Search

OBJECTIVE: To identify disease-causing variants in autosomal recessive axonal polyneuropathy with optic atrophy and provide targeted replacement therapy. METHODS: We performed genome-wide sequencing, homozygosity mapping, and segregation analysis for novel disease-causing gene discovery. We used circular dichroism to show secondary structure changes and isothermal titration calorimetry to investigate the impact of variants on adenosine triphosphate (ATP) binding. Pathogenicity was further supported by enzymatic assays and mass spectroscopy on recombinant protein, patient-derived fibroblasts, plasma, and erythrocytes. Response to supplementation was measured with clinical validated rating scales, electrophysiology, and biochemical quantification. RESULTS: We identified biallelic mutations in PDXK in 5 individuals from 2 unrelated families with primary axonal polyneuropathy and optic atrophy. The natural history of this disorder suggests that untreated, affected individuals become wheelchair-bound and blind. We identified conformational rearrangement in the mutant enzyme around the ATP-binding pocket. Low PDXK ATP binding resulted in decreased erythrocyte PDXK activity and low pyridoxal 5'-phosphate (PLP) concentrations. We rescued the clinical and biochemical profile with PLP supplementation in 1 family, improvement in power, pain, and fatigue contributing to patients regaining their ability to walk independently during the first year of PLP normalization. INTERPRETATION: We show that mutations in PDXK cause autosomal recessive axonal peripheral polyneuropathy leading to disease via reduced PDXK enzymatic activity and low PLP. We show that the biochemical profile can be rescued with PLP supplementation associated with clinical improvement. As B6 is a cofactor in diverse essential biological pathways, our findings may have direct implications for neuropathies of unknown etiology characterized by reduced PLP levels. ANN NEUROL 2019;86:225-240. ispartof: ANNALS OF NEUROLOGY vol:86 issue:2 pages:225-240 ispartof: location:United States status: published

BACKGROUND: ATTRV30M amyloidosis is a lethal autosomal dominant sensorimotor and autonomic neuropathy caused by amyloid deposition composed of aggregated misfolded TTR monomers with the V30M mutation. The age of onset in patients with ATTRV30M varies in different foci and the mechanism behind it is still unknown. METHODS: The tertiary neurology center following all ATTRV30M patients in Cyprus was used to collect demographic data to estimate; prevalence, incidence, penetrance, anticipation, time from disease onset to diagnosis and transplantation. Ocular, cardiac and leptomeningeal involvement in transplanted patients was explored. Correlation of C1q tagging SNPs with age of disease onset was carried out. RESULTS: Prevalence and incidence for ATTRV30M neuropathy in Cyprus are 5.4/100,000 and 0.3/100,000 respectively. Mean age of onset is 40.6 years and anticipation is 8.3 years. Penetrance reaches 51% and 75% by the ages of 50 and 80 years respectively. In liver transplanted patients rates of ocular, cardiac and leptomeningeal involvement were estimated to be 60%, 20% and 16%, respectively. C1q polymorphisms correlated with age of disease onset. CONCLUSIONS: ATTRV30M neuropathy has a rising prevalence in Cyprus due to improved survival of patients. Late onset complications are becoming a major problem. Complement C1q appears to be a modifier in this disease.

