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La policitèmia vera (PV) i la trombocitèmia essencial (TE) són neoplàsies mieloproliferatives (NMP) amb una supervivència (SV) similar a la població general. No obstant això, una minoria de pacients progressen a mielofibrosi (MF) o pateixen transformació leucèmica (TL), el que produeix una marcada disminució de la SV. Hi ha un gran interès científic en la descripció dels factors de risc moleculars que intervenen en aquest procés de transformació aguda. Els objectius de l’estudi van ser avaluar la influència de les mutacions en gens driver, responsables de l’fenotip d’ambdues malalties, en la seva progressió a MF i leucèmia (LAM), així com analitzar l’impacte de l’aparició de mutacions addicionals non-driver a l’evolució clonal i progressió. A més, es va explorar el valor pronòstic de detectar mutacions non-driver a la fase crònica de la malaltia i els factors predictors de l’adquisició de noves mutacions. La metodologia utilitzada va ser la Next Generation Sequencing (NGS), utilitzant un panell de 51 gens relacionats amb patologia mieloide. En el primer treball es van analitzar factors clínic-biològics de 1747 pacients amb PV (n=896) i TE (n=851) i es van estudiar molecularment 29 mostres aparellades de fase crònica i TL. En el segon treball es van seleccionar mostres de 100 pacients amb PV i TE de llarg seguiment molecular, amb transformació aguda o suggestius d’evolució clonal, que a més presentaven determinació anual de càrrega al·lèlica de JAK2V617F. Es van estudiar mutacions en mostres seriades des de la fase crònica a la transformació aguda utilitzant el panell de amplicons de 51 gens mieloides per NGS. Resultats: En el primer treball es va trobar que el genotip CALR s’associava amb un menor risc de TL, mentre que JAK2V617F mostrava una tendència a un major risc (SHR: 2,05, IC de el 95%: 0,9-4,6 , P = 0,09). La transformació a MF va augmentar el risc de TL, excepte en pacients amb mutació CALR. La LAM es va desenvolupar en un clon JAK2V617F negatiu en 17 (58%) casos. La LAM JAK2V617F positiva es va associar significativament amb un cariotip complex i amb l’adquisició de mutacions de TP53, mentre que les mutacions de EZH2 i RUNX1 van ser més freqüents en la LAM JAK2V617F negativa. La SV va resultar significativament més gran en els pacients amb LAM JAK2V617F negativa (343 dies vs 95 dies, P = 0,003). En el segon treball va mostrar que els pacients que no van progressar a MP o LAM després de 10 anys (n=50) mostraven una baixa freqüència de mutacions en la primera mostra (18%) i una taxa d’incidència de 1,7 noves mutacions×100 anys-persona. Mentrestant, en els pacients amb PV/TE amb TL (n=12) es detectava una alta freqüència de mutacions en la primera mostra (83%) i una elevada taxa d’incidència de 25,6 mutacions×100persones-any. La presència de mutacions en el moment de la diagnosi va ser l’únic factor de risc per adquirir un nou esdeveniment genètic després de la correcció per edat , diagnòstic de PV i durada total de l’exposició a hidroxiurea (HU). Els pacients amb mutació non-driver a la primera mostra van mostrar una major probabilitat de desenvolupar citopènia sota la teràpia HU i un major risc de LAM. El predictor més fort de transformació a MF va ser la càrrega al·lèlica de JAK2V617F persistentment alta o l’augment progressiu. En conclusió, el genotip CALR s’associa amb un menor risc de TL i la LAM que sorgeix en un clon negatiu per JAK2V617F és independent de TP53 i mostra una millor SV. Les mutacions non-driver juguen un paper clau en la TL en NMP JAK2V617F positives i poden detectar-se mitjançant tècniques de NGS. La policitemia vera (PV) y la trombocitemia esencial (TE) son neoplasias mieloproliferativas (NMP) con una supervivencia (SV) similar a la población general. Sin embargo, una minoría de pacientes progresan a mielofibrosis (MF) o sufren transformación leucémica (TL), lo que produce una marcada disminución de la SV. Hay un gran interés científico en la descripción de los factores de riesgo moleculares que intervienen en este proceso de transformación aguda. Los objetivos del estudio fueron evaluar la influencia de las mutaciones en genes driver, responsables del fenotipo de ambas enfermedades, en su progresión a MF y leucemia (LAM), así como analizar el impacto de la aparición de mutaciones adicionales non-driver en la evolución clonal y progresión. Además, se exploró el valor pronóstico de detectar mutaciones non-driver en la fase crónica de la enfermedad y los factores predictores de la adquisición de nuevas mutaciones. La metodología utilizada fue la Next Generation Sequencing (NGS), utilizando un panel de 51 genes relacionados con patología mieloide. En el primer trabajo se analizaron factores clínico-biológicos de 1747 pacientes con PV (n=896) y TE (n=851) y se