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Der erste Teil dieser Dissertation befasst sich mit dem Twister Sister Ribozym, welches zur Klasse der kleinen selbst-spaltenden Ribozyme zugeordnet wird. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Moleküle, die eine wichtige Spezies nichtkodierender RNAs darstellen. Sie spielen eine essentielle Rolle in verschieden biochemischen Prozessen wie dem Splicing, der Reifung der tRNA und oder bei Replikation subgenomischer Elemente. Eine Untergruppe von Ribozymen umfasst die Klasse der kleinen nukleolytischen,selbstspaltenden Ribozyme. Die jüngste Entdeckung von Twister, Twister-Sister, Pistol und Hatchet hat das Interesse an dieser Ribozyme-Unterklasse neu entfacht. In Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen rund um Aiming Ren (Zhejiang University) und Dinshaw Patel (MSKCC) wurden Twister-Sister Ribozym Konstrukte für die Röntgenstrukturanalyse entworfen. Von einem Vier-Wege Twister-Sister Ribozym konnte schlussendlich die 3-dimensionale Struktur gelöst werden. Diese erhaltene Kristallstruktur veranschaulicht die Faltungstopologie und liefert tiefe Einblicke in die Architektur des aktiven Zentrums. Mit Hilfe eines HPLC-basierten Spaltungsassays wurde der Einfluss von Mutationen gemäß der Strukturorganisation wichtiger Nukleosidpositionen bewertet. Die umfassenden Studien zeigen auch die entscheidenden Nuktleotide im katalytischen Zentrum auf, die möglicherweiße den Mechanismus der Schneideaktivität des Ribozyms unterstützen.Der zweite Teil meiner Arbeit stellt eine neue Syntheseroute zur Dartellung von 3-Deazaguanosine und dem entsprechenden Phosphoramidit-Baustein für die RNA Festphasensynthese dar. Zur Vervollständigung wurde auch die freie Nukleobase 3-Deazaguanine auf einem neuen effizienten Weg hergestellt. Insbesondere das 3-Deazaguanosinphosphoramidit füllt eine lange Lücke in Bezug auf atomare Mutagenesestudien von funktioneller RNA, da bisher weder effiziente Synthesewege veröffentlicht wurden, noch dieser Baustein kommerziell erhältlich ist. Eine erste Anwendung von c3, The first part of this thesis concerns the small nucleolytic twister sister ribozyme. Ribozymes are catalytically active RNAs and represent an important class of non-coding RNAs that play prominent roles in splicing, tRNA maturation, and replication of sub-genomic elements. Additionally, they may have played a crucial role at an early stage in the evolution of life. One subgroup of ribozymes includes the class of small nucleolytic self-cleaving ribozymes. The recent discovery of twister, twister-sister, hatchet and pistol motif sparked a widespread interest into this ribozyme subclass. In the course of this thesis, I designed and synthesized twister sister ribozyme constructs that were key to crystallize and solve the three-dimensional structure of a four-way junctional twister sister ribozyme at 2.0 Å resolution, in close collaboration with the laboratories of Aiming Ren (Zhejiang University) and Dinshaw Patel (MSKCC). To this end, I developed a HPLC-based, two strand cleavage assay to evaluate the impact of mutations at nucleosides positions that are deemed functionally important according to the structural organization. Together, this comprehensive study provides deep insights into overall folding topology and pre-catalytic active site architecture of the ribozyme, and it pinpoints at the crucial nucleotides at the cleavage site that are likely involved in catalysis.The second part of my thesis presents a novel synthesis of 3-deazaguanosine (c3G) and the corresponding phosphoramidite building block for RNA solid-phase synthesis. To complete the full set of the c3G family, the free nucleobase 3-deazaguanine has also been prepared by a new efficient route. In particular, the 3-deazaguanosine phosphoramidite fills a long-standing gap with respect to atomic mutagenesis studies of functional RNA since neither efficient synthetic routes have been published to date, nor has this building block been commercially available. A first application with respect of its influenc, Elisabeth Mairhofer, MSc., Kumulative Dissertation aus drei Artikeln, Im Artikel sind die Zahlen hochgestellt, Dissertation Universtität Innsbruck 2019

