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Latex from Caricaceae contains a number of proteins believed to be part of a defense mechanism that protects these plants from wounding. Prior evidence suggests that some components in Carica papaya improve healing of ulcerous wounds in mammals. This study shows the chromatographic isolation of a protein fraction from C. candamarcensis that stimulates cell proliferation of mammalian cells by measuring MTT reduction and thymidine incorporation. The effect appears to be cell specific as L929, MDA-MB231 and BHK-21 cells are stimulated while no effect is seen on CHO cells. The maximal stimulatory effect reaches 2.2-fold 72 h after addition of the active fraction to L929, 1.8-fold in MDA-MB231 cells and 1.6-fold in BHK cells. Proteolytic inactivation of the active fraction suggests that a protein is responsible for the proliferative activity and its size is estimated between 10 and 25 kDa. A potential candidate for this function is a 23 kDa protein found in the fraction that reacts with human EGF antibody.

Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) is a pathogenic bacterium that causes caseous lymphadenitis (CLA), ulcerative lymphangitis, mastitis, and edematous to a broad spectrum of hosts, including ruminants, thereby threatening economic and dairy industries worldwide. Currently there is no effective drug or vaccine available against Cp. To identify new targets, we adopted a novel integrative strategy, which began with the prediction of the modelome (tridimensional protein structures for the proteome of an organism, generated through comparative modeling) for 15 previously sequenced C. pseudotuberculosis strains. This pan-modelomics approach identified a set of 331 conserved proteins having 95-100% intra-species sequence similarity. Next, we combined subtractive proteomics and modelomics to reveal a set of 10 Cp proteins, which may be essential for the bacteria. Of these, 4 proteins (tcsR, mtrA, nrdI, and ispH) were essential and non-host homologs (considering man, horse, cow and sheep as hosts) and satisfied all criteria of being putative targets. Additionally, we subjected these 4 proteins to virtual screening of a drug-like compound library. In all cases, molecules predicted to form favorable interactions and which showed high complementarity to the target were found among the top ranking compounds. The remaining 6 essential proteins (adk, gapA, glyA, fumC, gnd, and aspA) have homologs in the host proteomes. Their active site cavities were compared to the respective cavities in host proteins. We propose that some of these proteins can be selectively targeted using structure-based drug design approaches (SBDD). Our results facilitate the selection of C. pseudotuberculosis putative proteins for developing broad-spectrum novel drugs and vaccines. A few of the targets identified here have been validated in other microorganisms, suggesting that our modelome strategy is effective and can also be applicable to other pathogens.

A infecção por Ascaris lumbricoides decorre da ingestão de ovos embrionados deste parasita, o que justifica a pesquisa de substâncias que tenham efeito deletério sobre estes ovos. Nosso objetivo foi estudar a ação de 16 produtos detergentes e desinfetantes, de uso doméstico e laboratorial, sobre a embriogênese deste helminto. Crianças portadoras desta infecção foram tratadas com levamisol e os vermes fêmeas expelidos foram recolhidos e dissecados, para obtenção dos ovos intra-uterinos. Os ovos foram postos em contato com os produtos em diversas diluições e tempos, lavados e incubados a 28ºC, por 20 dias, para teste da viabilidade e determinação da porcentagem de embrionamento. Apenas um produto inibiu completamente o embrionamento dos ovos, em todos os tempos e diluições testados. Cinco produtos inibiram o embrionamento dos ovos em mais de 50%, seis inibiram o embrionamento em menos de 50% e três não tiveram efeito sobre o embrionamento dos ovos. Por outro lado, com um produto observou-se aumento da porcentagem de embrionamento dos ovos em relação aos controles.