei den Tanz der Zellen zu beeinflussen. Downstream von CED-10 befindet sich der SCAR/WAVE Komplex, welcher an der Regulation von verzweigtem Aktin beteiligt ist. In Mutanten dieses Komplexes migrieren nur noch 40 % der Zellen weiter als ihren eigenen Radius und verlassen den Ort, an dem sie von der Mitose platziert wurden, was allerdings dem Zufall zuzuschreiben ist. Die Reduktionen der Effektivmigrationen sind im 64- und 128-AB Stadium – der Entwicklungsphase, in der im WT die ordnenden Migrationen der Zellfokussierung beobachtet werden – besonders auffällig. Der Verlust der SCAR/WAVE Aktivität führt zu einer drastischen Veränderung der normalen Musterbildung. Um diese zu erklären wurde ein agentenbasiertes Modell entwickelt, bei dem die Positionsveränderung von Zellen nur noch auf zufälligen Bewegungen und Platzierungen durch Mitosen basiert. Dieses Modell reproduziert die reduzierten Effektivmigrationen und die aberrante Musterbildung der SCAR/WAVE-Mutanten. Die Steuerung der Migrationen ist demnach unabhängig vom Tanz. Die Zellfokussierung steuert die Musterbildung, indem sie den zufälligen Tanz der Zellen über den Rac-Signalweg in gerichtete Bewegungen übersetzt. SAX-3/ROBO konnte als potentieller Zellfokussierungsrezeptor und Kandidat zur Regulation von lateralen Bewegungen identifiziert werden.

Die molekulare Charakterisierung von genetischen Veränderungen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) wurde vor allem bei jungen Patienten vorangebracht, hingegen fehlen Analysen für die AML bei älteren Patienten. Entsprechend ergab sich die Rationale, genetische und epigenetische Alterationen bei älteren AML Patienten zu untersuchen, um spezifische Signaturen zu identifizieren. Wir untersuchten ältere 93 AML Patienten aus dem Study Alliance Leukemia (SAL) Register. Es wurden 555 Gene auf der Illumina HiSeq2000 Plattform sequenziert und DNA Methylierungsprofile mittels dem Illumina 450K Array untersucht. Insgesamt wurden 814 molekulare Alterationen in 281 Genen detektiert. Besonders hohe Mutationsfrequenzen wurden in den Genen DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) und ASXL1 (21%) notiert. Alterationen in epigenetischen Regulatoren (85%) und in Genen, die in Splicing involviert sind (38%), wurden gehäuft beobachtet. Ältere AML Patienten mit Mutationen in DNMT3A oder DNA Reparaturgenen wiesen eine geringere Lebenserwartung im Vergleich zu der restlichen Kohorte auf. Wir verglichen die Meythlierungsdaten aus der SAL mit denen der TCGA Kohorte, umso die Methylierungsmuster von älteren mit denen von jüngeren Patienten zu differenzieren. Es konnte ein distinktes Methylierungsprofil in den DNA Proben von älteren AML Patienten nachgewiesen werden. Die im Vergleich zu jüngeren AML Patienten unterschiedlich methylierten Regionen bei älteren AML Patienten überlappten mit Genen verschiedener Signalwege, die Hallmarks von Alterungsprozessen und Krebs entsprechen. Zusammenfassend konnten wir für die Kohorte älterer AML Patienten genetische Alterationen nachweisen und mit spezifischen Profilen von Mutationen in epigenetischen Regulatoren korrelieren. Diese molekulare Kategorisierung unterstreicht distinkte biologische Mechanismen in älteren AML Patienten und die Notwendigkeit von spezifischen Therapieansätzen für diese Kohorte mit ungünstiger Prognose., Despite advances in the characterization of molecular alterations in younger acute myeloid leukemia (AML) patients, comprehensive studies in elderly AML are lacking. Thus, we investigated genetic and epigenetic alterations and probed for specific signatures to understand the unfavorable outcomes of elderly AML. We studied 93 AML patients (65 to 90 years old), enrolled in the Study Alliance Leukemia registry (SAL). To capture a broad spectrum of alterations, we sequenced 555 genes on an Illumina HiSeq2000 platform and investigated DNA methylation profiles using the Illumina 450K array. Overall, we detected 814 molecular alterations in 281 genes, with a median of 7 genes mutated per patient. Particularly high mutation frequencies were identified for DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) and ASXL1 (21%). We observed frequent alterations in epigenetic regulators (85%) and in splicing factors (38%). Notably, SAL elderly AML patients with mutations in DNMT3A or DNA repair genes (in absence of mutations in NPM1 or splicing factors) had an inferior survival of only 9 months (compared to 17 months for the remaining patients). In addition, for the analysis of elderly AML DNA methylation, we integrated the SAL cohort with TCGA methylation data for comparisons of methylation levels to younger patients. A distinct DNA methylation profile was observed in older AML patients, which correlated with the presence of mutations in IDH1/2, RUNX1 and ASXL1 and epigenetic similarities with TP53/Complex samples. The differential methylated regions of elderly AML (compared to younger AML samples) were shown to overlap genes from several pathways that are hallmarks of both age and cancer. In conclusion, we unraveled distinct patterns of genetic alterations and correlated specific epigenetic profiles of elderly AML to high rate mutated epigenetic regulators. This molecular categorization underscored the distinct biology and the need for specific therapeutic approaches in elderly AML.

The neXtProt human protein knowledgebase (https://www.nextprot.org) continues to add new content and tools, with a focus on proteomics and genetic variation data. neXtProt now has proteomics data for over 85% of the human proteins, as well as new tools tailored to the proteomics community. Moreover, the neXtProt release 2016-08-25 includes over 8000 phenotypic observations for over 4000 variations in a number of genes involved in hereditary cancers and channelopathies. These changes are presented in the current neXtProt update. All of the neXtProt data are available via our user interface and FTP site. We also provide an API access and a SPARQL endpoint for more technical applications.