Includes bibliographical references (p. 118-149). Number of sources in the bibliography: 408 Thesis (Ph. D.) -- University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciences, 2015. The University of Cyprus Library holds the printed form of the thesis. Η Twist-1 εκφράζεται ως επί το πλείστον κατά την ανάπτυξη και έχει προηγουμένως συνδεθεί με τον έλεγχο της μυογένεσης. Δεδομένου ότι ο ρόλος της στη μυογένεση δεν έχει αξιοποιηθεί πλήρως, ο στόχος της μελέτης ήταν να προσδιορίσει miRNAs στο μυ που ρυθμίζουν τη Twist-1. Ένα από τα πιο σημαντικά myomiRs, το miR-206, είναι αναγνωρισμένο ως ένα πιθανό υποψήφιο για το Twist-1 mRNA. Προσδιορισμοί λουσιφεράσης και επιμολύνσεις σε εμβρυϊκούς ανθρώπινους μυοβλάστες, έδειξαν ότι η Twist-1 είναι ένας άμεσος στόχος για το miR-206 και μέσω αυτής της οδού προωθείται η διαφοροποίηση των μυϊκών κυττάρων. Επίσης διερευνήθηκε εάν το MyoD, ένας σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας της μυογένεσης, ρυθμίζει τη Twist-1, αφού είναι γνωστό ότι επάγει την γονιδιακή έκφραση του miR-206. Βρήκαμε ότι η υπέρ-έκφραση του MyoD προκαλεί αύξηση του miR-206 και μείωση της έκφρασης της Twist-1, μέσω του miR-206 και προάγει την αύξηση της διαφοροποίησης των μυϊκών κυττάρων. Τέλος, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε μυϊκά κύτταρα από ασθενείς με μυοτονική δυστροφία τύπου 1, τα οποία αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν προς μυοσωληνάρια. Η υπέρ-έκφραση του MyoD ανέστειλε την έκφραση της Twist-1 μέσω του miR-206, που επίσης ακολουθείται από μια αύξηση στη διαφοροποίηση των μυϊκών κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό που εμπλέκεται στη μυογένεση, που θα μπορούσε επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη μυϊκή νόσο. Twist-1 is mostly expressed during development and has been previously shown to control myogenesis. Since its regulation in muscle has not been fully exploited, the aim of the project was to identify miRNAs in muscle which regulate Twist-1. miR-206, one of the most important myomiRs, was identified as a possible candidate for Twist-1 mRNA. Luciferase assays and transfections in human foetal myoblasts showed that Twist-1 is a direct target for miR-206 and through this pathway muscle cell differentiation is promoted. We next investigated whether MyoD, a major myogenic transcription factor regulates Twist-1, since it is known that MyoD induces miR-206 gene expression. We found that forced MyoD expression induces miR-206 up-regulation and Twist-1 down-regulation through miR-206 promoter binding, followed by increase in muscle cell differentiation. Finally, experiments were performed in muscle cells from patients with congenital Myotonic Dystrophy type 1 which fail to differentiate to myotubes. MyoD overexpression inhibited Twist-1 through miR-206 induction, followed by an increase in muscle cell differentiation. These results reveal a novel mechanism of myogenesis which might also play an important role in muscle disease.

Includes bibliographical references (p. 78-90). Number of sources in the bibliography: 145 Thesis (Ph. D.) -- University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciences, 2015. The University of Cyprus Library holds the printed form of the thesis. At head of title: Πανεπιστήμιο Κύπρου, The Cyprus Institute of Neurology & Genetics. Research Supervisor: Kleopas A. Kleopa. Abstract in Greek. Οι χασμοσυνδέσμοι στα ολιγοδενδροκύτταρα σχηματίζονται κυρίως από την κοννεξίνη 47 (Cx47) και κοννεξίνη 32 (Cx32). Υπολειπόμενες μεταλλάξεις στο γονίδιο GJC2, της Cx47 προκαλούν την ασθένεια Pelizaeus-Merzbacher, η οποία υπάγεται στην κατηγορία των υπομυελινωτικών λευκοδυστροφιών, ενώ μεταλλάξεις στο γονίδιο GJB1, της Cx32 