estudiaron molecularmente 29 muestras pareadas de fase crónica y TL. En el segundo trabajo se seleccionaron muestras de 100 pacientes con PV y TE de largo seguimiento molecular, con transformación aguda o sugestivos de evolución clonal, que además presentaban determinación anual de carga alélica de JAK2V617F. Se estudiaron mutaciones en muestras seriadas desde la fase crónica a la transformación aguda utilizando el panel de amplicones de 51 genes mieloides por NGS. Resultados: En el primer trabajo se encontró que el genotipo CALR se asociaba con un menor riesgo de TL, mientras que JAK2V617F mostraba una tendencia a un mayor riesgo (SHR: 2,05, IC del 95%: 0,9–4,6, P = 0,09). La transformación a MF aumentó el riesgo de TL, excepto en pacientes con mutación CALR. La LAM se desarrolló en un clon JAK2V617F negativo en 17 (58%) casos. La LAM JAK2V617F positiva se asoció significativamente con un cariotipo complejo y con la adquisición de mutaciones de TP53, mientras que las mutaciones de EZH2 y RUNX1 fueron más frecuentes en la LAM JAK2V617F negativa. La SV resultó significativamente mayor en los pacientes con LAM JAK2V617F negativa (343 días frente a 95 días, P = 0,003). En el segundo trabajo mostró que los pacientes que no progresaron a MF o LAM tras 10 años (n=50) mostraban una baja frecuencia de mutaciones en la primera muestra (18%) y una tasa de incidencia de 1,7 nuevas mutaciones×100 años-persona. Mientras, en los pacientes con PV/TE transformados a LAM (n=12) se detectaba una alta frecuencia de mutaciones en la primera muestra (83%) y una elevada tasa de incidencia de 25,6 mutaciones×100 personas-año. La presencia de mutaciones en el momento del diagnóstico fue el único factor de riesgo para adquirir un nuevo evento genético (HR 2,7, IC 95% 1,1-6,8, p = 0,03) después de la corrección por edad, diagnóstico de PV y duración total de la exposición a hidroxiurea (HU). Los pacientes con mutación non-driver en la primera muestra mostraron una mayor probabilidad de desarrollar citopenia bajo la terapia HU y un mayor riesgo de LAM (HR 12,2, IC 95% 2,6-57,1, p = 0,001). El predictor más fuerte de transformación a MF fue la carga alélica de JAK2V617F persistentemente alta o el aumento progresivo (HR 10,8, IC del 95%: 2,4–49,1, p = 0,002). En conclusión, el genotipo CALR se asocia con un menor riesgo de TL y la LAM que surge en un clon negativo para JAK2V617F es independiente de TP53 y muestra una mejor SV. Las mutaciones non-driver juegan un papel clave en la TL en NMP JAK2V617F positivas y pueden detectarse mediante técnicas de NGS. Polycythemia vera (PV) and essential thrombocythemia (TE) are myeloproliferative neoplasms (MPN) with similar overall survival (SV) to the general population. However, a minority of patients progress to myelofibrosis (MF) or leukemic transformation (TL), which means an important decrease in SV. There is great scientific interest in the description of the molecular risk factors involved in this acute transformation process. The objectives of the study were to evaluate the influence of driver genes mutations, (responsible for the phenotype of both diseases), in the progression to MF and leukemia (AML), as well as to analyze the impact of additional non-driver mutations on clonal evolution. In addition, the prognostic value of detecting non-driver mutations in the chronic phase of the disease and the predictive factors for the acquisition of new mutations, were explored. The methodology used was Targeting Sequencing (Next Generation Sequencing, NGS). An amplicon panel of 51 myeloid related genes was selected. In the first work, clinical-biological factors of 1747 patients with PV (n=896) and ET (n=851) were analyzed and 29 paired samples of chronic phase and TL were studied by NGS. In the second study, samples of 100 patients with PV and ET with long molecular follow-up, with acute transformation or those suggestive of clonal evolution, who also had annual determination of allelic burden of JAK2V617F, were selected. Mutations in serial samples from chronic phase to acute transformation were studied using NGS. Results: In the first study, it was found that the CALR genotype was associated with a lower risk of LT, while JAK2V617F showed a trend towards a higher risk (SHR: 2.05, 95% CI: 0.9–4.6, P = 0.09). Transformation to MF increased the risk of LT, except in patients with a CALR mutation. AML developed in a negative JAK2V617F clone in 17 (58%) cases. Positive JAK2V617F AML was significantly associated with a complex karyotype and acquisition of TP53 mutations, while EZH2 and RUNX1 mutations were more frequent in negative JAK2V617F AML. Survival was significantly longer in patients with negative JAK2V617F AML (343 days vs.. 95 days, P = 0.003). The second study showed that patients who did not progress to MF or AML after