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Aproximadamente 60% dos pesticidas utilizados em culturas de plantas são herbicidas destinados à eliminação de plantas daninhas. A enzima ALS ou acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 2.2.1.6) é alvo de inibição por cinco classes de herbicidas e está envolvida na via de biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina). A exposição contínua desses herbicidas às culturas levou à evolução de plantas daninhas de biótipos resistentes a herbicidas. Esses biótipos apresentam geralmente resistência local-alvo, sendo documentadas mutações pontuais em várias espécies. O desenvolvimento de culturas de plantas resistentes aos herbicidas atuais (contribuindo para que apenas as plantas daninhas sejam atingidas) e o desenvolvimento de novos herbicidas se tornou extremamente necessário. Em busca por assinaturas de resistência a dois tipos de herbicidas (sulfoniluréias e imidazolinonas) em ALS, aqui atrelamos o aprendizado de máquina a dados de modelagem molecular de enzimas com a presença do inibidor, com e sem mutações. Simulações de dinâmica molecular, e outras técnicas de bioinformática estrutural foram levadas à técnicas de seleção de atributos utilizadas em aprendizado de máquina de forma a melhor discernir atributos da ALSs que separam resistentes e susceptíveis. Os resultados sugerem que o mecanismo de ganho ou não de resistência aos herbicidas com as mutações está ligado a mudanças tanto na dinâmica, rede de contatos e perfil energético no complexo proteína-ligante. Para a sulfoniluréia (SU) as alterações nestes atributos sugerem uma maior restauração da componente competitiva do inibidor na proteína em relação à imidazolinona (IMI), em consonância com a própria maior componente inibitória relatada na literatura para as SU comparado às IMI. Em enzimas com o inibidor imidazolinona, a resistência parece ter relação direta com modificações alostéricas, modificando estruturalmente a região dos cofatores. Em enzimas com o inibidor sulfonilureia o padrão de resistência sugere uma forte relação com a perda de afinidade pelo ligante. Os resultados aqui obtidos podem contribuir na elucidação de novos caminhos para a temática sustentável de plantas daninhas, culturas e herbicidas. Estes mesmos resultados também demonstram que o uso de aprendizado de máquina para encontrar padrões em meio a uma diversidade de dados retornados pela modelagem e dinâmica molecular é uma estratégia prontamente aplicável e eficaz. Approximately 60% of pesticides used on plant crops are herbicides aimed at eliminating weeds. The enzyme ALS or acetohydroxy acid synthase (AHAS; EC 2.2.1.6) is targeted for inhibition by five classes of herbicides and is involved in the pathway of branched-chain amino acid biosynthesis (valine, leucine and isoleucine). Continuous exposure of these herbicides to crops has led to the evolution of weeds of herbicide resistant biotypes. These biotypes generally present target-site resistance, with point mutations being documented in several species. The development of plant crops resistant to current herbicides (contributing to only weeds being affected) and the development of new herbicides has become extremely necessary. In search of resistance signatures to two types of herbicides (sulfonylureas and imidazolinones) in ALS, here we link machine learning to molecular modeling data of enzymes with the presence of the inhibitor, with and without mutations. Molecular dynamics simulations, and other structural bioinformatics techniques were taken to attribute selection techniques used in machine learning in order to better discern attributes of ALSs that separate resistant and susceptible. The results suggest that the mechanism of gain or not of resistance to herbicides with mutations is linked to changes in both dynamics, network of contacts and energy profile in the protein-ligand complex. For the sulfonylurea (SU), the alterations in these attributes suggest a greater restoration of the competitive component of the inhibitor in the protein in relation to imidazolinone (IMI), in line with the greater inhibitory component itself reported in the literature for the SU compared to the IMI. In enzymes with the imidazolinone inhibitor, resistance seems to have a direct relationship with allosteric modifications, structurally modifying the cofactors region. In enzymes with the sulfonylurea inhibitor, the resistance pattern suggests a strong relationship with the loss of affinity for the ligand. The results obtained here can contribute to the elucidation of new paths for the sustainable theme of weeds, crops and herbicides. These same results also demonstrate that using machine learning to find patterns amidst a diversity of data returned by modeling and molecular dynamics is a readily applicable and effective strategy

