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El empleo de ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) para el control de plagas de insectos es objeto de un gran interés en tiempos recientes. El principal modo de acción de los AME es el del contacto directo a través del tegumento del insecto, lo que ha propiciado el desarrollo de un amplio abanico de bioinsecticidas (micoinsecticidas) que actúan por contacto. Sin embargo, estos hongos cuentan con un modo de acción secundario asociado a una función ecológica descrita en el siglo XXI que alberga un notorio potencial en protección de cultivos, su condición endófita, que consiste en la ingestión por parte del insecto de tejidos de la planta colonizados por el agente fúngico de control biológico, que complementa al anterior y brinda un grado de control adicional. Asimismo, se están explorando nuevos horizontes de aplicación de estos hongos (ya sea por contacto o por vía endofítica), lo que incluye su uso conjunto con enemigos naturales, depredadores y parasitoides, con objeto de definir estrategias innovadoras de manejo integrado. Por otro lado, algunos AME pueden desempeñar papeles relacionados con la protección de cultivos más allá del control de insectos fitófagos, donde destaca el antagonismo frente a organismos fitopatógenos. De esta forma, la aplicación de AME en campo podría no solo controlar eficazmente las plagas de insectos, sino proporcionar, además, cierta protección frente a enfermedades de cultivos. La presente tesis explora el potencial de cepas endófitas de hongos entomopatógenos para el control de plagas, con énfasis en el impacto de este nuevo modo de acción sobre las relaciones tritróficas insecto-planta-enemigo natural entomófago, así como su posible acción dual para proteger a la planta frente a microorganismos fitopatógenos. En el primer caso, se ha evaluado el empleo conjunto de la cepa endófita EAMa 01/58-Su del AME Metarhizium brunneum (Petch) (Hypocreales: Clavicipitaceae) y del himenóptero endoparasitoide Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae) para el control de la rosquilla negra, Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), de acuerdo con los dos modos de acción descritos. Este noctuido es uno de los insectos fitófagos más nocivos y ubicuos de toda la cuenca mediterránea, donde origina de manera recurrente severas plagas en cultivos de enorme importancia económica. La literatura científica provee evidencias de la aptitud de ambos agentes, la cepa EAMa 01/58-Su y el referido parasitoide, para el control de S. littoralis, si bien no se ha incidido en su aplicación simultánea. Por ello, se han diseñado diferentes estrategias de aplicación combinada para el control de “la rosquilla negra” tanto en experimentos de laboratorio como in planta, para dilucidar las posibles interacciones multitróficas derivadas de la conjunción de la planta, el entomopatógeno, el fitófago y el enemigo natural entomófago. Los resultados de esta primera línea se presentan en los capítulos II y III. En la segunda línea de la tesis, se ha profundizado en el potencial de cinco cepas de los AME M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 01/158-Su y EAMb 09/01-Su) y Beauveria bassiana Bals. (Vuill) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EABb 01/33-Su y EABb 04/01-Tip) frente a importantes patógenos de girasol. En concreto, los patógenos objeto de estudio fueron los hongos de suelo Verticillium dahliae Kleb. y Cadophora helianthi (L. Molinero-Ruiz, A. Martin-Sanz, C. Berlanas and D. Gramaje), cuyo control en campo se halla amenazado por la aparición de nuevas razas en el primer caso y por la ausencia de alternativas para su control en el segundo, y el oomiceto Plasmopara halstedii Farl. Berl. & de Toni, agente causal del mildiu de girasol, cuyo manejo está condicionado por la aparición de poblaciones resistentes a las materias activas registradas para uso contra este patógeno y por la identificación de nuevas razas de mayor virulencia. Específicamente, se evaluó el antagonismo de los AME frente a V. dahliae y C. helianthi mediante la técnica del cultivo dual y la reducción de síntomas de verticilosis en plantas de girasol tratadas con los AME en condiciones de invernadero. El efecto de los AME sobre P. halstedii se estudió en cultivo axénico durante 14 días, periodo máximo durante el que las plántulas pudieron crecer en este sistema in vitro que limita su desarrollo fenológico completo. Para ello, se evaluaron los síntomas de mildiu expresados por las plántulas y se analizó el efecto que ejercieron las cepas de AME sobre el crecimiento del girasol durante este limitado periodo de tiempo. Adicionalmente, se estudió el perfil racial de las poblaciones de P. halstedii presentes en España y otros países europeos en los últimos años. Los resultados concernientes a esta segunda línea se exponen a lo largo de los capítulos IV y V. En el capítulo II se incidió en la compatibilidad entre H. didymator y la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum en condiciones de laboratorio. Se estudiaron los efectos directos e indirectos derivados de la aplicación directa del AME en adultos del parasitoide mediante pulverización de los mismos con suspensiones de conidios. Aunque el tratamiento fúngico por contacto directo a dosis elevadas, escenario que supera las peores condiciones posibles en pleno campo, redujo de manera significativa la esperanza de vida del parasitoide con mortalidad algo superior al 60%, no tuvo efecto sobre su potencial reproductivo durante los días que siguieron a la inoculación. Asimismo, se evaluaron dos estrategias de aplicación simultánea del hongo y el parasitoide para el control de S. littoralis, exposición al hongo de manera previa al parasitoide y viceversa, con diferentes intervalos de aplicación de cada agente. Las dos estrategias resultaron adecuadas para el control del noctuido, evidenciando la compatibilidad de ambos agentes de biocontrol al tener su empleo conjunto efecto aditivo en todas las estrategias y combinaciones. No obstante, se observó una disminución significativa en el potencial reproductivo de los parasitoides de la siguiente generación emergidos a partir de las larvas de S. littoralis tratadas con el hongo respecto a los emergidos de larvas no tratadas de la misma generación. Además, se constató que el parasitismo de H. didymator ocasiona una reducción en el número de hemocitos presentes en la hemolinfa de las larvas de S. littoralis, una depresión del sistema inmune de los individuos parasitados con impacto en una mayor proporción de larvas diagnosticadas con crecimiento fúngico. Por último, las hembras de H. didymator evidenciaron una preferencia significativa por aquellas larvas de S. littoralis no tratadas con hongo en ensayos de elección junto a larvas inoculadas con el entomopatógeno. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este capítulo ponen de manifiesto la elevada compatibilidad entre la cepa EAMa 01/58-Su y el parasitoide H. didymator, a pesar de los efectos derivados del contacto directo del hongo con el himenóptero. Se ha demostrado la eficacia de su aplicación combinada para controlar a la rosquilla negra, abriendo puertas a los experimentos desarrollados en el capítulo III. En el capítulo III se ha explorado la vía endofítica de la cepa EAMa 01/58-Su, así como la del contacto, en sistemas tritróficos con plantas de melón pulverizadas con suspensiones de conidios del entomopatógeno. Las plantas tratadas, que fueron colonizadas endofíticamente por el AME, se ofrecieron como única fuente de alimento a larvas S. littoralis en experimentos tanto in vitro como in vivo. Asimismo, las larvas se expusieron a adultos de H. didymator en diferentes intervalos de tiempo. Se evaluó la colonización endofítica de las plantas 48 h después del tratamiento, que alcanzó porcentajes muy altos (≈90%) en todos los bioensayos, lo que pone de manifiesto la destacada propiedad endófita de la cepa EAMa 01/58-Su. La inclusión del parasitoide afectó significativamente la mortalidad de S. littoralis; de hecho, aquellos tratamientos en los que las larvas del noctuido se expusieron al parasitoide registraron los mayores porcentajes de mortalidad en los ensayos in vitro e in planta. Sin embargo, la exposición simultánea al hongo y el parasitoide en los diferentes sistemas multitróficos no aumentó la mortalidad de S. littoralis respecto a los tratamientos en los que las larvas únicamente se ofrecieron al parasitoide. Por otro lado, el tiempo de exposición al hongo y al parasitoide no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad de S. littoralis, sobre los ratios de parasitismo ni tampoco sobre la proporción de larvas con micosis. Al igual que en el capítulo II, se evaluó la preferencia del parasitoide por larvas expuestas al AME, si bien en el capítulo III se alimentó a las larvas del noctuido con hoja de melón colonizada endofíticamente, en lugar de efectuar un tratamiento directo de las larvas con el entomopatógeno. Como en el capítulo II, las hembras del parasitoide evidenciaron una inequívoca predilección por las larvas que no habían sido expuestas al hongo. Finalmente, se llevó a cabo un estudio histológico en el que se examinaron larvas de S. littoralis expuestas conjuntamente a H. didymator y el entomopatógeno a fin de determinar la posible existencia de relaciones intrahospedante y observar el desarrollo de ambos agentes de biocontrol en el interior del noctuido. Las micrografías presentadas muestran, por primera vez, la coexistencia de los dos agentes dentro del hospedante y el desarrollo de la larva del parasitoide a pesar de la infección fúngica. Los resultados presentados ponen de manifiesto la compatibilidad entre H. didymator y M. brunneum en sistemas in planta, sentando las bases de futuras estrategias de aplicación simultánea para controlar a la rosquilla negra en el campo o en invernadero. En el capítulo IV se investigó el efecto de dos cepas de B. bassiana (EABb 01/33-Su y EABb 04/01-Tip) y tres de M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 09/01-Su y EAMb 01/158-Su) frente a los hongos de suelo causantes de marchiteces de girasol V. dahliae y C. helianthi. Los cinco AME inhibieron significativamente el crecimiento miceliar de los fitopatógenos en cultivo dual en medio de cultivo agar extracto de malta. Los porcentajes de inhibición oscilaron entre el 8.3 y el 63.5% en el caso de V. dahliae, y entre el 19.6 y el 37.4% en el de C. helianthi. Esta inhibición dependió tanto de la cepa del AME como del aislado del patógeno en los cultivos duales con V. dahliae, pero solo de la cepa del AME en los cultivos con C. helianthi. La cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana presentó la mayor capacidad inhibitoria frente ambos patógenos. De acuerdo a los cultivos duales y a observaciones al microscopio, los AME ejercieron dos tipos de antagonismo: competición o antibiosis. Sin embargo, mientras que cuatro de los cinco entomopatógenos causaron únicamente uno de los dos antagonismos, la cepa EAMa 01/58-Su (incluida en los capítulos II y III), fue capaz de ejercer ambos, como ya se había descrito con anterioridad. Por otro lado, dos de los AME (EABb 01/33-Su y EAMb 09/01-Su) redujeron significativamente la severidad de los síntomas de verticilosis en plantas de girasol cultivadas en invernadero (severidades de 31 y 53%, respectivamente, en comparación con 95% en las plantas control inoculadas con V. dahliae pero no tratadas con AME). Los AME persistieron en el sustrato durante al menos dos meses tras el tratamiento, a excepción de la cepa EABb 04/01-Tip, que no pudo recuperarse del sustrato más allá de la séptima semana. Por último, los cinco AME se detectaron molecularmente en las plantas al final del experimento (dos meses después de haber sido aplicados al suelo). Curiosamente, solo se detectaron molecularmente en aquellas plantas tratadas con AME pero no inoculadas con V. dahliae, lo que sugiere que la inhibición del hongo fitopatógeno por parte del AME tiene lugar en el suelo y, como consecuencia, la subsiguiente colonización de la planta por V. dahliae se reduce. En el capítulo V se ha abordado el manejo del mildiu de girasol desde una doble perspectiva, esto es, resistencia genética y control biológico. En la primera aproximación se han obtenido datos actualizados acerca del perfil racial de las poblaciones de P. halstedii presentes en España y, en menor grado, Francia, Italia, Portugal y Rumanía, en los últimos años. El método empleado para ello, basado en la reacción de nueve líneas diferenciales de girasol a la inoculación con el patógeno, permitió la identificación de 23 razas diferentes en Europa, de las cuales 22 se confirmaron en España, siendo las razas 310, 304, 705 y 715 más frecuentes que el resto. No solo la diversidad racial de P. halstedii fue mayor que en años anteriores, sino también la presencia de razas altamente virulentas. Por otro lado, se evaluó el efecto de las cinco cepas de AME sobre la severidad de la enfermedad en plántulas de girasol y sobre el desarrollo de estas en cultivo axénico solo durante los primeros 14 días, dado el carácter limitante de este cultivo in vitro para el desarrollo vegetal. Ninguna de las cepas de AME redujo de manera significativa la severidad ni afectó al crecimiento de las plantas durante las dos semanas estudiadas, cuando estas se trataron e inocularon, respectivamente, con ambos organismos. Cuando las plantas se trataron solo con los AME, se observaron para la cepa EABb 01/33-Su y, en menor medida, otras dos, las pautas características de evolución de su desarrollo asociadas al establecimiento del endófito. Finalmente, se obtuvieron porcentajes variables de aislamiento de los AME a partir de las plántulas, si bien la detección molecular de los entomopatógenos solo resultó posible en algunas cepas y únicamente en ausencia de P. halstedii, lo que revela que el método empleado no favorece la acción de los entomopatógenos ni es el más adecuado para la colonización endofítica. En conclusión, la presente tesis doctoral incide en los mecanismos subyacentes tras las interacciones que tienen lugar en sistemas multitróficos que incluyen plantas, agentes de control biológico macrobianos y microbianos y organismos fitófagos o fitopatógenos. El AME M. brunneum posee un destacable potencial para su aplicación