more than 10 years (n=50) showed a low frequency of mutations in the first sample (18%) and an incidence rate of 1.7 new mutations × 100 person-years. Meanwhile, in patients with PV / ET transformed to LAM (n=12) a high frequency of mutations was detected in the first sample (83%) and a high incidence rate of 25.6 mutations × 100 person-years. The presence of mutations at the time of diagnosis was the only risk factor for acquisition of a new genetic event (HR 2.7, 95% CI 1.1-6.8, p=0.03) after correction for age, PV diagnosis and total duration of exposure to hydroxyurea (HU). Patients with a non-driver mutation in the first sample showed a greater probability of developing cytopenia under HU therapy and a higher risk of AML (HR 12.2, 95% CI 2.6-57.1, p=0.001). The strongest predictor of transformation to MF was a persistently high JAK2V617F allelic burden or a progressive increase (HR 10.8, 95% CI 2.4–49.1, p=0.002). In conclusion, the CALR genotype is associated with a lower risk of LT and the AML that appear in a negative clone for JAK2V617F is independent of TP53 and shows a better SV. Non-driver mutations play a key role in LT of JAK2V617F positive MPN and can be detected by NGS techniques at diagnosis in most cases. Therefore, this technique may be useful to identify a minority of PV and ET patients with high genetic instability and increased risk of LT. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

Los criterios diagnósticos de la Policitemia Vera (PV) se han ido modificando a lo largo de los años paralelamente a los nuevos descubrimientos científicos. Sin embargo, algunos aspectos de los criterios para establecer el diagnóstico de esta entidad siguen siendo controvertidos. En este contexto, realizamos tres trabajos. El primer trabajo tenía como objetivo identificar que parámetro, hemoglobina (Hb) o hematocrito (Hto), era mejor marcador indirecto de aumento de la masa eritrocitaria, así como identificar el valor de corte de Hb o Hto que indicaría la necesidad de realizar el estudio de la masa eritrocitaria por métodos isotópicos en pacientes con sospecha diagnóstica de PV o trombocitemia esencial. El Hto mostró mejor exactitud diagnóstica que la Hb. El valor de Hto para recomendar el estudio de la masa eritrocitaria estaba entre 0.48 L/L y 0.52 L/L. En el segundo trabajo, se evaluó la exactitud diagnóstica de la Eritropoyetina sérica y de la carga alélica de JAK2V617F como marcadores diagnósticos de PV. Se observó que aunque ambos son buenos marcadores de PV, su adición a los criterios diagnósticos mejora discretamente la exactitud diagnóstica. Además en este segundo trabajo se analizó la sensibilidad y la especificidad de diferentes combinaciones de criterios diagnósticos, observando que los del BCSH (British Committee for Standards in Haematology) constituyen una forma sencilla y fiable para establecer el diagnóstico de PV. El tercer trabajo tenía como objetivo evaluar la exactitud diagnóstica de la biopsia de médula ósea y valorar la correlación de los hallazgos histológicos con la presencia de mutaciones y con la evolución clínica. Observamos que los criterios histológicos de la OMS tienen una baja sensibilidad como consecuencia de una importante variación inter-observador dando lugar a una escasa exactitud diagnóstica., Diagnostic criteria of Polycythemia Vera (PV) have been modified over the years in parallel with the new scientific discoveries. However, some aspects remain controversial. In this context, we do three studies. The first of them was aimed to identify which parameter, hemoglobin (Hb) or hematocrit (Ht), was the best indirect marker of increased red cell mass, as well as to identify the cut-off value for Hb or Ht that would indicate the need to perform a Red Cell Mass study in patients with suspected diagnosis of PV or essential thrombocythemia. Ht showed greater diagnostic accuracy than Hb. The Ht value to recommend the Red Cell Mass study was between 0.48 L/L and 0.52 L/L. In the second study, the objective was to evaluate the diagnostic accuracy of serum Erythropoietin and JAK2V617F allele burden as markers of PV. Although both were good markers of PV, their addition to the diagnostic criteria improved only slightly the diagnostic accuracy. In addition, this second study analyzed the sensitivity and specificity of different combinations of diagnostic criteria, observing that BSCH (British Committee for Standards in Haematology) are a simple and reliable way to establish the diagnosis of PV. The third study aimed to evaluate the diagnostic accuracy of the bone marrow biopsy and to assess its correlation with presence of mutations and clinical outcomes showed that WHO histological criteria have a low sensitivity as a consequence of an important inter-observer variation resulting in a low diagnostic accuracy.