The HUPO Human Proteome Project (HPP) has two overall goals: (1) stepwise completion of the protein parts list-the draft human proteome including confidently identifying and characterizing at least one protein product from each protein-coding gene, with increasing emphasis on sequence variants, post-translational modifications (PTMs), and splice isoforms of those proteins; and (2) making proteomics an integrated counterpart to genomics throughout the biomedical and life sciences community. PeptideAtlas and GPMDB reanalyze all major human mass spectrometry data sets available through ProteomeXchange with standardized protocols and stringent quality filters; neXtProt curates and integrates mass spectrometry and other findings to present the most up to date authorative compendium of the human proteome. The HPP Guidelines for Mass Spectrometry Data Interpretation version 2.1 were applied to manuscripts submitted for this 2016 C-HPP-led special issue [ www.thehpp.org/guidelines ]. The Human Proteome presented as neXtProt version 2016-02 has 16,518 confident protein identifications (Protein Existence [PE] Level 1), up from 13,664 at 2012-12, 15,646 at 2013-09, and 16,491 at 2014-10. There are 485 proteins that would have been PE1 under the Guidelines v1.0 from 2012 but now have insufficient evidence due to the agreed-upon more stringent Guidelines v2.0 to reduce false positives. neXtProt and PeptideAtlas now both require two non-nested, uniquely mapping (proteotypic) peptides of at least 9 aa in length. There are 2,949 missing proteins (PE2+3+4) as the baseline for submissions for this fourth annual C-HPP special issue of Journal of Proteome Research. PeptideAtlas has 14,629 canonical (plus 1187 uncertain and 1755 redundant) entries. GPMDB has 16,190 EC4 entries, and the Human Protein Atlas has 10,475 entries with supportive evidence. neXtProt, PeptideAtlas, and GPMDB are rich resources of information about post-translational modifications (PTMs), single amino acid variants (SAAVSs), and splice isoforms. Meanwhile, the Biology- and Disease-driven (B/D)-HPP has created comprehensive SRM resources, generated popular protein lists to guide targeted proteomics assays for specific diseases, and launched an Early Career Researchers initiative.

OBJECT Aneurysmal subarachnoid hemorrhage (aSAH) is associated with high rates of mortality and morbidity. The main predictor for the poor outcome is the World Federation of Neurosurgical Societies (WFNS) scale. However, this scale does not take into account proinflammatory events, such as infection occurring after the aSAH, which could modify the long-term status of patients. The aim of this study was to evaluate neopterin as an inflammatory biomarker for outcome and infection prediction in aSAH patients. METHODS Plasma concentrations of neopterin were measured in 61 aSAH patients (22 male and 39 female; mean age [± SD] 52.8 ± 11.8 years) using a commercial ELISA kit. Samples were collected daily for 10 days. Outcome at 12 months was determined using the Glasgow Outcome Scale (GOS) and dichotomized as poor (GOS score 1, 2, or 3) or good (GOS score 4 or 5). Infection was determined by the presence of a positive bacterial culture. RESULTS Patients with poor outcome at 12 months had higher concentrations of neopterin than patients with good outcome. In the same way, patients who had an infection during the hospitalization had significantly higher concentrations of neopterin than patients without infection (p = 0.001). Moreover, neopterin concentrations were significantly (p < 0.008) elevated in infected patients 2 days before infection detection and antibiotic therapy. CONCLUSIONS Neopterin is an efficient outcome predictor after aSAH. Furthermore, it is able to differentiate between infected and uninfected patients as early as 2 days before clinical signs of infection, facilitating earlier antibiotic therapy and better management.

Angelerfolg hängt vom Fischverhalten ab und selektiver Fang aufgrund vererbbarer Verhaltensmerkmale kann sich auf Fischpopulationen auswirken. Die anglerische Vulnerabilität ergibt sich aus einer Kombination aus dem Zustand des Fisches, dem Zusammentreffen mit dem Fanggerät und den Eigenschaften desselben. Höhere Aktivität sollte die Begegnungswahrscheinlichkeit mit dem Fanggerät und dadurch die Vulnerabilität steigern. Ziel dieser Arbeit war es zu verstehen, wie Bewegungsmuster die Vulnerabilität durch die Angelfischerei beeinflussen. Dazu habe ich das Verhalten von vier Arten (Karpfen, Cyprinuscarpio, Schleie, Tinca tinca, Barsch, Perca fluviatilis, und Hecht, Esox lucius) in einem See mittels akustischer Telemetrie gemessen. Zudem habe ich verhaltensselektives Angeln auf Benthivore (Karpfen und Schleie) von festen Plätzen mit dem mobilen Angeln auf einen aktiven Raubfisch (Barsch) und einen Lauerjäger (Hecht) verglichen. Barsche wurden gezielt von freiwilligen, unterschiedlich versierten Anglern in GPS-überwachten Booten beangelt, um zu verstehen, wie Anglerfähigkeiten verhaltensbasierte Selektion beeinflussen. Für die individuell wiederholbare Aktivität von Karpfen, Schleie und Barsch lag keine Angelselektivität vor, da das Zusammentreffen mit Fanggeräten in keinem Zusammenhang mit der Vulnerabilität stand. Beim Barsch hingegen hing die Vulnerabilität mit der Habitatwahl zusammen. Die Geschicklichkeit der Angler verstärkte die Selektion durch höhere Mortalität. Für große Hechte mit großem Aktionsradius kann ein auf Begegnungen basierender Mechanismus nicht ausgeschlossen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die wichtigsten Verhaltensweisen, die die Vulnerabilität durch die Angelfischerei ausmachen und nach denen eine Selektion erwartet wird, häufig erst nach dem Zusammentreffen von Fisch und Fischer stattfinden. Jedoch kann die Bedeutung dieser Fisch-Fischer Begegnungen für die Vulnerabilität art- und fischereispezifisch sein., Capturing fish by angling depends on fish behaviour. Selective capture based on heritable behaviours may have ramifications for fish populations and fishing communities, but the behavioural components of angling vulnerability are unclear. Conceptually, vulnerability derives from a combination of a fish’s internal state, gear encounter rate and gear quality. Accordingly, greater activity or space use is expected to increase vulnerability via elevated encounter rates with fishing gear. However, behaviourally selective angling may also interact with angler behaviour (e.g. skill). My aim was to understand the role of fish movement and space use in driving angling vulnerability. I measured the behaviour and angling vulnerability of four species (viz. carp, Cyprinus carpio, tench, Tinca tinca, perch, Perca fluviatilis, and northern pike, Esox lucius) using whole-lake high resolution acoustic telemetry. Perch were targeted by variably skilled anglers in GPS tracked boats to understand how skill affects selection. I have therefore contrasted behaviourally selective angling of benthivores (carp and tench) targeted from fixed angling sites, an active top predator (perch) targeted by searching anglers and an ambush predator (northern pike) targeted by searching anglers. Angling was unselective for repeatable carp, tench or perch activity and movement as encounter was unrelated to vulnerability. Vulnerability related to perch habitat choice as shown by a latitudinal division of captured and uncaptured perch and high skilled anglers only strengthened selection via greater enacted mortality. Finally, large pike with greater space use were most vulnerable to angling and an encounter based mechanism cannot be ruled out. In conclusion, the key behaviours distinguishing angling vulnerability, upon which selection should be expected, frequently operate after a fish-fisher encounter, but the importance of fish-fisher encounters for vulnerability may be species and fishery specific.