conjunta con el parasitoide H. didymator en distintas condiciones. Adicionalmente, las cinco cepas de M. brunneum y B. bassiana, y en particular EABb 01/33-Su y EAMb 09/01-Tip, han resultado ser candidatos muy prometedores para el manejo de algunos hongos patógenos de girasol a la luz del antagonismo in vitro frente a V. dahliae y C. helianthi y, sobre todo, de la reducción de la severidad de la verticilosis en girasol. No obstante, debe profundizarse en el empleo de los AME para el control del mildiu, puesto que no se ha evidenciado un efecto positivo sobre la severidad de dicha enfermedad en cultivo axénico en las condiciones experimentales utilizadas. Finalmente, los cinco entomopatógenos mostraron una aptitud endofítica muy marcada en girasol (en el caso de la cepa EAMa 01/58-Su, también en melón). La profundización en estas líneas de investigación contribuirá a definir estrategias de aplicación de los AME en el campo como parte de sistemas de gestión integrada de plagas. The use of entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMA) for pest control has received increased attention in the last years. The main mode of action of EMA is via direct contact through the insect integument, which has led to the development of a wide variety of contact bioinsecticides (mycoinsecticides) around the world. However, an alternative mode of action of these EMA related to their new ecological role as endophytes has been described in the XXI century. Indeed, feeding of insect pest on endophytically colonised plant tissues may cause an additional insect mortality that improves the outcome of foliar applications of EMA against chewing. Moreover, strategies including joint use of EMA (either by direct contact or via endophytism) and macrobial biocontrol agents (i.e., predators and parasitoids) are being considered as promising alternatives within IPM programs. On the other hand, EMA may play other roles linked to plant protection in the frame of these new ecological roles, such as the protection of the plant against plant pathogens. Thus, these fungi may provide certain levels of disease control while effectively controlling insect pests. In this way, the present thesis explores the potential of endophytic strains of entomopathogenic fungi for pest control, with emphasis on the impact of this new mode of action on the tritrophic insectplant- entomophagous natural enemy relationships, as well as its possible dual action to protect the plant against phytopathogenic microorganisms. Regarding the former, simultanous use of an endophytic strain of the EMA Metarhizium brunneum (Petch) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EAMa 01/58-Su) and the hymenopteran endoparasitoid Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae) to control the cotton leafworm, Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) under different conditions has been explored. This noctuid is one of the most noxious polyphagous widespread insect pests in the Mediterranean basin, causing economic losses to several crops of great economic importance. Both EAMa 01/58-Su strain and the parasitoid have been proved to be suitable candidates for controlling S. littoralis in previous research, although their combined use has not yet been investigated. Thus, we assessed different strategies to control the cotton leafworm both in laboratory and in planta conditions, delving into multitrophic interactions between plant, pest and natural enemy. The results concerning this line are presented in chapters II and III. In the second line of the thesis, it has been investigated the potential of five strains of the EMA M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 01/158-Su and EAMb 09/01- Su) and Beauveria bassiana Bals. (Vuill) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EABb 01/33-Su and EABb 04/01-Tip) against important sunflower pathogens. Specifically, the pathogens were Verticillium dahliae Kleb. and Cadophora helianthi (L. Molinero-Ruiz, A. Martin-Sanz, C. Berlanas and D. Gramaje), two soilborne fungi causing sunflower wilts whose management is threatened by the appearance of populations of increased pathogenicity and by the total absence of control alternatives, respectively. Also the effect of EMA against Plasmopara halstedii Farl. Berl. & de Toni, causal agent of downy mildew of sunflower, was assessed. In this case, the management of the disease is hampered by either fungicideresistant or highly virulent pathogen populations. The antagonism of the EMA against V. dahliae and C. helianthi was tested in vitro by dual plating, whereas the reduction of verticillium wilt was evaluated in sunflowers treated with the EMA and grown under greenhouse conditions. The effect of AME on P. halstedii was studied in axenic culture for 14 days, the maximum period during which the seedlings could grow in this in vitro system that limits their complete phenological development. Hence, the symptoms of mildew expressed by the seedlings were evaluated and the effect exerted by the AME strains on the growth of sunflower during this limited period of time was analysed. Moreover, we present an updated racial characterization of P. halstedii populations from Spain and other European countries. The results obtained in this line are presented in chapters IV and V. In chapter II, compatibility between H. didymator and M. brunneum EAMa 01/58-Su strain was investigated in laboratory conditions. We studied both direct and indirect effects of the EMA toward parasitoid adults when directly applied by spraying them with conidial suspensions. Although the direct contact fungal treatments at the higher dose significantly reduced the parasitoids’ life expectancy and caused a mortality slightly above 60%, their reproductive potential during the days after treatment was not affected. Furthermore, we evaluated two strategies for simultaneous application of fungus and parasitoid to control S. littoralis (exposure to fungus before parasitoid and vice versa at different releasing times). Both strategies were suitable for controlling this noctuid and showed compatibility between the two biocontrol agents, with additive effect in all combinations. However, we observed a significant reduction on the parasitization capability of the F1 parasitoid generation emerged from fungus-treated S. littoralis larvae compared with parasitoids emerged from non-treated larvae of the same generation. Moreover, we observed that parasitization significantly reduced the number of haemocytes in the haemolymph of S. littoralis larvae, which caused a depletion on the immune system of the parasitized larvae, therefore promoting fungal pathogenesis and fungal outgrowth from the cadavers. Finally, parasitoid females showed a significant preference for non-treated S. littoralis larvae compared with fungus-treated larvae. Therefore, the results obtained in this chapter demonstrated high compatibility between the fungal strain and the parasitoid, despite direct and indirect effects of the fungus on parasitoids via direct contact, as well as a high efficacy of the simultaneous application of both biocontrol agents to control the cotton leafworm. This work opens doors to the experiments performed in chapter III. In chapter III, we explored the impact of the endophytic behaviour of the EAMa 01/58-Su strain on the abovementioned multitrophic interactions. Hence, we sprayed melon plants with conidial suspensions, being subsequently colonized endophytically, and fed S. littoralis larvae on colonized plants in different in vitro and in vivo experiments. In addition, larvae were exposed to H. didymator adults at different releasing times. The sprayed plants were successfully colonized by the EMA within the first hours after fungal treatment in all the experiments, revealing the high endophytic behaviour of this strain. Total mortality of S. littoralis larvae was significantly affected by the presence of the parasitoid. Moreover, all treatments including the parasitoid achieved the highest mortality rates both in vitro and in planta. However, simultaneous exposure to the fungus and the parasitoid did not significantly affect the total mortality of S. littoralis larvae compared with when the parasitoid was used alone. The time between exposure to fungus and parasitoid did not affect S. littoralis mortality, nor parasitism or infection rates in any experiment. As in chapter II, we evaluated the parasitoid’s preference for larvae exposed to the EMA, although in this case larvae were not directly treated, but fed on fungal-colonized plant. As in the previous chapter, parasitoids showed a significant preference for those larvae that had not been exposed to the EMA. Finally, we conducted a histological study of S. littoralis larvae simultaneously parasitized by H. didymator and infected by M. brunneum in order to examine intra-host relationships and observe the development of both biocontrol agents inside S. littoralis. Our micrographs showed, for the first time, the coexistence of both agents within the same host and the development of H. didymator larvae despite fungal colonization of S. littoralis. Our findings provide key information on compatibility between H. didymator and M. brunneum in in planta systems, what is a first step to deploy sustainable IPM programs for controlling the cotton leafworm at field and greenhouse conditions. In chapter IV, the effect of two B. bassiana strains (EABb 01/33-Su and EABb 04/01-Tip) and three strains of M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 09/01-Su and EAMb 01/158-Su) against the soilborne pathogens causing sunflower wilt V. dahliae y C. helianthi, was investigated. The five EMA were able to significantly inhibit the mycelial growth of both V. dahliae and C. helianthi when dually plated onto malt extract agar medium. The inhibition ranged from 8.3 to 63.5% in the case of V. dahliae, and from 19.6 to 37.4% in C. helianthi. Percentages of inhibition were dependent on both the EMA and the pathogen isolate in dual cultures with V. dahliae, whereas they were only dependent on the EMA in the case of C. helianthi. EABb 01/33-Su strain was the most effective antagonist against both pathogens. According to the dual cultures and microscopic examinations, two types of antagonism were exerted by the EMA: competition or antibiosis. Whereas most of the EMA were associated to only one type of antagonism, EAMa 01/58-Su strain (included in chapters II and III) was able of exert both, which had been reported in previous research. On the other hand, two EMA (EABb 01/33-Su and EAMb 09/01-Su) significantly inhibited the severity of verticillium wilt symptoms in sunflowers grown in the greenhouse (severities of 31 y 53%, respectively, as compared to 95% in control plants only inoculated with V. dahliae). The EMA were able to persist in the soil for at least two months after treatments, with the exception of EABb 04/01-Tip strain, which persistence reached up to the seventh week. Finally, the five EMA were molecularly detected inside the sunflowers at end of experiments (two months after application to soil), showing that their endophytic ability can exceed the transient period of plant colonization that has been reported for these fungi. Interestingly, the EMA only were molecularly detected inside the sunflowers in treatments with EMA not inoculated with V. dahliae. This finding suggests that the inhibition of V. dahliae by EMA occurs in the soil and, as a consequence, subsequent colonization of sunflower by the pathogen is reduced. In chapter V, the management of downy mildew of sunflower was explored from two perspectives: genetic resistance and biological control. On the one hand, we present an updated racial characterization of P. halstedii populations from Spain, France, Italy, Portugal and Romania. The races were assigned by means of the response of nine sunflower differential lines to inoculation with each of the pathogen populations. Twenty-three races were identified in Europe, whereas twenty-two of them were detected in Spain. The most frequent races were 310, 304, 705 and 715. The variety of races of P. halstedii was wider than in previous years, whereas we identified a high number of highly virulent ones. On the other hand, the effect of the five EMA strains on the severity of the disease in sunflower seedlings and on their development in axenic culture was evaluated only for 14 days, given the limitations of this in vitro culture for plant development. None of the EMA strains significantly reduced the severity or affected the growth of the plants during the two weeks studied, when they were treated and inoculated, respectively, with both organisms. When the plants were inoculated only with EMA strains, the characteristic growth developmental patterns associated with the establishment of the endophyte were detected in plants treated with EABb 01/33-Su and, to a lesser extent, other two fungal strains. Although the EMA were isolated from plants in different percentages, they were molecularly detected only when they were applied without P. halstedii. Our results suggest that the assayed conditions were not suitable for the endophytic colonization of plants by EMA nor for the infection by P. halstedii. In conclusion, the present thesis delves into the mechanisms underlying multitrophic interactions in systems including plants, macro- and/or microbial biological control agents and plant pests or pathogens. The EMA M. brunneum has shown a remarkable potential to be simultaneously applied with H. didymator under different conditions. Furthermore, the five strains of the EMA M. brunneum and B. bassiana, particularly EABb 01/33-Su and EAMb 09/01-Tip, are promising candidates to control some sunflower pathogens due to their in vitro antagonism against V. dahliae and C. helianthi and, above all, to the reduced severity of verticillium wilt when they were applied to sunflowers. However, the potential of EMA against downy mildew of sunflower must be thoroughly studied. In axenic culture, none of the tested EMA showed any effect on the severity of symptoms by P. halstedii. Finally, the five EMA showed a lasting endophytic property in sunflower and EAMa 01/58-Su also in melon. However, further research will elucidate possible strategies for application of these EMA in the field as part of IPM programs.