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cálculos de Perturbações de Energia Livre (Free Energy Perturbation, FEP) são, na atualidade, rotineiramente aplicados na descoberta de fármacos para estimar a energia de Gibbs relativa de ligação de pequenas moléculas a alvos biomoleculares de interesse. A aplicação de técnicas de amostragem estendida pode melhorar a correlação entre predições e dados experimentais, especialmente em sistemas com mudanças conformacionais. Devido ao grande número de perturbações necessárias em uma campanha de descoberta de fármacos, a preparação manual de cálculos de FEP não é viável. Neste trabalho, apresentamos o PyAutoFEP, uma ferramenta flexível e de código aberto para automatizar a preparação de cálculos de FEP para energia de Gibbs relativa de ligação. PyAutoFEP foi escrito em Python3 e automatiza a geração de mapas de perturbação, topologias duplas, construção de sistemas para simulações de Dinâmica molecular e análise. O PyAutoFEP suporta diversos campos de força, incorpora diferentes versões de métodos de amostragem REST2 e esquemas flexíveis de janelas de λ para representar a perturbação. Para validar a ferramenta PyAutoFEP, esta foi aplicada para uma série de 14 ligantes do receptor Farnesóide X. Este sistema fez parte do desafio para a comunidade Grand Challenge 2, organizado pelo grupo Drug Design Data Resources. Uma média de 88% de sinais corretos das predições foi observado e 75% das predições alcançaram erros menores do que 1,5 kcal/mol. Resultados utilizando os campos de força Amber03/GAFF, CHARMM36m/CGenFF e OLSA-AA/M/LigParGen obtiveram r de Pearson de 0,71 ± 0,13, 0,30 ± 0,27 e 0,66 ± 0,20, respectivamente. Os resultados utilizando o Amber03/GAFF e OPSA-AA/M/LigParGen foram comparáveis às melhores submissões originais ao Grand Challenge 2. A aplicação da REST2 melhorou os resultados utilizando o CHARMM36m/CGenFF (r de Pearson = 0,43 ± 0,21), porém pouco impacto foi observado para os outros campos de força. Finalmente, utilizando um modelo estatístico, foi estimada a probabilidade de descoberta de moléculas com potência ao menos uma unidade de 1 pKi melhor do que um protótipo hipotético, quando uma ferramenta como o PyAutoFEP é aplicada para triar 10 ou 100 análogos. As probabilidades são até 7 vezes maiores se comparadas àquela obtida usando seleção aleatória, quando 100 moléculas são triadas, indicando que o PyAutoFEP pode ser útil em problemas de otimização de protótipos. O PyAutoFEP está disponível no repositório do grupo, https://github.com/lmmpf/PyAutoFEP. Free Energy Perturbation (FEP) calculations are now routinely used in drug discovery to estimate the relative free energy of binding (RFEB) of small molecules to a biomolecular target of interest. Using enhanced sampling can improve the correlation between predictions and experimental data, especially in systems with conformational changes. Due to the large number of perturbations required in drug discovery campaigns, manual setup of FEP calculations is no longer viable. Here, we introduce PyAutoFEP, a flexible and open-source tool to aid the setup of RFEB FEP. PyAutoFEP is written in Python3, and automates the generation of perturbation maps, dual-topologies, system building and molecular dynamics (MD), and analysis. PyAutoFEP supports multiple force fields, incorporates two flavors of REST2 enhanced sampling method, and allows flexible λ values along perturbation windows. To validate PyAutoFEP, it was applied to a set of 14 Farnesoid X receptor ligands, a system included in the Drug Design Data Resource Grand Challenge 2. A mean 88% correct sign prediction was achieved, and 75% of the predictions had an error below 1.5 kcal/mol. Results using Amber03/GAFF, CHARMM36m/CGenFF, and OLSA-AA/M/LigParGen had Pearson’s r values of 0.71 ± 0.13, 0.30 ± 0.27 and 0.66 ± 0.20, respectively. The Amber03/GAFF and OLSA-AA/M/LigParGen results were on par with the top Grand Challenge 2 submissions. Applying REST2 improved the results using CHARMM36m/CGenFF (Pearson’s r = 0.43 ± 0.21), but had little impact on the other force fields. Finally, we estimated the probability of finding a molecule 1 pKi better than a lead when using PyAutoFEP to screen 10 or 100 analogs. The probabilities, when comparing to random sampling, increased up 7-fold when 100 molecules were to be screened, suggesting that PyAutoFEP would likely be useful for lead optimization. PyAutoFEP is available on GitHub at https://github.com/lmmpf/PyAutoFEP.