Das Wachstum auf Ebene des Individuums sowie auf zellulärer Ebene unterliegt vielfältig regulierten Mechanismen. Hierzu gehören das primäre Cilium sowie der Basalkörper, welche bei fast allen Säugetierzellen vorhanden sind. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass eine wachsende Anzahl an humanen Erkrankungen mit Beteiligung des Skelettsystems mit einer Dysfunktion des primären Ciliums oder des dazugehörenden Basalkörpers assoziiert sind. Diese Gruppe von Erkrankungen sog. Ciliopathien umfassen beim Menschen ein breites phänotypisches Spektrum, welches neben skelettalen Auffälligkeiten auch Gehirn-fehlbildungen, Polydaktylie, Nierenerkrankungen und weitere Organauffälligkeiten aufweist. Die Kurzrippen-Polydaktylie Syndrome (short-rib polydactyly syndromes [SRPS] bzw. short-rib thoracic dysplasias [SRTD]) stellen eine Gruppe meist letaler autosomal-rezessiv vererbter Osteochondrodysplasien dar, welche zu den skelettalen Ciliopathien zugeordnet werden. In dieser Arbeit konnte ich bei 16 von 32 Patienten mit der Verdachtsdiagnose SRPS/SRTD sichere oder wahrscheinlich pathogene Varianten in NEK1, DYNC2H1, DYNC2LI1 und EVC mittels Sanger-Sequenzierung bzw. der Next Generation Sequencing Technologie identifizieren, wodurch das Mutationsspektrum dieser Erkrankungsgruppe erweitert werden konnte. Bislang vorliegende Ergebnisse zeigen, dass Mutationen in den bekannten Ciliopathie-assoziierten Genen zu einem biallelen loss-of-function Effekt als pathogenetischer Mechanismus führen und somit die Methode der CRISPR/Cas9 vermittelten Genomeditierung hervorragend geeignet ist, um diesen Effekt nachzubilden. Ich etablierte daher mittels CRISPR/Cas9 drei Zelllinien mit frameshift Deletionen. Mit dem in dieser Arbeit selbst hergestellten polyklonalen NEK1-H3T1 Antikörper konnte in den NEK1-CRISPR-Klonen sowohl ein Verlust des full-length Proteins als auch eine veränderte Cilien-Morphologie mit fehlendem NEK1 Signal am Basalkörper von primären Cilien nachgewiesen werden, welches somit auch den beobachteten ciliären Phänotyp in NEK1-Patienten-Zellen widerspiegelte. Zur Identifikation der detaillierten Effekte von NEK1 Mutationen auf noch unbekannte Signaltransduktionswege führte ich eine RNA Sequenzierung durch. Zur Erfassung der Änderung der Expressionsprofile wurden die NEK1-CRISPR-Zellen unter Normal- sowie Hungermedium untersucht, wobei eine signifikante Expressionsänderung von Genen der PDGF-, Wnt-, MAPK-, EGF- und Growth Hormone Signalwege identifiziert wurde. Diese Ergebnisse geben erstmals konkrete Hinweise auf die bei den ciliären NEK1-Chondrodysplasien beteiligten Reaktionswege. Die Funktion des NEK1 Proteins lässt sich auch über seine Interaktionspartner definieren, weshalb ich Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Analysen unter Verwendung einer murinen retinalen cDNA-Bank durchführte, um gezielt nach ciliären und Basalkörper-assoziierten Interaktionspartnern zu suchen. Die in den Hefe-Screens gefundenen Interaktionen NEK1 C21orf2 SPATA7 und NEK1 DYNC2LI1 wurden mittels Galaktosidase Tests (1on1 Screens), Kolokalisationsanalysen und Ko-Immunopräzipitationsexperimenten validiert. Diese Interaktionspartner erweitern zum einen das ciliäre Proteininteraktionsnetzwerk und zum anderen stellen diese potentielle ursächliche Proteine für die verschiedenen skelettalen Ciliopathien des SRPS/SRTD-Spektrums dar. So konnte ich in dieser Arbeit mittels Next Generation Sequencing in einem Patienten compound heterozygote Mutationen in DYNC2LI1, welches ein Teil des cytoplasmatischen Dynein-2 Komplexes darstellt, identifizieren. Mittels siRNA knockdown in Fibroblasten konnte ich nachweisen, dass der Funktionsverlust von DYNC2LI1 zu morphologisch abnormen Cilien führt. Reduzierte Cilienlängen mit zusätzlicher Akkumulation von IFT-B Proteinen in den verdickten Cilienspitzen bestätigen DYNC2LI1 als ursächliches Ciliopathie-Gen und erweitern das klinische Spektrum von Ciliopathien, die durch Defekte des Dynein-2-Komplexes verursacht werden. Die stetig wachsende Anzahl von Cilien- bzw. Centrosomen-assoziierten Genen wurde von mir mit weiteren Informationen (Cilien-Evidenz, humanes Krankheitsbild, Maus-Modell, etc.) in einer Ciliengenliste zusammengefasst, welche für weiterführende Analysen z.B. als Filterkriterien von NGS-Daten, Netzwerk- oder Pathwayanalysen herangezogen werden kann. In dieser Dissertation konnten Mutationsanalysen in einer Patientenkohorte zusammen mit weiteren cilien-morphologischen Untersuchungen und Interaktionsstudien dazu beitragen, ciliäre Proteine und Phänotypen besser zu charakterisieren und unser Wissen über die Cilienfunktionen zu erweitern. Individual and cellular growth is maintained by a variety of regulated mechanisms. These include the primary cilium and the basal body, which are present in almost all mammalian cell lines. In recent years, it has been shown that an increasing number of human skeletal disorders are associated with dysfunction of the primary cilium or the associated basal body. This group of diseases so-called ciliopathies include a wide spectrum of human phenotypes with brain malformation, polydactyly, kidney disease and other organ abnormalities in addition to skeletal abnormalities. Short-rib polydactyly syndromes [SRPS] or short-rib thoracic dysplasias [SRTD] are a group of autosomal recessively inherited lethal osteochondrodysplasias, which are assigned to the skeletal ciliopathies. In this work, in 16 out of 32 patients with a suspected diagnosis of SRPS/SRTD, I identified pathogenic or likely pathogenic variants in NEK1, DYNC2H1, DYNC2LI1 and EVC using Sanger Sequencing and Next Generation Sequencing technology, thereby expanding the mutation spectrum of this disease group. Previous results showed that mutations in known ciliopathy-associated genes lead to a biallelic loss-of-function effect as a pathogenetic mechanism and thus the method of CRISPR/Cas9-mediated genome editing is excellently suited to mimic this effect. I therefore established three cell lines with frameshift deletions using CRISPR/Cas9. With my custom-made polyclonal NEK1-H3T1 antibody produced in this project, a loss of the full-length protein as well as an altered cilia morphology with missing NEK1 signal at the basal body of primary cilia could be detected in the NEK1-CRISPR clones, reflecting the observed ciliary phenotype in NEK1 patient cells. To identify the detailed effects of NEK1 mutations on yet unknown signal transduction pathways, I performed RNA sequencing. To determine expression profile changes, the NEK1-CRISPR cells were examined under normal and starvation media, whereby significant expression change of genes of the PDGF, Wnt, MAPK, EGF and growth hormone signaling pathways were identified. These results provide for the first time concrete indications of reaction pathways involved in ciliary NEK1 chondrodysplasias. The function of the NEK1 protein can also be defined through its interaction partners, which is why I performed yeast two-hybrid (Y2H) analyses using a murine retinal cDNA library for a targeted search for ciliary and basal body-associated interaction partners. The interactions NEK1 C21orf2 SPATA7 and NEK1 DYNC2LI1 found in the yeast screens were validated by galactosidase assays (1on1 screens), colocalization analyses and co-immunoprecipitation experiments. On the one hand, these interaction partners expand the ciliary protein interaction network and on the other hand, they represent potential causative proteins for the various skeletal ciliopathies of the SRPS/SRTD spectrum. By using the Next Generation Sequencing technology, I was also able to identify in one patient compound heterozygous mutations in DYNC2LI1, which is part of the cytoplasmic dynein-2 complex. I was able to show via siRNA knockdown experiments in fibroblasts that the loss of functional DYNC2LI1 leads to morphologically abnormal cilia. Reduced cilia lengths with additional accumulation of IFT-B proteins in the bulbous ciliary tips confirm DYNC2LI1 as a causative ciliopathy gene and expand the clinical spectrum of ciliopathies caused by defects in the dynein-2 complex. The ever-expanding number of cilia- or centrosome-associated genes were summarized by me with further information (cilia evidence, human disease, mouse model, etc.) in a cilia gene list, which can be used for further studies e.g. as filter criteria for NGS data, network or pathway analyses. In this dissertation, mutation analyses in a patient cohort, along with other ciliary-morphological examinations and interaction studies, helped to better characterize ciliary proteins and phenotypes, and to expand our understanding of ciliary functions.