La evolución de la agricultura hacia un modelo más sostenible requiere reemplazar progresivamente los insecticidas químicos de síntesis por otras alternativas de control de plagas de insectos más respetuosas con el medioambiente y el ser humano, para garantizar la seguridad e inocuidad alimentarias. El control microbiano de plagas es una de estas alternativas, y dentro de los microorganismos entomopatógenos, los hongos entomopatógenos (HE), por su presencia natural y modo de acción por contacto, presentan un gran potencial para el control de varios grupos de insectos de gran relevancia agrícola, como los fitomizos, y muy en particular los pulgones. Durante el siglo XXI, se han puesto de manifiesto distintas asociaciones de los HE con las plantas con nuevas funciones ecológicas, en la rizosfera, en el filoplano, y como endófitos, que han ampliado las posibilidades de su empleo para el control de plagas, y de forma más amplia, en producción vegetal. Sin embargo, permanecen desconocidos los posibles efectos directos e indirectos de la colonización endofítica de las plantas por los HE no sólo sobre el insecto hospedante, sino sobre las señales químicas producidas por las plantas, y, por tanto, sobre las relaciones insecto fitófago-planta o incluso en las de los insectos fitófagos con sus enemigos naturales En la presente tesis doctoral se ha estudiado el efecto de la colonización endofítica de plantas de melón por cepas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuil. y Metarhizium brunneum Petch, tanto sobre la biología del “pulgón del algodón” Aphis gossypii Glover, (Homoptera: Aphididae), importante plaga polífaga de cultivos hortícolas, como sobre su comportamiento alimenticio y capacidad de transmitir virus persistentes y no persistentes, y además, el impacto de esta colonización sobre las señales químicas producidas por la planta y las relaciones del pulgón con sus enemigos naturales entomófagos, para su posible empleo en estrategias de control integrado del áfido. El capítulo II pone de manifiesto que la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana reduce significativamente la población de A. gossypii tanto cuando los especímenes se alimentan a expensas de hojas pulverizadas y colonizadas, como cuando lo hacen a expensas de hojas colonizadas distantes de las pulverizadas, mientras que las cepas EABb 04/01-Tip de B. bassiana y EAMa 01/58-Su de M. brunneum solo redujeron la población en la primera circunstancia (aunque a un nivel de significación del 10% también en la segunda). La eficacia como endófita de la cepa EABb 01/33-Su para manifestar su máxima virulencia en tejidos distantes a los tratados en plantas de melón ha hecho que fuera seleccionada para ser utilizada a lo largo de los experimentos llevados a cabo en los capítulos III y IV. En este capítulo además, se destaca una falta de efecto de la colonización endófitica de plantas de melón con las tres cepas seleccionadas sobre fecundidad total per capita de los pulgones 5 días después de la exposición, aunque se detecta una modificación en el comportamiento reproductivo de los pulgones que se alimentan a expensas de plantas colonizadas, que, con respecto a los especímenes sanos, aceleran su actividad reproductiva para alcanzar con anterioridad su máximo potencial biótico. En este capítulo, se describen en primicia diferencias cualitativas y cuantitativas en el perfil de compuestos volátiles liberados por las plantas colonizadas endofíticamente e infestadas posteriormente por A. gossypii en comparación con los compuestos que emiten las plantas testigo. Sin embargo, la colonización endofítica de plantas por AMEs no influye en su elección por parte de los pulgones. En el capítulo III se ha estudiado la influencia de la colonización endofítica sobre el comportamiento alimenticio de los pulgones y a la transmisión de virus persistentes y no persistentes. Mediante el empleo de la técnica de gráficos de penetración eléctrica (EPGs), aplicada por primera vez a pulgones que se alimentan a expensas de plantas colonizadas con hongos entomopatógenos, ha sido posible detectar la actividad del estilete del insecto y relacionarla con los procesos de transmisión de virus en plantas de melón colonizadas con la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana. Los resultados revelan que dicha colonización no afecta al comportamiento alimenticio de A. gossypii asociado a la inoculación del Cucumovirus no persistente, Cucumber mosaic virus (CMV), y al Polerovirus persistente Cucurbit aphid-borne yellows virus, pero modifica algunas relacionadas con el proceso de adquisición de virus no persistentes, posiblemente asociadas con alteraciones en el comportamiento alimenticio del pulgón debidas a un mesófilo con estructuras fúngicas o los metabolitos secretados por ellas o incluso por la activación de las defensas de la planta. Además, los ensayos de transmisión llevados a cabo revelan que la incidencia de los dos virus estudiados se ve significativamente reducida cuando las plantas se encuentran colonizadas endofíticamente con la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana antes de producirse su infestación con pulgones virulíferos, lo que posiblemente se debe a la inducción de resistencia sistémica consecuencia de la colonización de la planta por el hongo. Finalmente, en el capítulo IV se determina el efecto de la colonización endofítica de los AMEs sobre las relaciones tritróficas de los pulgones, no solo con las plantas colonizadas, sino con los enemigos naturales entomófagos de A. gossypii, el depredador generalista Chrysoperla carnea (Stephens) (Coleoptera: Chrysopidae) y el parasitoide de pulgones Aphidius colemani (Dalman) (Hymenoptera: Braconidae), cuando estos depredan o parasitan a pulgones que se alimentan a expensas de ellas. La cantidad de hembras ápteras de A. gossypii consumidas por C. carnea, así como el tiempo de consumo, no se vieron afectadas significativamente tras su exposición directa a una suspensión de conidios de la cepa EABb 01/33-Su, en comparación con lo observado con los pulgones testigo. Sin embargo, las crisopas no consumieron por completo los pulgones con indicios de infección fúngica, como posible mecanismo de seguridad por parte del neuróptero. Además, se ha demostrado que no existe un efecto sobre la eficacia depredadora de C. carnea cuando se alimenta de pulgones que se habían alimentado previamente de plantas de melón colonizadas endofíticamente con B. bassiana, aunque se detecta una tendencia a una reducción en el consumo de presas y un incremento en el tiempo de consumo en comparación con el control. Sin embargo, los resultados obtenidos en los ensayos de elección muestran una preferencia significativa de las crisopas por los pulgones de A. gossypii que se alimentan de plantas de melón colonizadas con la cepa EABb 01/33-Su, con respecto a las plantas testigo, lo que podría estar relacionado con los resultados del capítulo II, ya que algunos de los compuestos detectados en las plantas que se encontraban colonizadas endofíticamente podrían afectar al comportamiento de los insectos actuando como atrayentes. En cuanto al efecto sobre parasitoides, no se han observado diferencias significativas en el número de momias de A. colemani formadas, porcentaje de emergencia y ratio sexual de los adultos emergidos cuando las hembras ápteras de su insecto hospedante A. gossypii se encontraban alimentándose en hojas de melón colonizadas endofíticamente con la cepa EABb 01/33-Su en comparación con el testigo, lo que finalmente refuerza el empleo de hongos entomopatógenos en combinación con otros enemigos naturales como depredadores y parasitoides en programas de control integrado de pulgones. Esta tesis sienta las bases del empleo de hongos entomopatógenos endófitos para el control de pulgones, no solo por el efecto directo de los propágulos fúngicos sobre los áfidos, sino también por los efectos directos e indirectos sobre los mismos que acarrea la colonización endofítica de las plantas por las cepas fúngicas. Además, la tesis ilustra las ventajas de la estrategia, no solo por extender su eficacia a la capacidad de los pulgones para transmitir virus, sino por su compatibilidad en control integrado con entomófagos, parasitoides y depredadores. Agricultural sustainability requires progressively replacing synthetic chemical insecticides by more environmentally friendly pest control measures in order to guarantee food safety and food security. Microbial control is one of these alternatives, and among entomopathogenic microorganisms, entomopathogenic fungi (EF), due to their natural presence and mode of action by contact, show high potential for the control of several groups of insects of great agricultural relevance, such as sapsucking insects, especially aphids. During the 21st century, different associations of the EF with the plants in the rhizosphere, in the phylloplane, and as endophytes, have been discovered, new ecological roles that have expanded the possibilities of their use for pest management, and more broadly, in crop production. However, research on the direct and indirect effects of the endophytic colonization of the crop by EF is needed, with emphasis in the effect of such colonization on the plant semiochemical composition and tritrophic relationships between the insect pest and the crop and between the insect pest and its natural enemies. In this thesis, the effect of the endophytic colonization of melon plants by two strains of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuil and one of Metarhizium brunneum Petch, has been studied on both the fitness of the "cotton aphid" Aphis gossypii Glover, (Homoptera: Aphididae), a key pest of horticultural crops, as well as on its feeding behavior and ability to transmit persistent and non-persistent viruses. In addition, the present research focuses on the impact of this colonization on the chemical signals produced by the plant and on the relationships between the aphid and its natural entomophagous enemies for the development of IPM strategies. Hence, in chapter II, it is shown that B. bassiana EABb 01/33-Su strain significantly reduces the population of A. gossypii both when the specimens were fed on sprayed and endophytically colonized leaves (SCL), and when they fed only on nonsprayed colonized leaves (NSCL), distant from the sprayed ones. Meanwhile, strains EABb 04/01-Tip of B. bassiana and EAMa 01/58-Su of M. brunneum only reduced the aphid population when fed on SCL leaves, whereas feeding on NSCL also causes a significant reduction of the aphid population at a significance level of 0.1 (10%). Strain EABb 01/33-Su was shown to have the better endophytic behavior and therefore it was selected to be used throughout the experiments carried out in chapters III and IV. In Chapter II, it is also revealed a lack of effect of the endophytic colonization of melon plants with the three selected strains on total per capita fecundity of the aphids 5 days after the exposure, whereas aphids that feed on colonized plants advanced their average onset of nymph laying. Finally, in chapter II, qualitative and quantitative differences in the blend of volatile compounds released by endophytically colonized plants and subsequently infested by A. gossypii in comparison with the compounds emitted by control plants have been detected. Noteworthy, endophytic colonization of melon plants by the selected fungal strains did not modify aphid choice. In chapter III, the influence of melon endophytic colonization on the aphid feeding behavior and the transmission of persistent and non-persistent viruses has been studied. By using the electrical penetration graph (EPGs) technique, applied for the first time to aphids that feed on plants colonized with entomopathogenic fungi, it has been possible to detect the activity of the insect's stylet and relate it to the transmission processes of viruses in melon plants colonized with the B. bassiana strain EABb 01/33-Su. Melon endophytic colonization did not affect the feeding behavior of A. gossypii associated with the inoculation of the non-persistent Cucumovirus, Cucumber mosaic virus (CMV), and the persistent Polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus, but modified the acquisition process of nonpersistent viruses, which could be related to modifications of the feeding behavior of the aphid due to presence of fungal propagules or fungal metabolites in the mesophyll. In addition, the transmission bioassays carried out revealed that the incidence of the two target viruses was significantly reduced when the plants were endophytically colonized by the B. bassiana strain EABb 01/33-Su. Finally, in chapter IV, the effect of melon endophytic colonization by EABb 01/33-Su strain on the tritrophic interaction of A. gossypii with the crop and with their natural enemies, the generalist predator Chrysoperla carnea (Stephens) (Coleoptera: Chrysopidae) and the aphid parasitoid Aphidius colemani (Dalman) (Hymenoptera: Braconidae), was investigated. The number of apterous females of A. gossypii consumed by C. carnea, as well as the time of consumption, were not significantly affected by direct exposure to a conidial EABb 01/33-Su suspension as compared with the controls. Noteworthy, the lacewings did not completely consume the aphids with signs of fungal infection, as a possible safety mechanism developed by the predator. In addition, it has been shown the lack of a significant effect of endophytic colonization of the aphid hos plant, melon, on the predatory efficacy of C. carnea, whereas a trend towards a prey consumption decrease and consumption time increase was detected in comparison with the controls. Interestingly, the choice experiments revealed a significant preference of lacewings for aphids that fed on EABb 01/33-Su colonized melon plants, which could be related to the overproduction of certain semiochemicals elicited by endophytic colonization with known predator attractant potential. In addition, no significant differences were observed in the number of mummies of A. colemani formed, percentage of emergence and sexual ratio of the emerged adults when the insect host A. gossypii fed on EABb 01/33-Su endophytically melon leaves, which strengthen the potential of the simultaneous use of EF and predators and parasitoids in A. gossypii IPM. On the overall, the results of this thesis support the development of mycoinsecticides for aphid control due to the direct effect of fungal spray on the aphid population, but also due to direct and indirect effects related to the endophytic colonization of the plant by the fungal biocontrol agent, with emphasis in the reduction of the aphid virus-transmission potential. In addition, the results of the thesis highlight the compatibility of endophytic EF with parasitoids and predators.