προκαλούν περιφερική νευροπάθεια, χρόνια ή οξεία παροδική εγκεφαλοπάθεια. Τα ποντίκια στα οποία λείπουν και τα δύο γονίδια της Cx32 και Cx47 (Cx32/Cx47dKO) αναπτύσσουν σοβαρή απομυελίνωση του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) που αρχίζει σε ηλικία ενός μηνός και οδηγεί στο θάνατο μέσα σε λίγες εβδομάδες. Αυτό το μοντέλο λευκοδυστροφίας προσφέρεται για μελέτη των μηχανισμών αυτή της νόσου. Προκειμένου να διευκρινιστεί αν η απώλεια των χασμοσυνδέσμων στα ολιγοδενδροκυττάρα έχει αυτόνομες κυτταρικές επιδράσεις, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν την άγριου-τύπου ανθρώπινη Cx32 υπό τον έλεγχο του υποκινητή της πρωτεολιπιδικής πρωτεΐνης ποντικού για την απόκτηση εξωγενούς έκφρασης hCx32 σε ολιγοδενδροκύτταρα. Με την αναπαραγωγή των ιδρυτών με Cx32KO ποντίκια, πήραμε την έκφραση της hCx32 σε Cx32KO ποντίκια, που επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση. Παρατηρήσαμε έντονη έκφραση της στα ολιγοδενδροκύτταρα του ΚΝΣ στα TG+Cx32KO ποντίκια όπως επίσης εντοπισμό και ο σχηματισμό χασμοσυνδέσμων σε αυτά κατά μήκος της μυελίνης. Με περαιτέρω διασταύρωση αυτών των ποντικιών με Cx47KO ποντίκια δημιουργηθήκαν τα TG+Cx32/Cx47dKO τα οποία έδειξαν ότι η διαγονιδιακή έκφραση της hCx32 έσωσε τη σοβαρή απομυελίνωση του ΚΝΣ σε ποντίκια Cx32/Cx47dKO, με αποτέλεσμα την σημαντική βελτίωση των ανωμαλιών συμπεριφοράς από τον 1ο μήνα της ηλικίας τους, και την πρόληψη της πρόωρης θνησιμότητας. Επιπλέον, οι TG+Cx32/Cx47dKO ποντικοί έδειξαν σημαντική βελτίωση της απομυελίνωσης ενώ οι φλεγμονές και οι αστρογλιοτικές αλλαγές αντιστράφηκαν πλήρως σε σύγκριση με τους Cx32/Cx47dKO στον 1 μήνα ηλικίας. Η μελέτη μας επιβεβαιώνει ότι η απώλεια των χασμοσυνδέσμων στα ολιγοδενδροκυττάρα έχει αυτόνομες επιδράσεις και με την αντικατάσταση τουλάχιστον μιας κοννεξίνης επιτυγχάνεται η διόρθωση του φαινοτύπου της λευκοδυστροφίας και επανασύνδεση των χασμοδυνδέσμων. Oligodendrocytes are coupled by gap junctions (GJs) formed mainly by connexin47 (Cx47) and connexin32 (Cx32). Recessive GJC2/Cx47 mutations cause Pelizaeus–Merzbacher-like disease, a hypomyelinating leukodystrophy, while GJB1/Cx32 mutations cause peripheral neuropathy and chronic or acute-transient encephalopathy syndromes. Cx32/Cx47 double knockout (Cx32/Cx47dKO) mice develop severe CNS demyelination beginning at 1 month of age leading to death within weeks, offering a relevant model to study disease mechanisms. In order to clarify whether the loss of oligodendrocyte connexins has cell autonomous effects, we generated transgenic mice expressing the wild-type human Cx32 under the control of the mouse proteolipid protein (Plp) promoter, obtaining exogenous hCx32 expression in oligodendrocytes. By crossing these mice with Cx32KO mice, we obtained expression of hCx32 on Cx32KO background. Immunohistochemical and immunoblot analysis confirmed strong CNS expression of hCx32 specifically in oligodendrocytes and correct localization forming GJs at cell bodies and along the myelin sheath. TG+Cx32/Cx47dKO mice were generated by further crossing with Cx47KO mice. Transgenic expression of hCx32 rescued the severe early phenotype of CNS demyelination in Cx32/Cx47dKO mice, resulting in marked improvement of behavioral abnormalities at 1 month of age, and prevented the early mortality. Furthermore, TG+Cx32/Cx47dKO mice showed significant improvement of myelination compared with Cx32/Cx47dKO CNS at 1 month of age, while the inflammatory and astrogliotic changes were fully reversed. Our study confirms that loss of oligodendrocyte GJs has cell autonomous effects and that re-establishment of GJ connectivity by replacement of at least one GJ protein provides correction of the leukodystrophy phenotype.