Cell fusion is essential for the development and propagation of most eukaryotic organisms. In the filamentous fungus Neurospora crassa, cell fusion is observed during early colony establishment, when germinating spores fuse into a supracellular network, which further develops into the highly interconnected mycelial colony. The interaction of these genetically identical germlings is mediated by an unusual signaling mechanism, in which, in order to avoid self-signaling, the cells take turns in signal sending and receiving. The switch between these two physiological states is represented by the alternating membrane recruitment of the SO protein and the MAP kinase MAK-2. This dialog-like behavior is observed until the cells establish physical contact, when MAK-2 and SO both accumulate at the contact area. At this stage a second MAP kinase, MAK-1, is also recruited to the cell contact area, that controls the subsequent steps of cell wall remodeling and membrane fusion. The main goal of this thesis was to further characterize the molecular functions of the MAP kinases MAK-2 and MAK-1. A specific focus was the investigation of the relationship between the activity of these kinases and their subcellular spatial and temporal dynamics, by using molecular genetics, protein mislocalization, chemical genetics and live cell imaging. The results revealed a strong correlation between the specific subcellular localization and the activation and activity of the MAK-2 MAP kinase. In addition, for the first time a functional link between the MAK-2 and SO dynamics was identified. Furthermore, this work revealed new functions of MAK-1 in organizing of the actin cytoskeleton in fusing cells by activation of the Rho-GTPase RAC-1, while MAK-2 was shown to regulate the subcellular localization of the mentioned factors. A second independent research project investigated the conservation of cell fusion in other filamentous fungi. This study revealed for the first-time that the oscillatory recruitment of the fusion proteins is fully conserved in another filamentous fungus, the grey mold Botrytis cinerea. When N. crassa and B. cinerea spores were mixed, interspecies interactions were readily observed indicating that both fungi share a common molecular language., Die Zellfusion ist ein elementarer Bestandteil der Entwicklung und Fortpflanzung der meisten eukaryotischen Organismen. In dem filamentösen Pilz Neurospora crassa treten Zellfusionen in den frühen Stadien der Kolonienetwicklung auf, wenn keimende Sporen in ein suprazelluläres Netzwerk fusionieren, aus dem sich das stark vernetzte Myzel entwickelt. Diese Interaktionen genetisch identischer Keimlinge werden durch einen ungewöhnlichen Signalmechanismus vermittelt, in dem sich die Zellen zwischen Signalsenden und -empfangen abwechseln, um eine Eigenstimulation zu verhindern. Dieser Wechsel zwischen zwei physiologischen Zuständen wird durch die abwechselnde Rekrutierung des SO-Proteins und der MAP-Kinase MAK-2 an die Plasmamembran illustriert. Dieses dialog-artige Verhalten tritt auf, bis die Zellen physischen Kontakt hergestellt haben. Danach akkumulieren SO und MAK-2 an der Kontaktstelle. In diesem Stadium wird eine zweite MAP-Kinase, MAK-1, an den Kontaktpunkt rekrutiert, die die weiteren Schritte des Zellwandumbaus und der Membranfusion kontrolliert. Hauptziel dieser Arbeit war es, die molekularen Funktionen der MAP-Kinasen MAK-1 und MAK-2 weiter zu beschreiben. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung des Zusammenhangs zwischen der Aktivität dieser Kinasen und ihrer subzellulären zeitlichen und räumlichen Dynamik mithilfe der Molekulargenetik, Fehllokalisierungen der Proteine, chemischer Genetik sowie Live Cell Imaging. Die Ergebnisse zeigten eine starke Korrelation zwischen der subzellulären Lokalisierung und der Aktivität und Aktivierung der MAK-2 MAP-Kinase. Zusätzlich wurde zum ersten Mal ein funktioneller Zusammenhang zwischen den Dynamiken von MAK-2- und SO aufgezeigt. Darüber hinaus wurden neue Funktionen von MAK-1 in der Organisation des Aktin-Zytoskeletts in fusionierenden Zellen durch die Aktivierung der Rho-GTPase RAC-1 beschrieben. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass MAK-2 die subzelluläre Dynamik der zuvor genannten Faktoren reguliert. In einem zweiten unabhängigen Forschungsprojekt wurde untersucht ob die Zellfusionsmechanismen in anderen Pilzen konserviert sind. Diese Untersuchung zeigte zum ersten Mal, dass die oszillierende Rekrutierung der Fusionsproteine vollständig in einem anderen Pilz, dem Grauschimmel Botrytis cinerea, konserviert ist. Wenn Sporen von N. crassa und B. cinerea gemischt wurden, waren Interspezies-Interaktionen häufig zu beobachten, was darauf hindeutet, dass beide Pilze eine gemeinsame molekulare Sprache teilen.