El control preventivo de la langosta marroquí o mediterránea Dociostaurus maroccanus (Thunberg) (Orthoptera: Acrididae) ha evolucionado en los últimos 70 años desde el uso de insecticidas químicos de amplio espectro, hacia medidas más adaptadas a los criterios de la agricultura sostenible. Entre estas medidas, destaca el control microbiano por medio de ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AMEs). Los AMEs presentan ventajas tanto por su modo de acción por contacto, como por su presencia natural en las poblaciones de acrídidos. La cepa EABb 90/2-Dm de Beauveria bassiana, obtenida a partir de poblaciones de D. maroccanus de La Serena (Badajoz) y la cepa IMI 330189 de Metarhizium acridum, han mostrado eficacia para el control de la langosta mediterránea o marroquí en condiciones de laboratorio y campo. Sin embargo, el estudio de la adaptación ambiental de estas dos cepas para expresar su máxima virulencia en las condiciones de temperatura prevalentes en las áreas de reserva, así como su relación con la condición ectotérmica de estos acrídidos -expresada en su capacidad para termorregular, e incluso la existencia de fiebre comportamental- se ha convertido en el principal objetivo de esta Tesis Doctoral. En el Capítulo II, experimentos in vitro para evaluar la germinación de los conidios y el crecimiento fúngico, en condiciones de temperaturas constantes y fluctuantes (simulando condiciones de termorregulación), indicaron que la cepa IMI 330189 tuvo mejor adaptación a temperaturas por encima de 27 °C y la cepa EABb 90/2-Dm estuvo mejor adaptada a temperaturas en el rango 10–25 °C. Estos efectos fueron análogos a los obtenidos in vivo, donde la termorregulación de los insectos causó una importante pérdida de virulencia de la cepa EABb 90/2-Dm, frente a la obtenida en condiciones de no termorregulación [dosis: 1 × 104 conidios por insecto; el tiempo medio de supervivencia (TMS) aumentó 2.6 veces; la mortalidad se redujo 23.6%], pero solo una moderada reducción de la virulencia de la cepa IMI 330189 [dosis: 1 × 104 conidios por insecto; el tiempo medio de supervivencia (TMS) aumentó 1.8 veces; no hubo reducción de la mortalidad]. Los experimentos en gradiente de temperatura revelaron la inducción de fiebre comportamental en D. maroccanus causada por la cepa IMI 330189 de M. acridum, con una preferencia por temperaturas aproximadamente 4 °C superior en los insectos tratados en comparación a los insectos del testigo, aunque solo causó una ligera reducción de la virulencia. La cepa EABb 90/2-Dm de B. bassiana no indujo dicha repuesta comportamental de manera significativa. Debido a la termorregulación comportamental de D. maroccanus, se ha propuesto la co-formulación de cepas para optar por un solape de actividad en un rango mayor de condiciones de temperatura. La compatibilidad de las dos cepas seleccionadas en esta Tesis Doctoral (EABb 90/2-Dm e IMI 330189) en tratamientos conjuntos y su repercusión sobre el proceso infectivo en condiciones de termorregulación se han abordado en los Capítulos III y IV de la misma. En el Capítulo III, los resultados de las infecciones mixtas con la cepa IMI 330189 de M. acridum y dos cepas autóctonas de B. bassiana -aisladas de ortópteros del área de reserva de La Serena (Badajoz)- en el hospedante modelo Schistocerca gregaria, ponen de manifiesto que la eficacia insecticida de un patógeno virulento puede verse modificada por la interacción con otros patógenos, incluso aunque estos sean avirulentos, dependiendo de las condiciones ambientales, especialmente temperatura ambiental y termorregulación, y del orden de infección. Estas interacciones podrían contribuir a una variabilidad inesperada en la eficacia de un agente de control, dependiendo de la naturaleza de la comunidad microbiana autóctona de la zona. En el Capítulo IV, se ha evaluado el efecto de la infecciones individuales y mixtas con las cepas EABb 90/2-Dm de B. bassiana y IMI 330189 de M. acridum sobre la supervivencia, alimentación y fecundidad de D. maroccanus en condiciones de termorregulación. Las langostas fueron tratadas con dosis reducidas de ambas cepas individualmente y en mezcla (dosis totales para las cepas individuales y su mezcla: 1×102 y 1×103 conidios por insecto). Aunque las condiciones de temperatura (termorregulación, no termorregulación) tuvieron un efecto significativo en los resultados del experimento, la interacción entre ambas cepas fue aditiva para los efectos letales. Además, se detectaron efectos subletales como un 32–51% de reducción de la alimentación per capita, un 21-53% de reducción en el número de ootecas por hembra y una reducción del 30-65% en el número de huevos fértiles por hembra. La fecundidad (número de ootecas por hembra) y la alimentación per capita estuvieron positivamente correlacionadas (r = 0.783) Los resultados de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto que, aunque la cepa IMI 330189 de M. acridum se adapta mejor a las altas temperaturas durante la termorregulación comportamental, su co-formulación con la cepa EABb 90/2-Dm de B. bassiana podría permitir un solape de actividad de acuerdo a las condiciones de temperatura existentes. Los efectos subletales (alimentación y reproducción) deben ser considerados y añadidos a la mortalidad de los insectos para la evaluación del efecto global de los tratamientos fúngicos. En las áreas de reserva de la Península Ibérica, donde la temperatura muestra gran variación durante el día en los meses de primavera y verano, con el uso de esta co-formulación, la cepa de M. acridum proporcionaría un mejor control a las horas del día con temperaturas más altas (por encima de 27 °C) y B. bassiana sería más efectivo en las horas más templadas (10-25 °C). No obstante, estudios adicionales, incluyendo aplicaciones en campo, son necesarios para evaluar el impacto ecológico de esta combinación de cepas en las áreas de reserva de D. maroccanus. The preventive control of the Moroccan or Mediterranean locust Dociostaurus maroccanus (Thunberg) (Orthoptera: Acrididae) has evolved in the last 70 years from the use of broad-spectrum insecticides to other measures better adapted to sustainable agriculture. Among those measures, the use of microbial control with entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMAs) can be highlighted. EMAs have the advantage of their contact mode of action and natural occurrence in acridids populations. Strain Beauveria bassiana EABb 90/2-Dm, isolated from Mediterranean locust populations in La Serena (Badajoz), and strain Metarhizium acridum IMI 330189 have proven acceptable efficacy against the Moroccan or Mediterranean locust in laboratory bioassays and field applications. However, the assessment of the environmental fitness of these two strains to express their maximum virulence in the temperature conditions of the breeding areas and their interaction with the ectothermic condition of these acridids -expressed through thermoregulation and behavioral fever- has been the main objective of this Doctoral Thesis. In Chapter II, in vitro experiments measuring conidial germination and hyphal growth either at constant or at fluctuating temperatures simulating thermoregulatory conditions, indicated that strain IMI 330189 had greater fitness at temperatures above 27 °C and the strain EABb 90/2-Dm was better adapted to the temperature range of 10–25 °C. These effects were mirrored in vivo, where locust thermoregulation caused a marked reduction in the virulence of EABb 90/2-Dm in comparison to no thermoregulation conditions [dose: 1 × 104 spores per insect; average survival time (AST) increased 2.6 times; mortality decreased 23.6%], but only a moderate reduction in the virulence of IMI 330189 [dose: 1 × 104 spores per insect; AST increased 1.8 times; no reduction in mortality). Thermal gradient experiments revealed that the strain IMI 330189 induced behavioral fever in D. maroccanus, with preferred temperatures approximately 4 °C above the uninfected control, although it only led to a slight reduction in virulence. Strain EABb 90/2-Dm did not induce such a clear behavioral response. Due to the behavioral thermoregulation of D. maroccanus, the use of a co-formulation of strains to effectively overlap their activity in a broader range of temperature conditions has been proposed. The compatibility of the two selected strains in this Doctoral Thesis (EABb 90/2-Dm and IMI 330189) and their effect on the infection process in thermoregulatory conditions have been studied in Chapters III and IV. In Chapter III, the results of mixed infections with the strain M. acridum and two indigenous strains of B. bassiana -isolated from orthopterans in the breeding area of La Serena (Badajoz)- using Schistocerca gregaria as model host, showed that the insecticidal activity of a virulent pathogen can be altered by the interaction with other pathogens, even if they are avirulent, due to the environmental conditions (i.e. ambient temperature and thermoregulation) and the order of infection. These interactions could contribute to an unexpected variability of the efficacy of a control agent, depending on the nature of the resident microbial community. In Chapter IV, the effects of single and mixed infections with B. bassiana (EABb 90/2-Dm) and Metarhizium acridum (IMI 330189) strains on survival, feeding and reproduction of thermoregulating D. maroccanus were evaluated. The locusts were treated with low doses of both fungal pathogens alone and in mixture (total doses for single treatments and combinations =1×102 and 1×103 spores per insect). Although the temperature conditions (thermoregulation, no thermoregulation) had a significant effect on the results of the experiment, the interaction between both strains was additive for the lethal effects. Also, sublethal effects were detected, with a 32-51% in the reduction of per capita feeding, 21-53% reduction in the number of egg-pods per female, and 30-65% reduction in the number of fertile eggs per female. Locust fecundity (egg-pods per female) and per capita feeding were positively correlated (r = 0.783). The results of this Doctoral Thesis indicated that although the strain M. acridum IMI 330189 was better adapted to the high temperatures of locust behavioral thermoregulation, its co-formulation with the strain B. bassiana EABb 90/2-Dm would allow for an overlap in their performance according to the temperature conditions. The sublethal effects (feeding and reproduction) should also be considered and added to the insect mortality when evaluating the global effect of the fungal treatments. In the breeding areas of the Iberian Peninsula, where temperature shows large within-day variation during spring-summer, with the use of this co-formulation, the M. acridum strain would provide a better control at the time of the day with higher temperatures (above 27 °C) and B. bassiana strain would be more effective in the more temperate conditions (10-25 °C). Nonetheless, further studies involving field applications are required to evaluate the ecological impact of this strain combination in the breeding areas of D. maroccanus.

Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) son un componente importante de la microbiota de los ecosistemas naturales, agrícolas y forestales, donde regulan las poblaciones de insectos y ácaros fitófagos, pero además, pueden ser utilizados de forma deliberada para el control de plagas de acuerdo con distintas estrategias, incluso de forma inundativa, como micoinsecticidas. Más allá, trabajos llevados a cabo principalmente en la última década resaltan que la función ecológica de los AME sobrepasa su condición de entomopatógenos, pues sus sorprendentes relaciones con las plantas, como endófitos, en el filoplano o en la rizosfera, abren nuevos horizontes en la protección y producción vegetal. Los resultados de esta tesis doctoral ponen de manifiesto los beneficios asociados al carácter endófito y competente en la rizosfera de cepas de AME, principalmente de los géneros Beauveria y Metarhizium, sobre distintas plantas cultivadas, no sólo por su impacto en el control de plagas, sino también sobre su crecimiento y nutrición férrica en suelos calcáreos. The entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMA) are an important component of the microbiota of natural, agricultural and forest ecosystems, where they regulate insect populations and phytophagous mites, but can also be used deliberately for the control of pests in accordance with different strategies, including inundative release as mycoinsecticides. Furthermore, works carried out mainly in the last decade highlight that the ecological role of EMAs exceeds their status as entomopathogens, because of their surprising associations with plants, as endophytes, in the phylloplane or in the rhizosphere, open new horizons in Plant protection and Production. The results of this Doctoral Thesis show the benefits associated with the endophytic and rhizosphere competent behavior of strains of EMA, mainly of the genera Beauveria and Metarhizium, on different cultivated plants, not only for their impact on the control of pests, but also about its growth and ferric nutrition in calcareous soils.

El control biológico por medio de hongos entomopatógenos emerge en la actualidad como la gran alternativa a los insecticidas químicos y ha despertado el interés de todos los agentes implicados en la protección de cultivos (Foley et al., 2011; Popp et al., 2013). Sin embargo, su éxito comercial e implantación progresiva se enfrentan con demasiada frecuencia a una barrera limitante, la falta de eficacia en campo, debido en gran parte a la poca competencia ambiental de las cepas seleccionadas, cuya actividad queda neutralizada por distintos factores bióticos y abióticos, donde destaca, dentro del espectro solar, la radiación UV-B (Meyling y Eilemberg, 2007; Vega et, al., 2009; Lacey, 2017, Quesada-Moraga et al., 2013). Esta Tesis ha pretendido dilucidar el efecto real de dicha radiación sobre la virulencia de los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AMEs), así como la presencia natural de estos hongos en el filoplano, donde las condiciones ambientales operantes no parecen favorables para su presencia, y su relación con la respuesta a las condiciones de temperatura, humedad y radiación UV-B.

La agricultura ha provisto de alimentos al ser humano desde su origen, pero en el último siglo, la producción agraria se ha intensificado gracias, entre otros, al empleo de insecticidas. Sin embargo, esta intensificación no ha estado exenta de problemas de contaminación por residuos en los alimentos o de efectos negativos sobre la biodiversidad y el medioambiente. La legislación agraria actual promueve una agricultura acorde con la creciente preocupación de los consumidores por la salud y por el medioambiente. En este escenario, el desarrollo de estrategias ambientalmente sostenibles y seguras para los consumidores se sitúa en primera línea en los programas de investigación para el control de plagas. Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AMEs) y en particular el género Metarhizium, cumplen los requisitos de seguridad para el ser humano y el medio ambiente y además han mostrado un gran éxito en el control de plagas de insectos debido a su modo de acción por contacto, su presencia natural en diversos ecosistemas y su capacidad de secretar compuestos con actividad insecticida. No obstante, la implantación en el mercado de los micoinsecticidas es lenta, y tropieza con una barrera fundamental que es la escasa información sobre el destino de algunos metabolitos secundarios en la cadena alimentaria y su riesgo para la salud humana y animal, información clave para abordar su registro. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar y validar métodos analíticos con alta sensibilidad para su determinación a bajas concentraciones en diferentes matrices biológicas. La destruxina A es uno de los principales metabolitos secundarios producidos por el AME Metarhizium spp., pero la falta de estudios sobre su producción por parte del hongo es probablemente el mayor obstáculo para el registro de nuevas cepas de esta especie fúngica. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar nuevas herramientas para la detección y cuantificación de destruxinas, así como investigar el destino de la destruxina A en la cadena trófica. En el capítulo II de esta Tesis, se ha determinado la producción de destruxinas por parte de cuatro cepas de Metarhizium (BIPESCO5, EAMa 01/58-Su, ARSEF 23 y ART 2825) con un método mejorado de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento en tándem con espectrometría de masas (UHPLC-MS / MS) en cuatro medios de cultivo (CM, MM, CN2, OSM) que representan diferentes condiciones de estrés. Cada 3 días durante 18 días se tomaron muestras para análisis que permitieron detectar 15 destruxinas, siendo las destruxinas A y B las más abundantes. Además, se detectaron diferencias significativas entre las cepas en la producción de destruxinas, que a su vez fue altamente dependiente del medio de cultivo. En el capítulo III la colonización endofítica y la producción de destruxina A en plantas de patata se monitorizaron a las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la inoculación con dos cepas de Metarhizium brunneum Petch. (BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su), lo que puso de manifiesto que la concentración de destruxina A en los tejidos vegetales es muy baja en comparación con los niveles de colonización. Aunque se observó una colonización similar para ambas cepas, hubo diferencias a lo largo de la planta, con valores más altos en las hojas a 96 h para EAMa 01/58-Su (83.3 %) y BIPESCO5 (81.6 %), y más bajos en tubérculo y raíz a las 72, 96 y 120 h después de la inoculación para ambas cepas (10.0-13.3 %). Para la cepa EAMa 01/58-Su, la destruxina A se cuantificó a las 24 h en el tubérculo y la raíz (2.0 ± 1.4 y 2.49 ± 1.7 μg / kg, respectivamente) y a las 96 h con igual concentración también en tubérculo y raíz (2.5 ± 1.7 μg /kg); para BIPESCO5, solamente se cuantificó destruxina A en el tubérculo a las 24 h y en la raíz a las 48 h (6.8 ± 4.8 y 2.1 ± 1.4 μg / kg, respectivamente). En el capítulo IV se investiga por primera vez la dinámica de crecimiento de las cepas BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su de M. brunneum y la secreción de destruxina A durante el proceso de infección de larvas del insecto modelo Galleria mellonella L. (Lepidoptera; Pyralidae). Se observó que la secreción de destruxina A fue paralela a la evolución de la cantidad de ADN fúngico en el interior del insecto para la cepa EAMa 01/58-Su, no así para BIPESCO5. Las cepas EAMa 01/58-Su y BIPESCO5 secretaron destruxina A desde los días 2 al 6 y desde el día 2 hasta el día 5 después del tratamiento, respectivamente. Para EAMa 01/58-Su y BIPESCO5, la máxima cantidad de destruxina A producida en el insecto hospedante fue de 0.369 y 0.06 μg/larva a los 4 días del tratamiento, respectivamente, y a lo largo del proceso patogénico, la producción fue de 0.6 y 0.09 μg / larva, respectivamente. En el capítulo V se realizaron bioensayos presa-depredador para evaluar el comportamiento y la supervivencia de las larvas del depredador generalista Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera; Chrysopidae) al alimentarse con larvas insecto polífago Spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera; Noctuidae) inoculadas con las cepas BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su. Además, se llevaron a cabo estudios ecotoxicológicos para supervisar el destino de la destruxina A en el sistema presa-depredador. La concentración máxima de destruxina A producida por la cepa BIPESCO5 fue el día 4 con un valor de 0.000054 μg/insecto (aproximadamente 0.014 μg/g) y para la cepa EAMa 01/58-Su el día 5 con 0.00012 μg/insecto (aproximadamente 0.031 μg/g), mientras que el metabolito no se detectó en larvas de C. carnea. El porcentaje de crisopas que se alimentó de larvas de S. littoralis 24 horas después de la infección fue de 96.6, 75.0 y 65.0 % para el control, EAMa 01/58-Su y BIPESCO5, respectivamente, mientras que 5 días después de la infección fue 38.3 % para control y 33.3 % en los tratamientos con las cepas EAMa 01/58-Su y BIPESCO5. La cantidad de larvas de S. littoralis consumidas por C. carnea 24 h después de la infección fue 5.6, 2.2 y 2.3 para las tratadas con el control, EAMa 01/58-Su y BIPESCO5 respectivamente, mientras que 5 días después de la infección consumió una sola larva per cápita. Esto puso de manifiesto que los tratamientos de M. brunneum contra las larvas de S. littoralis fueron seguros para C. carnea debido tanto a la ausencia de mortalidad relacionada con los hongos en el depredador como a la falta de movimiento de la destruxina A de la presa al depredador. Es importante resaltar que en los capítulos IV y V, para ambas cepas, la mortalidad de las larvas debido a otras causas fue mucho mayor que la mortalidad con crecimiento fúngico. Sin embargo, la secreción de destruxina A fue mayor para EAMa 01/58-Su que para BIPESCO5, lo que sugiere que la destruxina A podría ser un factor de virulencia de la primera, mientras que la segunda podría requerir la participación de otros factores además de destruxina A durante el proceso de infección. Los resultados obtenidos proporcionan métodos analíticos valiosos para llevar a cabo evaluaciones de riesgo sobre el empleo de AME, así como resultados que indican que su empleo supone un bajo nivel de riesgo para la salud humana, animal y medio ambiental. Agriculture produces the vast majority of the world’s food supply, and in last century the global food production has grown at a huge rate mainly from the increased yields resulting from greater inputs of insecticides and other technologies. Meanwhile overuse or improper use of insecticides and other agrochemicals has raised issues about related environment and health costs, with current legislation promoting sustainable agriculture, in which scenario, the development of environmentally sustainable strategies is mandatory for research programs regarding pest control. The entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMAs) and in particular the genus Metarhizium have shown great success in the control of insect pests due to their contact mode of action, natural presence in the ecosystems and their ability to secrete compounds with insecticidal activity, and even, they comply with the security requirements for human health and environment, whereas information about the fate of their secondary metabolites in the food chain and their risk to