vorgelegt von Eva Neuner, MSc., Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers, Zusammenfassung in deutscher Sprache, Dissertation Universität Innsbruck 2019, Arbeit gesperrt

Ribonukleinsäuren (RNA) haben verschiedene Elemente mit denen sie die Regulation von Genen steuern können. Während einige durch Konformationsänderungen aktiv werden, wie zum Beispiel Ribozyme und Riboschalter, stützen sich andere RNAs auf Modifikationen wie schwefelhaltige Nukleobasen, welche während der Translation das Leseraster aufrechterhalten. Diese Dissertation befasst sich mit drei unterschiedlichen Genregulatoren, welche unter verschiedenen Aspekten analysiert werden. Ribozyme sind biologisch relevante, selbst-schneidende RNA-Moleküle, welche die Spaltung intramolekularen Phosphordiesterbindungen ohne Hilfe von weiteren Enzymen katalysieren. Auch wenn die verschiedenen Klassen an Ribozymen ein und dieselbe Reaktion durchführen, falten sie sich in einzigartige Sekundär- und Tertiärstrukturen. Somit sind die Faltung und die einhergehenden strukturellen Dynamiken dieser Moleküle essentiell um das aktive Zentrum, welches die Katalyse durchführt, zu bilden. Kristallopgraphie wird hierbei angewendet um die Struktur von Ribozymen und die kritischen Nucleotide des katalytischen Zentrums zu enthüllen. Jedoch die Analyse und Herstellung von Röntgenstrukturen sind sehr komplex und mit viel Arbeit verbunden. Außerdem repräsentieren Kristalle Momentaufnahmen und mangeln so an Informationen bezüglich Faltung und Dynamik. Hier, werden magnesium- und temperaturabhängige Faltungsfunktionen der kürzlich entdeckten Ribozyme Twister, Pistol, Twister-sister und Hatchet präsentiert. Selektive 2´-hydroxyl Acylierung analysiert mit Primer Extension (SHAPE) wird hierbei benutzt um Veränderung in der Sekundär- und Tertiarstruktur auf dem Level von einzelnen Nukleobasen zu überwachen. Die neuen Entdeckungen werden für Twister, Pistol und Twister-Sister anhand ihrer Kristallstruktur diskutiert. Für das Hatchet Ribozyme, für welches noch keine Kristallstruktur vorliegt, bestätigen die SHAPE Daten jedoch nicht die vorhergesagte Sekundärstruktur. Dennoch werden wichtige Nukleotide und ver, Ribonucleic acids (RNA) have more than one element with which they can regulate gene expression. Some are triggered by structural rearrangements such as ribozymes and riboswitches whereas other rely on modifications such as thiolated nucleobases by maintaining the reading-frame during translation. In this thesis, three gene controlling elements are investigated under different synthetic aspects. Ribozymes are biologically relevant, self-cleaving RNA molecules, which catalyse the cleavage of intramolecular phosphodiester bonds without the help of protein enzymes.1 Although the different ribozyme families all perform the same reaction, they fold into unique secondary and tertiary structures. Consequently, the folding path and the structural dynamics of the molecules are essential to create an active site that performs catalysis.2 To reveal a ribozyme’s structure and the critical nucleotides of the active site, crystallography is usually applied. However, the analysis of an X-ray structure is often complex and in general very laborious. Furthermore, crystals represent structural snapshots and thus lack information on the folding process and the inherent dynamics of an RNA fold. Here, magnesium and temperature-dependent features of folding of the recently discovered ribozyme classes twister, pistol, twister-sister and hatchet have been revealed and are presented. Selective 2´-hydroxyl acylation analysed by primer extension (SHAPE) is used to simultaneously monitor changes in secondary and tertiary nucleobase interactions of different domains at the single base-level. For twister, twister-sister and pistol ribozymes the new findings are discussed with the help of their crystal structures. For the hatchet ribozyme, where no crystal structure is available, the SHAPE data does not confirm the proposed secondary structure, however selected residues and putative long-distance interactions are pointed out. The second part deals with switching aptamer regions, so called riboswi, Catherina Gasser, MSc., Kumulative Dissertation aus drei Artikeln, Zusammenfassung in deutscher Sprache, Dissertation University Innsbruck 2018