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais O processo de replicação do DNA é um mecanismo que deve garantir a sua fidelidade e eficiência de forma a evitar a propagação de erros no material genético e manter a integridade do mesmo. Na presença de erros no DNA, a forquilha de replicação é impedida de continuar e, consequentemente, é reconhecida por complexos proteicos que irão iniciar 2 vias de sinalização: a Síntese Translesão ou a Forquilha de Replicação Reversa. Enquanto em leveduras uma única proteína, a Rad5, reconhece a forquilha de replicação parada, em humanos esta função é desempenhada por 2 proteínas distintas, a HLTF e SHPRH. Tanto a Rad5 quanto a HLTF têm a função de estabilizar o complexo na forquilha por meio de um domínio conhecido como HIRAN. Há uma carência de estudos a respeito dos mecanismos moleculares deste domínio em interação com a ssDNA e, devido a sua importância no início da via de sinalização, hipotetiza-se que variações estruturais sejam capazes de interferir na interação do domínio HIRAN com a ssDNA. Portanto, o objetivo deste trabalho é estudar o domínio HIRAN das proteínas HLTF e Rad5 a fim de encontrar possíveis diferenças estruturais entre as mesmas que sejam relacionados com o mecanismo molecular de interação com seus alvos. Além disso, tentar correlacionar estes resultados com a necessidade em humanos da existência de uma segunda proteína no reconhecimento da forquilha parada, a SHPRH, juntamente com a HLTF, uma vez que em leveduras somente uma proteína realiza esta função. Por ser uma estrutura de difícil resolução por métodos experimentais, neste trabalho tentamos elucidar a estrutura terciária e o comportamento dinâmico do HIRAN da Rad5 por métodos de modelagem computacional. O uso da modelagem comparativa e da dinâmica molecular permitiu acesso a informações estruturais do domínio HIRAN da Rad5 e da HLTF. Os resultados encontrados demonstram que o domínio HIRAN da proteína Rad5 possui um maior grau de liberdade e apresenta desnaturação de estruturas secundárias, sendo mais instável que o domínio HIRAN da HLTF. Importante ressaltar que, quando há a presença de ssDNA, ambos os domínios se tornam mais estáveis. As regiões de flexibilidade estrutural nas estruturas terciárias estão correlacionadas, sugerindo um mecanismo similar de interação com a fita simples e indução de conformação por parte da presença do ligante. As análises dos contatos atômicos sugerem um número maior de interações eletrostáticas com os nucleotídeos, por parte do domínio da Rad5. Conclui-se que os domínios podem apresentar mecanismos moleculares similares de interação com a ssDNA e que o domínio HIRAN da Rad5 possivelmente abrange diferentes conformações da ssDNA, uma vez que contém um número maior de resíduos polares na região do sítio de interação.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A chagasina, um inibidor endógeno de cisteíno proteases de Trypanosoma cruzi, regula a atividade da protease parasitária cruzaína durante o ciclo de vida do parasita. Experimentos in vitro mostram que a chagasina também inibe a catepsina L, uma enzima homóloga humana. Enquanto a chagasina inibe ambas enzimas com potências similares, mutações nesta proteína tem diferentes efeitos na ligação para essas enzimas. Os mutantes T31A e T31A/T32A se ligam bem à catepsina L, mas a afinidade deles para a cruzaína cai de aproximadamente 40 a 140 vezes. Por outro lado, o mutante W93A mantém potência frente à cruzaína, mas perde afinidade contra a catepsina L. Neste trabalho, foram realizados estudos de modelagem comparativa e simulações de dinâmica molecular para entender a seletividade de inibição da cruzaína e catepsina L pelos mutantes da chagasina W93A, T31A e T31A/T32A. Os resultados possibilitaram obtenção de um perfil de interações não ligadas nas interfaces de cada mutante em complexo com as cisteíno proteases. Além disso, observamos diferenças na conformação de ligação dos loops L2 e L6 da chagasina do mutante W93A, favorecendo as interações com a cruzaína e reduzindo as interações com a catepsina L. Estas diferenças são associadas com uma dissociação parcial do complexo W93Acatepsina L, fornecendo uma possível causa para a seletividade do mutante W93A em relação à cruzaína. Adicionalmente, foram realizados cálculos de energia livre para avaliação do impacto de mutações na afinidade dos complexos da cruzaína e catepsina L através do método MM/GBSA. Apesar deste método ter como vantagem seu baixo custo computacional, observamos baixa correlação entre os valores de variação de energia livre de ligação preditos por MM/GBSA e os dados experimentais.