human and animal health is still scarce. There is a need to develop and validate analytical methods with high sensitivity for metabolite determination at low concentrations in different biological matrices. Destruxin A is one of the major secondary metabolite produced by the genus Metarhizium spp., but the lack of studies concerning destruxin A production is most likely the biggest obstacle for registration of new fungal strains. The main goal of this research has been to develop new tools for destruxin detection and quantification and to investigate the fate of destruxin A in the trophic chain. In chapter II, destruxin production for Metarhizium strains BIPESCO5, EAMa 01/58- Su, ARSEF 23 and ART 2825 was determined with an improved method of ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), which has shown high precision in the detection and quantification of destruxins in four culture media (CM, MM, CN2, OSM) representing different stress conditions. Every 3 days samples were taken for analysis over 18 days that allowed detecting 15 destruxins, with destruxin A and B as the most abundant. However, significant differences among strains in destruxin production were detected, and for each strain, destruxin production was highly dependent on culture medium. In chapter III, endophytic colonisation and destruxin A production on potato plants were monitored at 24, 48, 72, 96 and 120 h after inoculation with Metarhizium brunneum strains (BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su), which showed that the concentration of destruxin A in plant tissues was very low compared to the colonisation levels. Although a similar colonisation was observed for both strains, there were differences in percentages in different parts of the plants, with the higher values occurring in the leaves at 96 h for EAMa 01/58-Su (83.3 %) and BIPESCO5 (81.6 %), and the lower ones, 10.0-13.3 %, observed in tuber and root at 72, 96 and 120 h post-inoculation for both strains. For strain EAMa 01/58- Su, destruxin A was quantified at 24 h (2.49 ± 1.7 and 2.0 ± 1.4 μg/kg, respectively), and the same concentration was found in both tuber and root at 96 h (2.5 ± 1.7 μg/kg); for BIPESCO5, the concentrations differed in tuber at 24 h and in root at 48 h (6.8 ± 4.8 and 2.1 ± 1.4 μg/kg, respectively). In chapter IV, the dynamic of fungal growth and secretion of destruxin A by strains BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su of Metarhizium brunneum Petch. during the infection process of larvae of the model insect Galleria mellonella L. (Lepidoptera; Pyralidae) was monitored for the first time. Data showed that destruxin A secretion was parallel to the fungal growth of EAMa 01/58-Su but not coupled with that for BIPESCO5. EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 strains secreted destruxin A from days 2 to 6 and from day 2 to day 5 post treatment, respectively. For EAMa 01/58-Su and BIPESCO5, the maximum titer in the host on day 4 after treatment was 0.369 and 0.06 μg/larva, respectively, and throughout the pathogenic process, the production was 0.6 and 0.09 μg/larva, respectively. In chapter V, predator-prey bioassays were performed to evaluate the behavior and survival of larvae of the generalist predator Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera; Chrysopidae) when feeding on larvae of the polyphagous pest Spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera; Noctuidae) challenged by M. brunneum BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su strains. In addition, ecotoxicological studies based on HPLC-MS were performed to monitor the fate of destruxin A in the prey-predator system. The maximum concentration of destruxin A produced by the BIPESCO5 strain was on day 4 after treatment with a value of 0.000054 μg/insect (approx 0.014 μg/g), and for EAMa 01/58-Su was on day 5 with a value of 0.00012 μg/insect (approx 0.031 μg/g), whereas the metabolite was no detected in C. carnea larvae. The percentage of lacewings feeding on S. littoralis larvae 24 hour-post infection was 96.6, 75.0, and 65.0 % for the control, EAMa 01/58-Su, and BIPESCO5 treatments, respectively, whereas 5 days-post infection armyworm larvae were consumed by only 38.3 % of the control lacewings and 33.3 % of the EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 treatment groups. C. carnea larvae feeding on 24 h-post infection armyworm larvae preyed 5.6, 2.2 and 2.3 larvae for the control, EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 treatments, respectively, whereas those predator larvae feeding on 5 days-post infection armyworm larvae preyed on only one per capita larva. It showed that the M. brunneum treatments against S. littoralis larvae were safe for C. carnea due to both the lack of fungus-related mortality in the predator and the lack of movement of destruxin A from the prey to the predator. Notably in chapters IV and V, in both M. brunneum strains, mortality from other causes was higher than mortality with fungal outgrowth. However, destruxin A secretion was higher for EAMa 01/58-Su than for BIPESCO5. These results suggested that destruxin A could be a virulence factor for EAMa 01/58-Su strain, whereas for BIPESCO5, the virulence could require the involvement of other factors as well as destruxin A during the infection process. The results obtained provide valuable analytical methods for carrying out risk assessments on the use of EMAs. In addition, results indicate that their use poses a little potential hazard to human and animal health and the environment.

Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos, que actúan por vía tegumentaria, han sido utilizados para el control microbiano de plagas mediante distintas estrategias que permiten el contacto de sus conidios con los insectos diana. Sin embargo, se conocen nuevos aspectos sobre su función ecológica tales como su capacidad secretora de compuestos con actividad insecticida, así como su sorprendente comportamiento como endófitos, que complementan su empleo clásico y que pueden pantagermitir el desarrollo de nuevas estrategias de control de plagas. El empleo conjunto de estos hongos y sus extractos para el control de un insecto polífago de importancia mundial Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) es abordado en el capítulo II, donde se pone de manifiesto la existencia de variación intra- e interespecífica en la virulencia y estrategias patogénicas de las cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium brunneum evaluadas frente a larvas del noctuido. La aplicación conjunta de cepas con distintas estrategias patogénicas junto con sus extractos a larvas del lepidóptero tuvo efecto aditivo, y alguno antagónico, de lo que depende su empleo conjunto. Los capítulos III y IV revelan la existencia de colonización endofítica transitoria tras la aplicación foliar de suspensiones de conidios de cepas de las especies mencionadas en alfalfa, tomate y melón, así como el impacto de esta colonización sobre dos fitófagos con diferentes hábitos de alimentación, uno masticador S. littoralis y otro picador-suctor Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). El capítulo III muestra la contribución aditiva de la mortalidad causada por la alimentación de larvas de S. littoralis a expensas de material vegetal colonizado endofíticamente por cepas de B. bassiana y M. anisopliae con la debida al tratamiento tópico de las mismas con las suspensiones fúngicas. El origen de la mortalidad iniciada a través de la vía digestiva en larvas de este lepidóptero permanece incierto para las cepas de B. bassiana, pero podría estar asociado a la presencia en la planta de metabolitos fúngicos en las cepas de M. brunneum como denota la presencia de destruxina (dtx) A en el 11,0% de los cadáveres. El capítulo IV revela que cepas de ambas especies fúngicas pueden iniciar ciclos de infección en insectos picadores-suctores cuando se alimentan a expensas de sustrato vegetal colonizado endofíticamente, si bien, ambas especies presentan estrategias diferentes. Así, B. bassiana muestra una gran capacidad para colonizar el melón, incluso con efecto traslaminar, que causa la infección de ninfas de B. tabaci por contacto con el tegumento. Sin embargo, la mortalidad de las mismas causada por M. brunneum, de crecimiento mucho más localizado en la hoja, está relacionada una vez mas con la presencia de dtx A en el 43,0% de los cadáveres. Estos resultados deben ser considerados para la evaluación del impacto real de los tratamientos con hongos entomopatógenos, y abren nuevas vías en el control de plagas., Entomopathogenic mitosporic ascomicetes have long been used for pest control by different strategies all ensuring a good probability that the target insect cuticle will come in contact with an adequate number of conidia. However, recent findings on the new ecological roles of these fungi such as insecticide compound secretion capability and their endophytic behavior could improve this classical inundative release and lead to the development of new pest control strategies. The combined use of several strains of these fungi and their extracts for the control of Spodoptera littoralis (Boisduval) (Noctuidae: Lepidoptera), a worldwide destructive pest, has been explored in chapter II. Intra- and interspecific variation in virulence and pathogenic strategies among Beauveria bassiana and Metarhizium brunneum strains against Egyptian armyworm larvae has been detected. The combined use of B. bassiana and M. brunneum strains with different pathogenic strategies and their crude extracts towards S. littoralis larvae yielded mostly additive effects, but antagonism was also encountered, therefore determining their possible combined deployment for pest control. Chapters III and IV reveal that spray application with conidial suspensions targeting chewing and sucking insect pests can be accompanied by a transient endophytic colonizations of plant (alfalfa, tomato, melon), which lead to different mortality rates on S. littoralis and the sweetpotato whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Indeed, chapter III shows that spray application of conidial suspensions of B. bassiana and M. brunneum targeting S. littoralis larvae in alfalfa, tomato and melon and their transient colonization produce additive effects therefore improving the control of this pest. The possible origin of such mortality in insects fed B. bassiana-colonized plants remains unknown, whereas this is the first study to report destruxin A traces in insects in 11.0% of the cadavers fed M. brunneum-colonized plants. Finally, chapter IV highlights that transient endophytic colonization of melon leaves by B. bassiana and M. anisopliae lead to different mortality rates of B. tabaci nymphs, whereas the origin of such mortality was different for the two fungal species. Mortality with fungal outgrowth was detected only in the B. bassiana treatments, with histological examination revealing translaminar behavior of this fungus coming in contact with nymphs in the abaxial surface when applied in the adaxial one. In contrast, no fungal outgrowth was detected in cadavers from the M. brunneum treatments, with the leaf colonizing fungus unable to come in contact with the nymphs, but with destruxin A present in 43.0% of them. The results of the present work may help in developing new pest control strategies and have to be considered to estimate the real acute impact of field sprays with entomopathogenic fungi on both chewing and sucking insects.