Includes bibliographical references (p. 67-76). Number of sources in the bibliography: 121 Thesis (Ph. D.) -- University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciences, 2015. The University of Cyprus Library holds the printed form of the thesis. Η μη-επεμβατική προγεννητική διάγνωση αποτέλεσε ένα από τους πιο απαιτητικούς ερευνητικούς τομείς των δύο τελευταίων δεκαετιών. Η ανακάλυψη της παρουσίας ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στην μητρική κυκλοφορία αποτέλεσε κινητήριο μοχλό για πολλές ομάδες που στόχευαν στην ανίχνευση εμβρυοειδικών βιοδεικτών. Η ανίχνευση του εμβρυϊκού DNA (~10%) παρουσία μητρικού DNA (90%) απαιτεί την εφαρμογή μεθόδων εμπλουτισμού υψηλής ευαισθησίας και ακρίβειας. Μέσω της επιγενετικής, η ομάδα μας ταυτοποίησε διαφορετικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs) του εμβρύου και της μητέρας στα χρωμοσώματα 21, 18, 13, X και Y, και ανέπτυξε μια μη επεμβατική προγεννητική μέθοδο για την ανίχνευση της τρισωμίας 21. Ο πρωταρχικός σκοπός της μελέτης αυτής αφορά στη διερεύνηση της πιθανότητας η μεταβλητότητα του εμβρυϊκού ποσοστού να επηρεάσει το σωστό προσδιορισμό της τρισωμίας 21, χρησιμοποιώντας την υπάρχουσα μέθοδο MeDIP. Με τη χρήση qPCR, πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση 224 μητρικών δειγμάτων αίματος και 124 μητρικών δειγμάτων πλάσματος, για την συσχέτιση των εμβρυϊκών ποσοστών και της διαγνωστικής αξίας της μεθοδολογίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεταβλητότητα των εμβρυϊκών ποσοστών δεν επηρεάζει τον σωστό καθορισμό της τρισωμίας 21. Ο δεύτερος στόχος αποσκοπεί στην ανάπτυξη μιας μεθόδου εμβρυϊκού εμπλουτισμού, για την αύξηση του ποσοστού του εμβρυϊκού DNA που βρίσκεται στη μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και το σωστό προσδιορισμό των εμβρύων με τρισωμία 21. Χρησιμοποιώντας δείγματα χοριονικών λαχνών (CVS) και δείγματα πλάσματος από μη εγκυμονούσες γυναίκες, ετοιμάστηκαν δείγματα που μιμούνται τα ποσοστά DNA (μητρικό και εμβρυϊκό) όπως εντοπίζονται στο πλάσμα της μητέρας κατά την κύηση. Τα συγκεκριμένα δείγματα, χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση ακολουθούμενη από digital PCR, επιτυγχάνοντας τη σωστή ταξινόμηση των τρισωμικών δειγμάτων από τα φυσιολογικά, και καθιστώντας τη νέα μέθοδο έτοιμη για επικύρωση. Ο τρίτος σκοπός αυτής της μελέτης, αφορά στην επέκταση του πίνακα των εμβρυϊκών βιοδεικτών μελετώντας το εμβρυϊκό RNA. Αυτό θα προσδιορίσει, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (DEGs) μεταξύ των φυσιολογικών εμβρύων και των εμβρύων με τρισωμία 21. Μικροσυστοιχίες έκφρασης που καλύπτουν όλο το RNA, εφαρμόστηκαν σε RNA δείγματα από φυσιολογικές και τρισωμικές χοριονικές λάχνες (CVS), και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα RNA δείγματα από τη μητέρα. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες συσχέτισης, των DEGs σε μεταγραφικό επίπεδο σε σχέση με το πρότυπο μεθυλίωσης και τον φαινότυπο του συνδρόμου Down. Ανιχνεύθηκαν πολλαπλά DEGs ειδικά για την τρισωμία 21, πολλά από τα οποία βρέθηκαν να σχετίζονται με το φαινότυπο του συνδρόμου Down. Τα μεθυλιωμένα πρότυπα των DEGs δεν έδειξαν να συσχετίζονται με το μεταγραφικό επίπεδο. Λόγω της μεταβλητότητας του μεταγραφικού επιπέδου που παρουσιάζεται μεταξύ διαφορετικών ατόμων, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων προκειμένου να επικυρωθούν τα ευρήματα αυτής της μελέτης. Συμπερασματικά η μελέτη αυτή χρησιμοποιεί υπάρχουσες διαφορές μεταξύ της μητέρας και του εμβρύου, και πέτυχε την ανάπτυξη μιας μη επεμβατικής προγεννητικής μεθοδολογίας για τη διάκριση της τρισωμίας 21 από φυσιολογικά έμβρυα. Επιπλέον, επέκτεινε τον πίνακα των εμβρυϊκών βιοδεικτών με τον εντοπισμό νέων διαφορών ανάμεσα στη μητέρα και το έμβρυο που θα μπορούσαν στο μέλλον να χρησιμοποιηθούν για την μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Non-invasive prenatal diagnosis has been one of the most challenging fields in the past two decades. The discovery of fetal nucleic acids in the maternal circulation encouraged several groups to work on the identification of fetal specific biomarkers. Recovery of fetal DNA fragments (~10%) in the presence of maternal DNA (90%) requires high sensitivity and specificity enrichment methods. Our group has successfully used epigenetics to