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Aproximadamente três bilhões de pessoas vivem em regiões com risco de infecção por Dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV) e Yellow fever virus (YFV). Além dos casos graves de dengue, Zika exibe complicações como síndromes congênitas em fetos. Ademais, surtos de febre amarela ocorreram no Brasil em 2017, mesmo havendo vacina contra este vírus. Até o momento não há fármacos antivirais aprovados para o tratamento dessas doenças, ressaltando a necessidade de estratégias para se obter novas moléculas com atividade antiviral. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar, empregando estratégias in silico e in vitro, a atividade antiviral de substâncias em DENV, ZIKV e YFV, tendo como alvo a protease viral (NS3PRO). Estruturas tridimensionais de compostos peptideomiméticos inibidores de protease de DENV-3 foram empregadas para a geração de modelos da relação quantitativa entre a estrutura química e a atividade biológica por holograma (HQSAR) e de acoplamento molecular (docking). Paralelamente, foram preditos sítios de ligação e hotspots de ligação das proteases alvo (PDB: 3U1I e 5YOF) utilizando programas FTSite, FTMap e AutoGrid. Esses resultados foram utilizados na construção de um modelo farmacofórico para triagem virtual. Propriedades físico-químicas, presença de fragmentos estruturais e características de interações com o alvo molecular (farmacóforo) foram delimitadas na triagem. Foi realizada dinâmica molecular dos hits virtuais, bem como predições de toxicidade e atividade biológica, selecionando oito substâncias para aquisição. A validação da atividade biológica foi corroborada empregando o teste colorimétrico de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), determinando as concentrações citotóxicas (CC50), concentrações efetivas (CE50) e índices de seletividade (IS). A atividade antiviral também foi avaliada por ensaios de placas de lise, efeito de pré-tratamento e de atividade virucida das substâncias. Inicialmente, modelos de HQSAR foram construídos e validados, sendo um modelo ótimo (q2 = 0.675 e r2 = 0.873) selecionado utilizando mapas de contribuição dos fragmentos moleculares. Na estrutura da protease foi delimitada a tríade catalítica, ligantes, sítios e subsítios, sendo utilizados na construção de um modelo farmacofórico baseado no mapeamento, interpretação do modelo de HQSAR e interações observadas em estudos prévios de docking. Uma triagem virtual de aproximadamente 7.600.000 compostos foi conduzida em diversas etapas (farmacóforo, docking e dinâmica molecular), identificando oito potenciais inibidores da protease de DENV-3 (dois fármacos e seis moléculas sintéticas sob investigação). Na dinâmica molecular foram observadas interações estáveis no sítio alvo, complementadas por predições de atividade (5/8) e toxicidade favoráveis (8/8). Dentre as substâncias, uma foi ativa em ZIKV (CE50 = 11,86 ± 0,43 μM; IS = 1,42), quatro em YFV (CE50 = 4,79 ± 0,17 a 24,15 ± 1,15 μM; IS = 1,97 a 3,74), duas em DENV-2 (CE50 = 4,21 ± 0,14 e 9,51 ± 0,12 μM; IS = 2,26 e 3,16) e uma em DENV-3 (CE50 = 37,51 ± 0,8 μM; IS = 2,85). Nos ensaios de placa, as substâncias 136 e 128 reduziram cerca de 1 a 1,5 log10 do título viral (UFP/mL) de ZIKV, YFV e DENV-2. As substâncias 136 e 140 também reduziram cerca de 1 log10 do título viral de YFV nos ensaios de pré-tratamento. Posteriormente, ensaios de inibição enzimática serão realizados para confirmação do alvo planejado neste trabalho. Approximately three billion people live in regions at risk of infection by the dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV) and yellow fever virus (YFV). In addition to severe cases of dengue, Zika presents complications such as congenital syndromes in fetuses. Yellow fever outbreaks also happened in Brazil in 2017, even with a vaccine available against it. Currently, there are no licensed antivirals for the treatment of these diseases, emphasizing the need for strategies to obtain new bioactive molecules with antiviral activity. The objective of this work was to evaluate, through in vitro and in silico strategies, the antiviral activity of substances against DENV, ZIKV and YFV, targeting the viral protease (NS3PRO). Three-dimensional structures of peptidomimetic compounds inhibiting DENV-3 protease were used to generate models of the quantitative relationship between chemical structure and biological activity by holograms (HQSAR) and molecular docking. Binding sites and hotspots of protein structures (PDB: 3U1I and 5YOF) were detected using the FTSite, FTMap and AutoGrid programs. These results