Die top-down Massenspektrometrie (MS) hat sich kürzlich zu einer vielversprechenden neuen Methode zur Charakterisierung von Ribonukleinsäure (Ribonucleic Acids, RNA) -Modifikationen entwickelt, die wichtige Regulatoren der Genexpression und Schlüsselelemente für die Entwicklung von RNA-basierten Therapeutika sind. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung neuer, top-down MS basierter Methoden zur umfassenden Charakterisierung von posttranskriptionalen und synthetischen RNA-Modifikationen, einschließlich detaillierter mechanistischer Studien zum Rückgratbruch bei kollisionsaktivierter Dissoziation (Collisionally Activated Dissociation, CAD) und Dissoziation durch Elektronenablösung (Electron Detachment Dissociation, EDD). Die neu entwickelten Ansätze können zur Identifikation (Welche Modifikationen?), Lokalisation (Welche Bausteine sind modifiziert?) und zur positions-spezifischen, relativen Quantifizierung (In welchem Ausmaß sind die Bausteine modifiziert?) von RNA-Modifikationen verwendet werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die top-down Massenspektrometrie zur markierungsfreien, direkten Lokalisation und relativen Quantifizierung der RNA Nukleobasen-Methylierungen N6-Methyladenin (m6A), 5-Methylcytosin (m5C), 3-Methyluracil (m3U) und 5-Methyluracil (m5U) entwickelt. Nukleobasen-Methylierungen sind ubiquitäre posttranskriptionale RNA-Modifikationen, welche die strukturelle Vielfalt von RNA in sehr dynamischer Art und Weise wesentlich vergrößern, mit Auswirkungen auf die Genexpression und menschliche Krankheiten. Die Hochdurchsatz-Tiefen-Sequenzierung bietet jedoch im Allgemeinen keine Informationen über posttranskriptionale Modifikationen (PTMs). Ein vielversprechender alternativer Ansatz zur Charakterisierung von PTMs, das heißt, deren Identifizierung, Lokalisierung und relative Quantifizierung ist top-down MS. Es wurde untersucht, wie spezifische Nukleobasen-Methylierungen die Ionisierung bei Elektrospray-Ionisation (ESI) und den Rückgratbruch bei CA, Top-down mass spectrometry (MS) has recently emerged as a promising new approach for the characterization of ribonucleic acid (RNA) modifications as important regulators of gene expression and key elements in the development of RNA-based therapeutics. The aim of this dissertation was the development of new top-down MS based methodology for the comprehensive characterization of posttranscriptional and synthetic RNA modifications through detailed mechanistic studies of RNA backbone cleavage by collisionally activated dissociation (CAD) and electron detachment dissociation (EDD). The new approaches can be used to identify RNA modifications (What types of modifications?), to localize modifications (Which residues are modified?), and for site-specific, relative quantitation of modifications (To what extent are the residues modified?). In the first part of this thesis, top-down mass spectrometry was developed for the label-free, direct localization and relative quantitation of the RNA nucleobase methylations N6-methyladenine (m6A), 5-methylcytosine (m5C), 3-methyluracil (m3U), and 5-methyluracil (m5U). Nucleobase methylations are ubiquitous posttranscriptional modifications of RNA that can substantially increase the structural diversity of RNA in a highly dynamic fashion with implications for gene expression and human disease. However, high throughput, deep sequencing does not generally provide information on posttranscriptional modifications (PTMs). A promising alternative approach for the characterization of PTMs, i.e., their identification, localization, and relative quantitation, is top-down MS. It was investigated how specific nucleobase methylations affect RNA ionization in electrospray ionization (ESI), and backbone cleavage in CAD and EDD. For this purpose, two new approaches for the characterization of RNA methylations in mixtures of either isomers of RNA or nonisomeric RNA forms have been developed. Fragment ions from dissociation experiments were analyzed to id, von Mag. rer. nat. Heidelinde Glasner, Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin, in englischer Sprache, Dissertation Universität Innsbruck 2018