Das prä-mRNA Spleißen ist als Prozessierungsschritt der post-transkriptionalen Modifikation von RNA Transkripten ein wichtiger Teil der eukaryotischen Genexpression. Dabei werden aus der prä-mRNA, die in Exons und Introns unterteilt ist, die Introns herausgespleißt. Die Exons werden miteinander verknüpft bevor das Transkript anschließend als reife mRNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportiert und für die Translation verwendet wird. Diese Reaktion wird durch das Spleißosom katalysiert. Dieses erkennt anhand der 5´-Exon/5´-Spleißstelle, der Verzweigungssequenz und der 3´-Spleißsstelle den Anfang und das Ende des Introns. Es ist bekannt, dass die Aktivität der Serin/Threonin Kinase Prp4 in Schizosaccharomyces pombe für die Erkennung und das Herausspleißen von Introns mit schwachen Spleißstellen benötigt wird. Diese Introns werden als Prp4 Kinase-abhängige Introns bezeichnet. In dieser Arbeit sollte die Funktion der Prp4 Kinase bei dem essentiellen Schritt der Intronerkennung weiter aufgeklärt werden. Deswegen wurden zunächst neue in vitro Substrate der Prp4 Kinase identifiziert. Dazu zählen das Protein U1-70K des U1 snRNPs, das Protein Bpb1, das SR Protein Srp2 und das SR-ähnliche Protein Rsd1. SR Proteine sind dafür bekannt als trans-agierende Spleißfaktoren mit Komponenten des Spleißosoms zu interagieren und zur Erkennung von Introns beizutragen. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität der Prp4 Kinase mit den SR Proteinen, Srp1 und Srp2, in Verbindung steht. Fehlen diese beiden Proteine in der Zelle, zeigt sowohl die Analyse einzelner Introns durch RT-PCR als auch eine Sequenzierung der Gesamt-RNA, dass nahezu alle Introns Prp4-unabhängig gespleißt werden. Die beiden nicht-essentiellen Kinasen, Dsk1 und Lkh1, sind auch an diesem Mechanismus beteiligt. Die Analyse einzelner Introns durch RT-PCR zeigt, dass eine Deletion dieser beiden Kinasen ebenfalls zu Prp4-Unabhängigkeit der Introns führt. Mutationsanalysen im 5´-Exon zweier Reportergene oberhalb der X-3X-2X-1/5´-SS zeigen, dass auch die Sequenz im Bereich des 5´-Exons eine Auswirkung auf die Erkennung und Prp4 Kinase-Abhängigkeit von Introns hat. Prp4-unabhängige Introns sind von Mutationen im Bereich des 5´-Exons nicht beeinflusst. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Prp4 Kinase zusammen mit den SR Proteine und den beiden nicht-essentiellen Kinasen, Dsk1 und Lkh1, das Herausspleißen von Introns mit schwachen Spleißstellen sicherstellt und koordiniert., Pre-mRNA splicing is an important part of eukaryotic gene expression as a processing step in the post-transcriptional modification of RNA transcripts. In this process, the introns have to be spliced out of the pre-mRNA, which is subdivided into exons and introns. Subsequently, the exons are joined together before the transcript is exported as mature mRNA from the nucleus to the cytoplasm and used for translation. This reaction is catalyzed by the spliceosome. The spliceosome recognizes the beginning and the end of an intron via the 5´-exon/5´-splice site, branch sequence and 3´-splice site. It is known that the activity of the serine/threonine kinase Prp4 is required for the recognition and splicing of introns displaying weak splice sites in Schizosaccharomyces pombe. These introns are called Prp4 kinase-dependent introns. In this study, the function of Prp4 kinase was further elucidated in the essential step of intron recognition. Initially, new in vitro substrates of Prp4 kinase were identified. These include the protein U1-70K of the U1 snRNP, the protein Bpb1, the SR protein Srp2, and the SR-like protein Rsd1. SR proteins are known as trans acting splicing factors to interact with spliceosomal components and to promote the recognition of introns. It was shown that the activity of Prp4 kinase is related to the SR proteins, Srp1 and Srp2. In the absence of these two proteins in the cell, analysis of single introns by RT-PCR as well as sequencing of the total RNA reveals that almost all introns are spliced Prp4-independently. The two non-essential kinases, Dsk1 and Lkh1, are also involved in this mechanism. Analysis of single introns by RT-PCR shows that the deletion of these two kinases also leads to Prp4-independency of the introns. Mutational analyzes within the 5´-exon upstream of the X-3X-2X-1/5´-SS of two reporter genes show that the sequence in the exonic region also influences the recognition and Prp4-dependency of introns. Prp4-independent introns are not affected by mutations within the 5´-exon. Based on the results, the Prp4 kinase, together with the SR proteins and the two non-essential kinases Dsk1 and Lkh1, appears to be part of a mechanism that ensures and coordinates the splicing of introns displaying weak splice sites.