La mosca del olivo Bactrocera oleae es el fitófago más destructivo para el olivar por atacar al fruto, parte cosechable del cultivo, lo que origina graves pérdidas de cantidad de la producción, pero más grave, también en su calidad, donde este díptero constituye la principal amenaza biótica. Hoy en día el control de esta mosca es un verdadero desafío, tanto por la escasez de materias activas insecticidas disponibles, como por las primeras citas de aparición de resistencia a las mismas. Además, los efectos negativos de los insecticidas químicos sobre el medioambiente y los seres vivos, que han impulsado la normativa reguladora de la Unión Europea que emana a todos los estados miembros, promulgan los métodos no químicos de control de plagas, con énfasis en los bioinsecticidas. Dentro de éllos, los hongos entomopatógenos presentan gran potencial para ser usados dentro de los programas de control integrado de la mosca del olivo. Su presencia natural en los ecosistemas de olivar, su modo de acción por contacto, y su capacidad de secretar nuevas moléculas con actividad insecticida son factores que les sitúan en primera línea mundial para el desarrollo de estrategias alternativas de control para la mosca del olivo.

Esta tesis reúne el desarrollo de trestrabajos de investigación enfocadosa la búsqueda de alternativasecológicamente viables y eficaces parael manejo de las principaleslimitantes fitosanitarias del cultivodel olivo. Mediante un sistema detrabajo multidisciplinar entre losGrupos PAIDI AGR 163“Entomología Agrícola” deldepartamento de Ciencias yRecursos Agrícolas y Forestales yPAIDI AGR 216 “PatologíaAgroforestal” del departamento deAgronomía, de la Universidad deCórdoba- España, se buscódilucidar si los hongosentomopatógenos aplicados en elsuelo para el control de estadospreimaginales de tefrítidos, podríantener impacto en otras comunidadesde microorganismos presentes en el suelo, en particular los hongosfitopatógenos, que de serantagonistas, supondría un manejonovedoso dentro del escenario delControl Integrado de Plagas yEnfermedades en el olivar..., Entomopathogenic fungi and their molecules for the control of Tephritids(Diptera: Tephritidae) and their effect on soil-borne pathogens of olive.This Doctoral Thesis gathers three researches focus on finding effectiveand feasible alternatives for the control of the phytosanitary problems of oliveorchard, through a multidisciplinary approach between the PAIDI AGR 163Group "Agricultural Entomology" of department of Sciences, Agricultural, andForestry Resources and the PAIDI AGR 216 group "Pathology Agroforestry" ofDepartment of Agronomy, University of Córdoba Spain. The current DoctoralThesis explores if the entomopathogenic fungi (EF) applied in the soil for thecontrol of preimaginal tephritids stages could impact on other soil-bornemicroorganism communities, such as fungal plant pathogens. The EF can beantagonist of olive pathogens. Besides, the work examines the possible dualbiocontrol of both olive pests and diseases with EF, which would be a newstrategy for the integrated management control of pest and disease in the oliveorchard.The olive Olea europaea L. (Oleaceae) is an important crop in manycountries and has acquired a large socio-economic importance within theMediterranean region. The olive fruit fly Bactrocera oleae (Gmelin) and the olivepathogens Verticillium dahliae, Phytophthora megasperma and Phytophthorainundata are major worldwide limiting factors for olive tree production, theyare causing the Verticillium wilt and root rot diseases, respectively. AlthoughEF Metarhizium spp. and Beauveria spp. are well-known for insect pest controlfor many years, and in particular, for olive fly control by either targeting adultsor pupariating larvae and puparia in the soil beneath the tree canopy,additional roles in nature have also been recently discovered, such asendophytic and rhizospheric interactions with plants, antagonism to plant...

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2012-2013.Producción, Protección y Mejora Vegetal. ultravioleta (UV-B) tienen una gran influencia sobre la presencia, distribución y persistencia de los hongos entomopatógenos (HE) en sus hábitats naturales (suelo o filoplano de las plantas). Sin embargo, la protección contra estos factores es mayor en el primer hábitat que en el segundo, por lo que uno de los objetivos del presente trabajo ha sido determinar si el filoplano podría proporcionar aislados fúngicos mejor adaptados a las condiciones extremas de temperatura, humedad y exposición a rayos UV-B que los del suelo. Para ello, 20 aislados del HE Beauveria bassiana obtenidos de suelo y filoplano de dos ecosistemas del sur de España (dehesa y reforestación de encinas) fueron seleccionados para: (1) Ser caracterizados molecularmente con el factor de elongación EF1-α y la región intergénica nuclear Bloc, (2) Estudiar su diversidad utilizando 4 microsatélites (ISSR), (3) Evaluar sus requerimientos térmicos, hídricos y de UV-B. El análisis genético reveló diferencias entre los aislados, y mostró relación entre los microsatelites y EF1-α/Bloc. De los 20 aislados estudiados, se obtuvieron dos haplotipos, uno que contenía los aislados de la secuencia tipo del grupo ST1 y un segundo haplotipo que contenía el resto de aislados agrupados en tres secuencias tipo (ST2, 3 y 4). Las secuencias tipo ST2, 3 y 4 son aparentemente polifiléticas, lo que sugiere heterogeneidad temporal aparecida entre estos tres grupos. Este análisis sugiere que no hay una relación directa entre el origen de los aislados y su diversidad genética. Una vez caracterizados molecularmente, se procedió al estudio de la respuesta de los aislados frente a los principales factores climáticos (temperatura, humedad y radiación UV-B) para dilucidar una posible relación entre la ecología de estos aislados y su origen, secuencia tipo o haplotipo. El efecto de la temperatura sobre la germinación y crecimiento diametral se evaluó sometiendo a los distintos aislados a temperaturas de entre 15 a 35 ºC. Estos presentaron un óptimo de temperatura en el crecimiento micelial que osciló entre de 23.8 y 28.7ºC y un porcentaje de germinación, máximo para todos los aislados a 25ºC, entre 64.6 y 94.3% tras 18 horas de incubación. La actividad del agua (aw) se evaluó en la germinación de los conidios enfrentándolos a distintos valores de aw (1-0.862) obtenidos mediante la adición de glicerol al medio de cultivo. Todos los aislados presentaron valores máximos de germinación entre 1 y 0.996aw, a partir del cual la germinación comenzó a decrecer en la mayoría de ellos. Tan sólo 4 aislados germinaron a 0.928aw. Por debajo del mismo no germinó ningún aislado tras 24 horas de incubación. Finalmente, los conidios de los aislados se expusieron a dos irradiancias (920 y 1200mW m-2) durante 2, 4 y 6 horas. En este caso, se evaluó la germinación, las unidades formadoras de colonias (o culturability) y el crecimiento micelial. En el caso de la germinación, se observó que los conidios perdían capacidad germinativa cuanto mayor era la irradiancia y tiempo de exposición, un hecho que no fue tan evidente en la formación de colonias o el crecimiento micelial. Parece ser que los propágulos se “recuperan” tras la exposición, una recuperación que es menor cuanto mayor es el tiempo de exposición (6h) y la irradiancia (1200 mW m-1). Se podría decir que los hongos entomopatógenos procedentes del filoplano, aparentemente más expuestos a valores extremos de los factores ambientales evaluados, podrían haber evolucionado para resistir las condiciones más desfavorables. Los resultados de este trabajo muestran claramente que el hábitat no siempre origina genotipos con mejor competencia ambiental. Environmental abiotic factors such temperature, moisture and ultraviolet radiation (UV-B) highly influence presence, distribution and persistence of entomopathogenic fungi (EF) in their natural habitats (soil or plants phylloplane). However, protection against these factors is greater in the soil than in the plant phylloplane. For that, one of the objectives of the present work has been to determine whether the phylloplane could harbour fungal isolates better adapted to extreme conditions of temperature, humidity and UV-B exposure than those from the soil. For that, twenty isolates of the EF Beauveria bassiana obtained from soil and phylloplane of two ecosystems from the south of Spain (holm oak dehesa and reforestation) were selected to: (1) be molecularly characterized with elongation factor 1-α(EF1-α) and the intergenic nuclear region Bloc, (2) Study their diversity using with 4 microsatellites primers (ISSR); (3) Evaluate their thermal, humidity and UV-B requirements. From the 20 B. bassiana isolates, two haplotypes were obtained, one contained the type sequence of TS1 group and the second one contained the rest of isolates grouped in three type sequences (TS2, 3 and 4), which were apparently polyphyletic, and could represent temporal heterogeneity between these three groups. Besides, similar patterns of isolate grouping were observed by using microsatellites (ISSR) and TEF/Bloc. The analysis revealed that these TS were not linked to isolate habitat (soil or phylloplane) or origin, holm oak dehesa or reforestation. The temperature effect on germination and colony growth was evaluated in the range 15-35 ºC. The optimal temperature for mycelia growth ranged between 23.8 and 28.7 ºC, and the germination percentage (maximum at 25ºC for all isolates) ranged between 64.6 and 94.3 % after 18 hours of incubation. The water activity (aw) effect on conidia germination was evaluated against different values of aw (1 – 0.862), which were obtained adding glycerol to the medium. All isolates showed maximum germination values between 1 and 0996 aw. Only 4 isolates germinated at 0.928 aw. Germination at aw values lower than 0.928 was not observed for any isolate. Finally, conidia were exposed to different irradiances (920 and 1200 mWm-2) during 2, 4 and 6 hours, and germination, culturability and mycelia growth were evaluated. All isolates exhibit an initial delay on germination for higher irradiance and longer exposition time, whereas a recovery seemed to occur as revealed by the higher culturability rates and colony growth values. It could be concluded that a "recovery" of the fungal propagules could occur after exposition to UV-B, even if such recovery is lower for longer exposure times (6h) and irradiance (1200 mW m-1). It could be argued that isolates of entomopathogenic fungi from the phylloplane that are most exposed to abiotic environmental factors could have evolved to resist more unfavorable environmental conditions, the present work results clearly shows that such habitat not always provide the more environmentally competent genotypes.