identify differentially methylated regions (DMRs) between the fetus and the mother on chromosomes 21, 18, 13, X and Y, and developed a non-invasive prenatal methodology (MeDIP-qPCR) for the detection of trisomy 21. The first objective of this study aims to investigate whether the variability of fetal percentage among individuals affects the correct classification of trisomy 21 using the existing MeDIP methodology. Quantification of 224 maternal whole blood and 124 maternal plasma samples was carried out, by qPCR, followed by correlation studies between the fetal percentages and the diagnostic value of the methodology. Results showed that the variability of fetal amount among individuals does not interfere with the correct classification of trisomy 21. The second objective targets the development of a robust fetal epigenetic enrichment method which will increase the proportion of fetal DNA in maternal circulation during pregnancy and correctly classify trisomy 21 fetuses. Spike-in samples were prepared using chorionic villi samplings (CVS) DNA and non-pregnant female plasma DNA which are used to imitate the maternal DNA. These samples underwent immunoprecipitation followed by digital PCR for quantification. Correct classification of trisomy 21 spike-in samples from normal ones was achieved. This newly developed method is now ready for validation. The third objective of this study aims to expand the panel of fetal specific biomarkers by uncovering the fetal transcriptome. This will identify differentially expressed genes (DEGs) among the trisomy 21 and normal fetuses from their mothers. Expression microarrays covering the whole transcriptome were applied to normal and trisomy 21 CVS RNA samples together with their matching maternal RNA. Association studies of identified DEGs transcription level with their methylation patterns and Down syndrome phenotype were performed. Multiple trisomy 21 specific DEGs were identified and were found to be associated with the Down syndrome phenotype. Methylation patterns of DEGs showed no association with the transcription level. Due to the transcription level variability among individuals, identified DEGs must be further investigated in a large-scale study in order to confirm our findings. As a conclusion this work utilised already existing differences between the mother and the fetus, DMRs, and succeeded the development of a non-invasive prenatal methodology for the discrimination of trisomy 21 from normal fetuses. In addition, it expanded the panel of fetal specific biomarkers by identifying new differences between the mother and the fetus which can potentially be used for non-invasive prenatal diagnosis.

Includes bibliographical references (p. 50-58). Number of sources in the bibliography: 108 Thesis (Ph. D.) -- University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciences, May 2012. The University of Cyprus Library holds the printed form of the thesis. Η παρούσα διατριβή έχει επικεντρωθεί στη διερεύνηση εμπλοκής γνωστών γονιδίων του κολλαγόνου τύπου IV της βασικής μεμβράνης του σπειράματος (COL4A4, COL4A5) καθώς και στην έρευνα για νέα γονίδια που συνδέονται με Οικογενή Μικροσκοπική Αιματουρία. Βασικός στόχος αποτέλεσε η κλινική και μοριακή διερεύνηση οικογενειών από Κυπριακό και Ελλαδικό χώρο, με απώτερο σκοπό την προσφορά προσυμπτωματικής διάγνωσης όπου ενδείκνυται, επιβεβαίωση διάγνωσης, πρόγνωσης και πρόληψης, μέσω τεκμηρίωσης του γενετικού λάθους. Φαινότυποι και διαγνώσεις που αφορούν το παρόν ερευνητικό έργο περιλαμβάνουν τις βασικότερες νόσους που έχουν συσχετιστεί με μικροσκοπική αιματουρία σπειραματικής προέλευσης, την Νεφροπάθεια των Λεπτών Βασικών Μεμβρανών (ΝΛΒΜ) και το Σύνδρομο Alport (φυλοσύνδετο και αυτοσωμικό). Για την ταυτοποίηση μεταλλαγών στο COL4A5, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του γονιδίου αυτού σε εννέα οικογένειες (από Κυπριακό και Ελλαδικό χώρο), που πληρούσαν προϋποθέσεις για Σύνδρομο Alport φυλοσύνδετης κληρονόμησης. Στo πλαίσιο μελέτης συσχέτισης του γονιδίου COL4A4 με την μικροσκοπική αιματουρία, επιλέχθηκαν 123 ασθενείς εκ των οποίων περιλαμβάνονται τόσο περιπτώσεις οικογενούς κληρονόμησης, όσο και σποραδικές. Επιπρόσθετος στόχος της παρούσης ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε και ταυτοποίηση γενετικών τροποποιητικών παραγόντων που ευθύνονται για την ύπαρξη ήπιας και σοβαρότερης μορφής οικογενούς μικροσκοπικής αιματουρίας. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε με βάση προηγούμενων ευρημάτων στα γονίδια MYH9 και APOL1. Ανάμεσα σε 42 ασθενείς με υποψία για Σύνδρομο Alport φυλοσύνδετης κληρονόμησης, έχουν ταυτοποιηθεί τέσσερις μεταλλάξεις (E228X, 2946delT, G624D and P628L). Φορείς των δύο αντικαταστάσεων παρουσιάζουν ηπιότερο φαινότυπο (μικροσκοπική αιματουρία με ή χωρίς πρωτεϊνουρία), ως αποτέλεσμα ΝΛΒΜ. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο και με αποτελέσματα άλλων ερευνητικών ομάδων. Κατά την σάρωση του γονιδίου COL4A4, έχουν ταυτοποιηθεί εφτά συνολικά μεταλλάξεις (L30F, G143V, G208D, G748S, G774S, G1015E, g. 70540del52bp). Αξίζει να σημειωθεί ότι το 23% των ανδρών και 14.3% των γυναικών φορέων COL4A4 μετάλλαξης προοδεύουν σε Χρόνια Νεφρική Νόσο και Νεφρική Νόσο Τελικού Σταδίου, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα ευρήματα. Εν κατακλείδι, η διερεύνηση ταυτοποίησης γενετικών τροποποιητικών παραγόντων έδειξε συσχέτιση rs11089788-MYH9 με αυξανόμενο κίνδυνο για αρνητική εξέλιξη της νόσου σε νεφρική ανεπάρκεια. Familial microscopic hematuria (MH) of glomerular origin represents a heterogeneous group of monogenic conditions, involving several genes, some of which remain unknown. Three collagen IV genes, COL4A3, COL4A4 and COL4A5 explain the autosomal and X-linked forms of Alport Syndrome (ATS), as well as Thin Basement Membrane Nephropathy (TBMN). A number of X-linked ATS patients follow a milder course reminiscent of that of patients with heterozygous COL4A3/COL4A4 mutations and TBMN, while at the same time a significant subset of patients with TBMN and familial microscopic hematuria progress to chronic kidney disease or end-stage kidney disease. The present study was based on the hypothesis according to which many families or sporadic cases of microscopic hematuria, combined or not with renal failure, may be explained by COL4A3, COL4A4 or COL4A5 mutations. Firstly, DNA analysis using haplotype construction was performed for Xq22-23 (COL4A5) and 2q36-37 (COL4A3/COL4A4) loci was performed, followed by screening and identification of relevant causative mutations in these genes. In addition, this work was aiming to genotype-phenotype correlation of X-linked ATS patients, as well as to the identification of modifier genetic factors responsible for the existence of mild and severe cases of familial hematuria. We based our decision solely on the strength on previous genetic associations implicating MYH9 and APOL1 genes. Among 42 patients of nine Hellenic families suspected to have X-linked Alport syndrome, eleven nucleotide variants were identified, four of which are causative mutations (E228X, 2946delT, G624D and P628L). The findings in families segregating mutations G624D and P628L are indicative of less severe phenotypes, stretching the phenotypic expression to only microhematuria with or without proteinuria, as a result of TBMN. This observation is confirmed by several investigators. During screening of COL4A4 gene seven mutations (L30F, G143V, G208D, G748S, G774S, G1015E, g. 70540del52bp) were detected as well as numerous SNPs. Interestingly, the percentage of the individuals progressing either to CKD or ESKD, reaches 23% for male and 14.3% for female mutation carriers. Recent data on a large Cypriot cohort confirm that not all TBMN cases will follow a benign course and regular annual check-ups, including tests for proteinuria, should alert patients and physicians to the possibility of progression into CKD and eventually ESKD. A renal biopsy should be seriously considered at this stage and appropriate measures should be taken to arrest the progression of the disease. Finally, experimentations for modifier genetic factor investigation showed significance only for rs11089788-MYH9. The finding that rs11089788 is important and critical in increasing the risk for proteinuria and progressive renal failure on the background of a primary monogenic glomerulopathy may prove useful regarding early and effective interventions. However, it remains unclear how certain non-coding MYH9 variants are associated with renal failure in multiple populations and nephropathies.