Zell-Fusionen sind essentielle Ereignisse in der Entwicklung eukaryotischer Organismen. Sie treten in verschiedensten Lebensphasen und zwischen unterschiedlichen Zellformen auf, der Ablauf und Mechanismen sind aber vergleichbar. In dieser Arbeit diente der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa als Modellorganismus zur Erforschung vegetativer Fusionen in Pilzen. Eine Besonderheit der Pilze ist ihre Zellwand, welche unter anderem die Komponente Chitin enthält. Das Zuckerpolymer wird über Chitin-Synthasen in den extrazellulären Raum synthetisiert. Ein entscheidender Schritt während der Zell-Fusion ist die die Umstrukturierung der Zellwand um die Verschmelzung der Plasmamembranen und die anschließende Fusion zu ermöglichen. Diese späte Phase der Zell-Fusion ist molekular kaum untersucht und daher Fokus dieser Arbeit. Die Charakterisierung des Chitin-Synthase-Regulator CSR-3 ergab, dass das Protein unterstützend während der Fusionsporenbildung fungiert und ein Fehlen zu vermehrter Lyse fusionierender Zellen führt. Mittels gerichteter Mutagenese konnte die Bedeutung der Prenylierung für die korrekte Funktion von CSR-3 während dieses Prozesses gezeigt werden. Zusätzlich ist der Regulator an der Septierung und Konidienbildung und an der lokalen und molekularen Antwort auf Zellwand- und Membranstress beteiligt. Die Mechanismen und auch ihre mögliche Verknüpfung der Prozesse finden bisher noch kaum Beachtung. Die erhaltenen Daten unterstützen die Hypothese, dass die Umstrukturierung der Zellwand während der Fusion über ein Gleichgewicht zwischen Auf- und Abbau stattfindet. Sie demonstrieren außerdem, dass die Proteine der Chitin-Synthese und der Fusion sowohl redundante als auch spezifische und generelle Funktionen in der Zelle ausüben können. Neben der Zellwand spielt bei der erfolgreichen Zell-Fusion auch die korrekte Positionierung der Plasmamembranen eine Rolle. In N. crassa erfüllen die Enzyme ERG-10a und ERG-10b (C5-Sterol-Desaturasen) redundante Rollen innerhalb der Membran-Synthese und ihr Verlust verhindert die Membran-Verschmelzung bei der Zell-Fusion. Dieser Defekt wurde in dieser Arbeit auf quantitativer Ebene untersucht. Eine phylogenetische Analyse der beiden Proteine ergab überraschenderweise, dass die Sequenz von erg-10b ursprünglich aus dem sehr seltenen Ereignis eines horizontalen Gentransfer aus einer Spezies der Basidiomycota stammt., In eukaryotic organisms, cell fusion is essential for growth and development. Although fusion events occur during diverse developmental stages and between different cell types, the single steps of the process are conserved. In this work, the filamentous ascomycete fungus Neurospora crassa served as a model organism to study vegetative cell fusion in fungi. One specific feature of fungi is their cell wall, which contains chitin. This polysaccharide is synthesized into the extracellular room by chitin synthases. A crucial step during cell fusion is the remodeling of the cell wall of both interacting partners to enable physical contact of the plasma membranes and subsequent fusion. This study focuses on these late events of the fusion process because their molecular bases are still elusive. The analysis of the chitin synthase regulator CSR-3 revealed a stabilizing function of the protein during fusion pore formation. A lack of this regulator results in an increased lysis rate of fusing cells. Directed mutagenesis revealed that the prenylation of CSR-3 is essential for its proper function in this process. Additionally, the regulator is also involved in septation and conidiation and participates in the local and molecular response towards cell wall and membrane stress. These mechanisms and their putative link hardly received attention, yet. Over all, our data support the hypothesis that cell wall remodeling during cell fusion requires an equilibrium of synthesis and degradation. Furthermore, the different factors involved in chitin synthesis and cell fusion appear to possess individual, specific but also redundant and more general functions. Apart from the cell wall, the proper adhesion of the plasma membranes plays an important role for successful cell fusion. In N. crassa the enzymes ERG-10a and ERG-10b (C5 sterol desaturases) possess redundant functions in membrane biosynthesis and their absence hinders membrane merger. This study further characterized this phenotype in a quantitative manner. A phylogenetic analysis of both proteins revealed that the sequence of erg-10b was originally obtained by a very rare event of a horizontal gene transfer from a basidiomycete species.

Frontiers in immunology 9, 1937 (2018). doi:10.3389/fimmu.2018.01937, Published by Frontiers Media, Lausanne

Die biotechnologischen Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichen eine immer detailliertere Untersuchung von genetischen und molekularen Markern mit multiplen komplexen Traits. Allerdings liefern vorhandene statistische Methoden für diese komplexen Analysen oft keine valide Inferenz. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit ist, zwei neue statistische Methoden für Assoziationsstudien von genetischen Markern mit multiplen Phänotypen zu entwickeln, effizient und robust zu implementieren, und im Vergleich zu existierenden statistischen Methoden zu evaluieren. Der erste Ansatz, C-JAMP (Copula-based Joint Analysis of Multiple Phenotypes), ermöglicht die Assoziation von genetischen Varianten mit multiplen Traits in einem gemeinsamen Copula Modell zu untersuchen. Der zweite Ansatz, CIEE (Causal Inference using Estimating Equations), ermöglicht direkte genetische Effekte zu schätzen und testen. C-JAMP wird in dieser Arbeit für Assoziationsstudien von seltenen genetischen Varianten mit quantitativen Traits evaluiert, und CIEE für Assoziationsstudien von häufigen genetischen Varianten mit quantitativen Traits und Ereigniszeiten. Die Ergebnisse von umfangreichen Simulationsstudien zeigen, dass beide Methoden unverzerrte und effiziente Parameterschätzer liefern und die statistische Power von Assoziationstests im Vergleich zu existierenden Methoden erhöhen können - welche ihrerseits oft keine valide Inferenz liefern. Für das zweite Ziel dieser Arbeit, neue genetische und transkriptomische Marker für kardiometabolische Traits zu identifizieren, werden zwei Studien mit genom- und transkriptomweiten Daten mit C-JAMP und CIEE analysiert. In den Analysen werden mehrere neue Kandidatenmarker und -gene für Blutdruck und Adipositas identifiziert. Dies unterstreicht den Wert, neue statistische Methoden zu entwickeln, evaluieren, und implementieren. Für beide entwickelten Methoden sind R Pakete verfügbar, die ihre Anwendung in zukünftigen Studien ermöglichen., In recent years, the biotechnological advancements have allowed to investigate associations of genetic and molecular markers with multiple complex phenotypes in much greater depth. However, for the analysis of such complex datasets, available statistical methods often don’t yield valid inference. The first aim of this thesis is to develop two novel statistical methods for association analyses of genetic markers with multiple phenotypes, to implement them in a computationally efficient and robust manner so that they can be used for large-scale analyses, and evaluate them in comparison to existing statistical approaches under realistic scenarios. The first approach, called the copula-based joint analysis of multiple phenotypes (C-JAMP) method, allows investigating genetic associations with multiple traits in a joint copula model and is evaluated for genetic association analyses of rare genetic variants with quantitative traits. The second approach, called the causal inference using estimating equations (CIEE) method, allows estimating and testing direct genetic effects in directed acyclic graphs, and is evaluated for association analyses of common genetic variants with quantitative and time-to-event traits. The results of extensive simulation studies show that both approaches yield unbiased and efficient parameter estimators and can improve the power of association tests in comparison to existing approaches, which yield invalid inference in many scenarios. For the second goal of this thesis, to identify novel genetic and transcriptomic markers associated with cardiometabolic traits, C-JAMP and CIEE are applied in two large-scale studies including genome- and transcriptome-wide data. In the analyses, several novel candidate markers and genes are identified, which highlights the merit of developing, evaluating, and implementing novel statistical approaches. R packages are available for both methods and enable their application in future studies.