were used to the construction of a pharmacophoric model for virtual screening. Physical and chemical properties, presence molecular fragments and interactions with the molecular target (pharmacophore) were defined in the screening. Eight compounds were selected after molecular dynamics, as well as predictions of toxicity and biological activity. Biological activity was confirmed by the colorimetric assay of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), in order to obtain the cytotoxic (CC50) and effective (EC50) concentrations, as well as selectivity indixes (SI). The antiviral activity was also evaluated by plaque reduction, pre-treatment and virucide activity assays. Initially, HQSAR models were built and validated, with an optimal model (q2 = 0.675 and r2 = 0.873) selected using chemical contribution maps of molecular fragments. The catalytic triad, ligands and biding sites pointed at the structures were used to build a pharmacophoric model based on mapping, interpretation of the HQSAR model and interactions observed in previous fitting studies. A virtual screening of approximately 7,600,000 compounds was conducted in several stages (pharmacophore, docking and molecular dynamics), identifying eight potential inhibitors to the DENV-3 protease (two drugs and six synthetic molecules under investigation). Molecular dynamics simulations showed stable interactions at the target sites, and were complemented by favorable biological activity (5/8) and toxicity (8/8) predictions. Among the substances, one was active against ZIKV (EC50 = 11.86 ± 0.43 μM; IS = 1.42), four against YFV (EC50 = 4.79 ± 0.17 to 24.15 ± 1.15 μM; IS = 1.97 to 3.74), two against DENV- 2 (EC50 = 4.21 ± 0.14 and 9.51 ± 0.12 μM; 2.26 and 3.16) and one against DENV-3 (EC50 = 37.51 ± 0.8 μM; IS = 2.85). In plaque reduction assays, substances 136 and 128 reduced about 1.0 to 1.5 log10 of the viral titer (PFU/mL) of ZIKV, YFV and DENV-2. Substances 136 and 140 also reduced about 1.0 log10 of YFV titer in pre-treatment assays. As a perspective, enzyme inhibition assays will be carried out in order to confirm the molecular target predicted in this work.

As proteínas evoluem ao longo do tempo, devido ao acúmulo de mutações, inserções e deleções nos genes que as codificam. Posições fortemente conservadas geralmente referem-se a resíduos que são estritamente necessários para a estrutura da proteína ou para sua função. A metodologia DRCN (Decomposition of Residue Coevolution Networks) permite estudar coevolução de resíduos em famílias de proteínas. Para tanto, consiste em cinco etapas básicas: filtragem do alinhamento, cálculo de correlações, decomposição da rede, geração de arquivos de visualização auxiliares e anotação de posições por busca automática no UniProt. As cisteíno proteases são um grande e diverso grupo de enzimas que pertencem ao clã CA e à família C1 (família da papaína) e podem ser encontradas em todos os animais e reinos de plantas bem como em muitos vírus e organismos procariotas. O presente trabalho tem como objetivo analisar e discutir a importância dos resíduos correlacionados e conservados da família das cisteíno proteases a partir do alinhamento múltiplo de sequências. Para tanto utilizamos, o software PFSTATS, que emprega a metodologia DRCN. Foram encontrados 34 resíduos correlacionados dispostos em 5 comunidades de resíduos que coevoluem. A comunidade 1 é a maior comunidade, sendo formada por 22 resíduos que coevoluem tanto por questões estruturais, como por exemplo Cys22 e Cys63 e Cys56 e Cys101, que realizam pontes dissulfeto; quanto por questões funcionais, como Pro2, Phe28, Gly35 e Tyr89, que se localizam em sítios alostéricos preditos da cruzaína. A comunidade 2 é composta por 6 resíduos, dentre eles resíduos da díade catalítica, Cys25 e His162, e resíduos Gly23 e Gly65, que coevoluem por questões estruturais. As comunidades 3, 4 e 5 possuem apenas 2 resíduos cada. O resíduo Cys155 da comunidade 3 possui importância estrutural, bem como os resíduos Val13 e Lys181 (comunidade 4) e Gln51 (comunidade 5). Os resíduos da comunidade 5, Leu48 e Gln51 possuem importância funcional e o resíduo Ser55 (comunidade 3) ainda não apresenta sua função descrita na literatura. Também foram encontrados 10 resíduos que são altamente conservados evolutivamente nessa família. Enquanto alguns resíduos, incluindo os que compõem a díade catalítica (Cys25 e His162), são conservados por questões funcionais, outros o são por questões estruturais (Ser49, Gly168, Gly189 e Gly192). Proteins evolve over time, due to the accumulation of mutations, insertions and deletions in the genes that