The fauna and abundance of ground beetles (Coleoptera, Carabidae) in arable crops can be indicator of influence of different agricultural measures on biodiversity. The aim of our study was to determine ground beetle fauna abundance and frequency in two fields with different herbicide and insecticide application practice, and to determine differences in total number of species and individuals, collected with two capturing methods. The study was conducted in 2012 in the eastern part of Croatia (County of Vukovar-Srijem). Beetles were collected in a period of twenty one week (April- September) by setting four modified pitfall traps aimed to collect aboveground fauna and four probes (WB PROBE II® Trap, Trece inc.) aimed to collect endogeic fauna in each field. Nine different species and eight genera were identified in the study. The most abundant were Pseudoophonus rufipes (De Geer 1774) and Bembidion sp. (Latreille 1802). Both are classified as eudominant. The most frequent species was P. rufipes classified as constant (71.42%) and the most frequent genus was Bembidion sp. (38.04%) classified as accessory. There was no significant difference between fields among total number of established species and/or genus no matter if they were captured by pitfall trap or probe. Significantly more individuals were captured in pitfall traps on the field No 1 (33.3) than on the field No 2 (8.8), respectively. Opposite, significantly fewer individuals were captured with probe on the Field No 1 (0.5) than on the field No 2 (6.6), respectively.

Slugs are important pests of cultivated plants in Croatia. In many sites slug species Arion lusitanicus (Mabille, 1868) (Gastropoda: Arionidae) has become the most frequent species, which is very hard to control by chemical molluscicides. Since 1996 a biological molluscicide based on nematode Phasmarhabditis hermaphrodita (Schneider, 1859) (Nematoda: Rhabditidae) has been formulated as an effective product for slug control. In order to establish feeding activity and survival of adult A. lusitanicus specimens exposed to parasitic nematode P. hermaphrodita and to compare its efficiency to efficiency of chemical molluscicides, a laboratory experiment was performed. Adult specimens of A. lusitanicus (feeded on lettuce leaves in flower pots) were exposed to P. hermaphrodita, metaldehyde and methiocarb treatments. Food consumption of slug specimens was measured daily. Survival of slugs was observed to their death, up to 30th day. In the first week of investigation, chemical molluscicide treatments were found to differ significantly from the biological product and control. At the treatments treated by nematodes, daily leaf area consumption was also reduced and was significantly different from the control treatment. Food consumption was reduced on both chemical and biological treatments but the most of adult speciments of A. lusitanicus survived and continued to feed. To the end of the second week of investigation, food consumption decreased on all treatments and was mainly uniform with no significant differences between treatments. During the experiment, the slugs were dying within the period of 3 to 30 days at the treatments treated by nematode P. hermaphrodita or in the period of 9 to 24 days at the treatments treated by metaldehyde and methiocarb. Because the tolerance level to slug damages in lettuce market is effectively zero, these results indicate a failure of biological product based on P. hermaphrodita in control of adult specimens of A. lusitanicus as well as a failure of chemical molluscicides. These data point at a great need for integrated control of slug damage which must include cultural and different alternative control measures, not only chemical control.

Hasta la fecha, los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) se han empleado con éxito en el control de adultos de tefrítidos en pulverización total del sustrato vegetal, o en pulverización cebo, o mediante la técnica de ¿atracción e infección¿. No obstante, recientemente se ha puesto de manifiesto el potencial de estos AME para el control de estados pre-imaginales de tefrítidos mediante su aplicación al suelo, en la base del árbol, donde el inóculo fúngico está protegido frente a los factores ambientales. Sin embargo, el éxito de esta estrategia de aplicación al suelo depende del conocimiento de aquellos factores, tanto genéticos como ambientales, que pueden influir sobre la dinámica del inóculo en el suelo y sobre la eficacia del mismo. El capítulo 4 del presente trabajo revela la ausencia de relación entre la distribución molecular de aislados españoles de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. en base a su modelo de inserción de intrones y el factor de elongación EF1-¿, y su origen geográfico y climático. Estos aislados presentan elevada diversidad genética entre sí, aunque la mayoría de ellos se sitúan dentro de un subgrupo filogenético más amplio con representantes de todo el mundo. En los capítulos 5 y 6 se detallan los efectos de los principales factores abióticos del suelo sobre la disponibilidad, movimiento y virulencia de B. bassiana y Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. frente al tefrítido modelo Ceratitis capitata Wied. Los experimentos de ¿adsorción y arrastre de conidios¿ y de ¿columnas de suelo¿ realizados en el capítulo 5 con suelos de diferentes texturas y pH, y distintas soluciones de CaCl2, muestran como los conidios de B. bassiana tienden a ser retenidos por el complejo de cambio de las arcillas, condición que desaparece al aumentar la fuerza iónica de la solución del suelo. La disponibilidad de M. anisopliae resultó menor en suelos arenosos que arcillosos, sin mostrar interacción con la fuerza iónica de la solución del suelo. Además, el 90% de los conidios son retenidos por la capa superficial de las columnas independientemente del suelo que se trate. Mientras que la textura y el pH del suelo no tuvieron un efecto significativo sobre la virulencia de aislados de B. bassiana y M. anisopliae frente a estados pre-imaginales de C. capitata, el efecto de la temperatura y la humedad del suelo si afectó significativamente a su virulencia. Los aislados de B. bassiana y M. anisopliae mostraron diferente virulencia frente a estados pre-imaginales de C. capitata en el rango de 15 a 35ºC de temperatura y 1 y 17% (p:p) de humedad en la regresión logística múltiple desarrollada al respecto (capítulo 6). En general, los aislados de M. anisopliae se mostraron más virulentos frente a estos pre-imaginales que los de B. bassiana, aunque con diferencias entre ellos. Destaca el comportamiento del aislado EAMa 01/158-Su de M. anisopliae, que mostró una relación directa de la temperatura y la humedad del suelo con la mortalidad de estados pre-imaginales de C. capitata. Sin embargo, los aislados EAMa 01/58-Su de M. anisopliae y EABb 01/33-Su y Bb-1333 de B. bassiana, se mostraron menos virulentos en condiciones de humedad extrema (1 y 17%) (p:p) y temperaturas superiores a 20ºC. Aunque los tratamientos con AME están dirigidos a los estados pre-imaginales de tefrítidos antes de que se produzca la pupación, también es interesante esta estrategia cuando ocurre la salida de los adultos, ya que pueden impregnarse con los conidios disponibles en el suelo. Así el modelo paramétrico lognormal de supervivencia aplicado al desarrollo de pre-imaginales de C. capitata en el capítulo 7 indica que el máximo porcentaje de individuos que alcanzan el estado adulto (91.57%) se produce a 23.5ºC y 7.0%. Además, a estas mismas condiciones se producen los tiempos de desarrollo más cortos para el 25, 50, 75 y 90% de los insectos que llegan a completarlo con 8.0, 12.4, 19.1 y 28.2 días, respectivamente. Finalmente, en el capítulo 8 se pone de manifiesto que los tratamientos de suelo con el aislado EAMa 01/58-Su de M. anisopliae al control estados pre-imaginales de Bactrocera oleae Gmel. en el suelo de un olivar comercial, no tuvieron efecto sobre la abundancia y diversidad de la artropofauna edáfica del mismo. Además, los niveles de inóculo presentes en el suelo (105 CFU/g de suelo) tras la aplicación del aislado EAMa 01/58-Su, son considerados como niveles de base en la legislación europea existente y no suponen un problema en la artropofauna por considerarse aceptables. Por último, los tratamientos de suelo con este aislado de M. anisopliae y con el EABb 01/103-Su de B. bassiana, tampoco resultaron negativos para las comunidades de hormigas Tapinoma nigerrimum en laboratorio, que no se vieron afectadas ni en mortalidad, ni en tiempos medios de supervivencia, ni en la actividad de las mismas antes y después del tratamiento.

During 2005. and 2006. year, the testings of the olive plant material on the presence of olive viruses were conducted for the first time in Croatia. The samples for testing were collected from twenty five locations in commercial olive orchards, from traditional olive growing areas. All samples were teseted on presence of eight virus types: ArMV, CMV, CLRV, OLV-1, OLV-2, OLRV, OLYaV and SLRV. The results which were conducted by using of the RT-PCR method, confirmed the presence of viruses from 25% of samples, and four virus types were confirmed: OLYaV - Olive leaf yellowing-associated virus, CMV - Cucumber mosaic virus, OLV-2 - Olive latent virus 2 and SLRV – Strawberry latent ringspot virus. Presence of CMV was confirmed on Istarska bjelica and Lastovka samples, SLRV was confirmed on Levantinka and Oblica samples, OLV-2 was confirmed on Lastovka samples, OLYaV was confrimed on Bjelica, Istarska bjelica, Lastovka and Levantinka samples. Samples of Buža, Perišićeva mastrinka and Rosulja cultivars were free from tested viruses.

The insect fauna of olive is very rich, and in the Mediterranean basin alone, there are more then 60 species known to live on the olive tree. About 15-20 of them are permanent or occasional pests, and approximately 10 of those, belong to the scale insects (Pellizzari, 1997). The scale insects can devastate olive fruits and olive trees. They thrive on nearly all parts of host plants, sometimes settle under bark, and cause a variety of plant deformities. Some of them excrete large amount of honeydew and by the subsequent development of sooty mould fungi, they severely reduce photosynthesis and transpiration. They disperse passively with the aid of wind, water, soil, humans and domestic and wild animals. Global trade has been a major factor in their spread worldwide. Faunistic investigation of the scale insects of olive trees and their natural enemies in Croatia were carried out in 6 coastal counties over a 4 year period (2005 – 2008) by visual inspections of potentially infested host plants with the help of a magnifying lens of 10x magnification, collecting of host plant material infested with scale insects in plastic bags, labelling each sample with collection data, observation of field characteristics of collected specimens under the dissecting stereo microscope, slide mounting, microscopic identification on the basis of morphological characteristics according to relevant keys and marking the localities of finding according to UTM system. Inspections have resulted in 9 identified scale species, namely from family Asterolecanidae: Pollinia pollini (A. Costa, 1857) ; Coccidae: Filippia follicularis (Targioni Tozzetti, 1867), Lichtensia viburni Signoret, 1873, Saissetia oleae (Olivier, 1791) ; Diaspididae: Epidiaspis leperii (Signoret, 1869), Lepidosaphes flava (Signoret, 1870), Lepidosaphes ulmi (Linnaeus, 1758), Parlatoria oleae (Colvée, 1880) and Pseudaulacaspis pentagona (Targioni Tozzetti, 1886). Species L. flava is a newly recorded species in Croatia. Within faunistic investigation, beside scale insects on olive trees, 7 predator species from family Coccinelidae were established (Adalia decempunctata L., Chilocorus bipustulatus L., Chilocorus renipustulatus S., Coccinella septempunctata L.), Exochomus quadripusulatus L., Scymnus frontalis F. and Scymnus subvillosus G. In the body of scale insects on olive trees, 7 different parasitic wasps from superfamily Chalcidoidea were found, namely Aphytis proclia Walker, Blastothrix hungarica Erdös, Coccophagus lycimnia Walker, Coccophagus palaeolecanii Yasnosh, Metaphycus Mercet sp., Pachyneuron muscarum Linnaeus i Scutellista caerulea Fonscolombe. They belong in families Aphelinidae, Encyrtidae and Pteromalidae.