This review presents the evolution of steroid analytical techniques, including gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC–MS), immunoassay (IA) and targeted liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC–MS), and it evaluates the potential of extended steroid profiles by a metabolomics-based approach, namely steroidomics. Steroids regulate essential biological functions including growth and reproduction, and perturbations of the steroid homeostasis can generate serious physiological issues; therefore, specific and sensitive methods have been developed to measure steroid concentrations. GC–MS measuring several steroids simultaneously was considered the first historical standard method for analysis. Steroids were then quantified by immunoassay, allowing a higher throughput; however, major drawbacks included the measurement of a single compound instead of a panel and cross-reactivity reactions. Targeted LC–MS methods with selected reaction monitoring (SRM) were then introduced for quantifying a small steroid subset without the problems of cross-reactivity. The next step was the integration of metabolomic approaches in the context of steroid analyses. As metabolomics tends to identify and quantify all the metabolites (i.e., the metabolome) in a specific system, appropriate strategies were proposed for discovering new biomarkers. Steroidomics, defined as the untargeted analysis of the steroid content in a sample, was implemented in several fields, including doping analysis, clinical studies, in vivo or in vitro toxicology assays, and more. This review discusses the current analytical methods for assessing steroid changes and compares them to steroidomics. Steroids, their pathways, their implications in diseases and the biological matrices in which they are analysed will first be described. Then, the different analytical strategies will be presented with a focus on their ability to obtain relevant information on the steroid pattern. The future technical requirements for improving steroid analysis will also be presented.

A previous high-resolution metabolomic study pointed out a dysregulation of urinary steroids and bile acids in human cases of acute dioxin exposure. A subset of 24 compounds was highlighted as putative biomarkers. The aim of the current study was (i) to evaluate the 24 biomarkers in an independent human cohort exposed to dioxins released from the incineration fumes of a municipal waste incinerator and; (ii) to identify them by comparison with authentic chemical standards and biosynthesised products obtained with in vitro metabolic reactions. An orthogonal projection to latent structures discriminant analysis built on biomarker profiles measured in the intoxicated cohort and the controls separated both groups with reported values of 93.8%; 100% and 87.5% for global accuracy; sensitivity and specificity; respectively. These results corroborated the 24 compounds as exposure biomarkers; but a definite identification was necessary for a better understanding of dioxin toxicity. Dehydroepiandrosterone 3β-sulfate, androsterone 3α-glucuronide, androsterone 3α-sulfate, pregnanediol 3α-glucuronide and 11-ketoetiocholanolone 3α-glucuronide were identified by authentic standards. Metabolic reactions characterised four biomarkers: glucuronide conjugates of 11β-hydroxyandrosterone; glycochenodeoxycholic acid and glycocholic acid produced in human liver microsomes and glycoursodeoxycholic acid sulfate generated in cytosol fraction. The combination of metabolomics by high-resolution mass spectrometry with in vitro metabolic syntheses confirmed a perturbed profile of steroids and bile acids in human cases of dioxin exposure.

The quantitative proteomics data here reported are part of a research article entitled “Increased acute immune response during the meningo-encephalitic stage of Trypanosoma brucei rhodesiense sleeping sickness compared to Trypanosoma brucei gambiense”, published by Tiberti et al., 2015. Transl. Proteomics 6, 1–9.Sleeping sickness (human African trypanosomiasis – HAT) is a deadly neglected tropical disease affecting mainly rural communities in sub-Saharan Africa. This parasitic disease is caused by the Trypanosoma brucei (T. b.) parasite, which is transmitted to the human host through the bite of the tse-tse fly. Two parasite sub-species, T. b. rhodesiense and T. b. gambiense, are responsible for two clinically different and geographically separated forms of sleeping sickness.The objective of the present study was to characterise and compare the cerebrospinal fluid (CSF) proteome of stage 2 (meningo-encephalitic stage) HAT patients suffering from T. b. gambiense or T. b. rhodesiense disease using high-throughput quantitative proteomics and the Tandem Mass Tag (TMT®) isobaric labelling. In order to evaluate the CSF proteome in the context of HAT pathophysiology, the protein dataset was then submitted to gene ontology and pathway analysis. Two significantly differentially expressed proteins (C-reactive protein and orosomucoid 1) were further verified on a larger population of patients (n=185) by ELISA, confirming the mass spectrometry results. By showing a predominant involvement of the acute immune response in rhodesiense HAT, the proteomics results obtained in this work will contribute to further understand the mechanisms of pathology occurring in HAT and to propose new biomarkers of potential clinical utility. The mass spectrometry raw data are available in the Pride Archive via ProteomeXchange through the identifier PXD001082.

The ability of pharmacological agents to target both "classical" risk factors and inflammation may be key for successful outcomes in the prevention and treatment of atherogenesis. Among the promising drugs interfering with cholesterol metabolism, we investigated whether methyl beta-cyclodextrin (KLEPTOSE (R) CRYSMEB) could positively impact on atherogenesis, lipid profile and atherosclerotic plaque inflammation in ApoE(-/-) mice. Eleven-week old ApoE(-/-) mice were fed either a normal diet (N.D.) or a high-cholesterol diet (H.D.), resulting in different levels of hypercholesterolemia. KLEPTOSE (R) CRYSMEB (40 mg/kg) or vehicle was intraperitoneally administrated 3 times per week in the last 16 weeks before euthanasia in mice under N.D. and in the last 11 weeks under H.D. Treatment with KLEPTOSE (R) CRYSMEB reduced triglyceride serum levels in both atherogenesis mouse models. In H.D. mice, treatment with KLEPTOSE (R) CRYSMEB increased HDL-cholesterol levels and reduced free fatty acids and spleen weight. In both mouse models, treatment with KLEPTOSE (R) CRYSMEB reduced atherosclerotic plaque size in thoraco-abdominal aortas and intraplaque T lymphocyte content, but did not induce relevant improvements in other histological parameters of vulnerability (macrophage, neutrophil, MMP-9 and collagen content). Conversely and more markedly in H.D. mice, treatment with KLEPTOSE (R) CRYSMEB was associated with a reduction in genetic markers of Th1-mediated immune response. In vitro, KLEPTOSE (R) CRYSMEB dose-dependently abrogated Th1 proliferation and IFN gamma release. In conclusion, treatment with KLEPTOSE (R) CRYSMEB reduced atherosclerotic plaque size by improving triglyceride serum levels and Th1-mediated response. These results indicate this drug as a potential tool for blocking atheroprogression associated with different severity degrees of hypercholesterolemia. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Glycation represents the first stage in the development of diabetic complications. Aspirin was shown to prevent sugars reacting with proteins, but the exact mechanism of this interaction was not well defined. We performed a quantitative analysis to calculate the levels of acetylation and glycation of haemoglobin, among others red blood cell (RBC) proteins, using a label free approach. After glucose incubation, increases in the acetylation levels were seen for several haemoglobin subunits, while a parallel decrease of their glycation levels was observed after aspirin incubation. These results suggest that, a mutual influence between these two modifications, occur at protein level.

8 p.-2 fig., The transcription factor (TF) Snail1 is a major inducer of the epithelial–mesenchymal transition (EMT) during embryonic development and cancer progression. Ectopic expression of Snail in murine mesenchymal stem cells (mMSC) abrogated their differentiation to osteoblasts or adipocytes. We used either stable isotopic metabolic labeling (SILAC) for 3T3-L1 cells or isobaric labeling with tandem mass tags (TMT) for mMSC stably transfected cells with Snail1 or control. We carried out a proteomic analysis on the nuclear fraction since Snail is a nuclear TF that mediates its effects mainly through the regulation of other TFs. Proteomics data have been deposited in ProteomeXchange via the PRIDE partner repository with the dataset identifiers PXD001529 and PXD002157 (Vizcaino et al., 2014) [1]. Data are associated with a research article published in Molecular and Cellular Proteomics (Pelaez-Garcia et al., 2015), This research was supported by grants to established research groups (AECC), BIO2012-31023 from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, S2011/BMD-2344/ (Colomics2) from Comunidad de Madrid and Grant PRB2 (IPT13/0001 – ISCIII-SGEFI/FEDER) from ProteoRed-ISCIII.

Experimental data from animal models and clinical studies support connections between the haemostasis and inflammation in atherogenesis. These interfaces among inflammation and thrombogenesis have been suggested as targets for pharmacological intervention to reduce disease progression. We hypothesize that the recently discovered antithrombotic drug Sulphated Galactan (SG) (isolated from the red marine alga Acanthophora muscoides) might reduce atherosclerotic plaque vulnerability and inflammatory gene expression in 10-week aged apolipoprotein E deficient (ApoE-/-) mice under high-cholesterol diet for additional 11 weeks. Then, the underlying cellular mechanisms were investigated in vitro. SG (10 mg/kg) or Vehicle was subcutaneously injected from week 6 until week 11 of the diet. Treatment with SG reduced intraplaque macrophage and Tissue Factor (TF) content as compared to Vehicle-treated animals. Intraplaque TF co-localized and positively correlated with macrophage rich-areas. No changes on atherosclerotic plaque size, and other intraplaque features of vulnerability (such as lipid, neutrophil, MMP-9 and collagen contents) were observed. Moreover, mRNA expression of MMPs, chemokines and genetic markers of Th1/2/reg/17 lymphocyte polarization within mouse aortic arches and spleens was not affected by SG treatment. In vitro, treatment with SG dose-dependently reduced macrophage chemotaxis without affecting TF production. Overall, the chronic SG treatment was well tolerated. In conclusion, our results indicate that SG treatment reduced intraplaque macrophage content (by impacting on cell recruitment) and, concomitantly, intraplaque TF content of potential macrophage origin in atherosclerotic mice. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Protein databases are a gold mine of potential new drug targets. The ready access to a complete overview of all aspects of protein biology provides the most benefit at the outset of drug discovery pipelines. Ideally, curation strategies used to move from the raw data to the validated knowledge should contain the checks and balances necessary for accuracy. The neXtProt human protein knowledgebase is used here as an example to give insight into these methods.

International audience; The high throughput characterization of protein N-termini is becoming an emerging challenge in the proteomics and proteogenomics fields. The present study describes the free N-terminome analysis of human mitochondria-enriched samples using trimethoxyphenyl phosphonium (TMPP) labelling approaches. Owing to the extent of protein import and cleavage for mitochondrial proteins, determining the new N-termini generated after translocation/processing events for mitochondrial proteins is crucial to understand the transformation of precursors to mature proteins. The doublet N-terminal oriented proteomics (dN-TOP) strategy based on a double light/heavy TMPP labelling has been optimized in order to improve and automate the workflow for efficient, fast and reliable high throughput N-terminome analysis. A total of 2714 proteins were identified and 897 N-terminal peptides were characterized (424 N-α-acetylated and 473 TMPP-labelled peptides). These results allowed the precise identification of the N-terminus of 693 unique proteins corresponding to 26% of all identified proteins. Overall, 120 already annotated processing cleavage sites were confirmed while 302 new cleavage sites were characterized. The accumulation of experimental evidence of mature N-termini should allow increasing the knowledge of processing mechanisms and consequently also enhance cleavage sites prediction algorithms. Complete datasets have been deposited to the ProteomeXchange Consortium with identifiers PXD001521, PXD001522 and PXD001523 (http://proteomecentral.proteomexchange.org/dataset/PXD001521, http://proteomecentral.proteomexchange.org/dataset/PXD0001522 and http://proteomecentral.proteomexchange.org/dataset/PXD001523, respectively).

Sweat is one of the less employed biofluids for discovery of markers in spite of its increased application in medicine for detection of drugs or for diagnostic of cystic fibrosis. In this research, human sweat was used as clinical sample to develop a screening tool for lung cancer, which is the carcinogenic disease with the highest mortality rate owing to the advanced stage at which it is usually detected. In this context, a method based on the metabolite analysis of sweat to discriminate between patients with lung cancer versus smokers as control individuals is proposed. The capability of the metabolites identified in sweat to discriminate between both groups of individuals was studied and, among them, a trisaccharide phosphate presented the best independent performance in terms of the specificity/sensitivity pair (80 and 72.7%, respectively). Additionally, two panels of metabolites were configured using the PanelomiX tool as an attempt to reduce false negatives (at least 80% specificity) and false positives (at least 80% sensitivity). The first panel (80% specificity and 69% sensitivity) was composed by suberic acid, a tetrahexose, and a trihexose, while the second panel (69% specificity and 80% sensitivity) included nonanedioic acid, a trihexose, and the monoglyceride MG(22:2). Thus, the combination of the five metabolites led to a single panel providing 80% specificity and 79% sensitivity, reducing the false positive and negative rates to almost 20%. The method was validated by estimation of within-day and between-days variability of the quantitative analysis of the five metabolites.