encode them. Highly conserved positions generally refer to residues that are strictly necessary for the structure of the protein or for its function. The DRCN (Decomposition of Residue Coevolution Networks) methodology allows the study of coevolution of residues in protein families. To do this, it consists of five basic steps: filtering the alignment, calculating correlations, decomposing the network, generating auxiliary visualization files and annotating positions by automatic search in UniProt. Cysteine proteases are a large and diverse group of enzymes belonging to the CA clan and the C1 family (papain family) and can be found in all animals and plant kingdoms as well as in many viruses and prokaryotes. The present work aims to analyze and discuss the importance of correlated and conserved residues of the cysteine protease family from the multiple sequence alignment. For this, we use the PFSTATS software, which employs the DRCN methodology. There were 34 correlated residues found in 5 coevoluted communities. Community 1 is the largest community, consisting of 22 residues coevolved by structural issues, such as Cys22 and Cys63 and Cys56 and Cys101, which carry disulfide bridges; as well as for functional issues, such as Pro2, Phe28, Gly35 and Tyr89, which are located in predicted allosteric sites of cruzain. Community 2 is composed of 6 residues, among them residues of the catalytic dyad, Cys25 and His162, and residues Gly23 and Gly65, which coevolve for structural reasons. Communities 3, 4 and 5 have only 2 residues each. The Cys155 residue of community 3 has structural importance, as well as residues Val13 and Lys181 (community 4) and Gln51 (community 5). The residues of community 5, Leu48 and Gln51 have functional importance and the residue Ser55 (community 3) still does not present its function described in the literature. Also 10 residues were found that are highly conserved evolutionarily in this family. While some residues, including those that make up the catalytic dyad (Cys25 and His162), are conserved for functional reasons, others are for structural reasons (Ser49, Gly168, Gly189 and Gly192).

A doença de Alzheimer é atualmente um sério problema de saúde pública e econômico oriundo do aumento da expectativa de vida da população mundial, que resulta em complicados sintomas psicológicos em portadores dessa doença e reflete em devastadores efeitos sociais aos seus amigos e familiares. Tais características resultam no redirecionamento de parte das atenções da comunidade científica para o planejamento de estratégias que buscam diminuir ou cessar tais efeitos. Uma dessas estratégias incide sobre o sistema colinérgico de neurotransmissão, buscando inibir a acetilcolinesterase e consequentemente, aumentar a concentração de acetilcolina no espaço sináptico. Isso permite que o sinal neural seja prolongado em casos de danos aos neurônios em doenças neurodegenerativas. Um inibidor natural dessa enzima, a galantamina, mostra-se especialmente promissor. Dois derivados de galantamina, a sanguinina e a licoramina, diferem quimicamente dessa, respectivamente, apenas por uma substituição metoxi-hidroxi e uma mudança de ligação sp2-sp3. Esses compostos mostram, no entanto, modificações totalmente diferentes e opostas na atividade inibitória original. A simples análise estrutural de estruturas rígidas não revela os mecanismos pelos quais tais sutis distinções químicas resultam em diferenças de afinidade tão drásticas. Aqui, usamos métodos de modelagem computacional e dinâmica molecular para melhor acessar os fatores moleculares de tais distinções. Para verificação dos efeitos cumulativos associados a tais substituições, um ligante híbrido de licoramina e sanguinina foi também modelado. Os resultados sugerem que as diferenças na mobilidade do anel não-aromático presente em licoramina (com a modificação sp2-sp3), implicam em uma maior facilidade de hidratação desse ligante em solução, além de drásticas penalidades conformacionais, vibratórias e entrópicas na ligação em comparação com galantamina. Por sua vez, a possibilidade do estabelecimento de uma rede de ligações de hidrogênio adiciona vantagens entálpicas para a ligação de sanguinina. Efeitos cumulativos das modificações estudadas são observados com as análises do ligante híbrido. Esses resultados, ao mesmo tempo que sugerem uma classificação de afinidade em consonância com a literatura, também sugerem ideias que esperamos serem úteis no planejamento mais racional de medicamentos anti-Alzheimer Alzheimer's disease is currently a serious public health and economic problem stemming from the increased life expectancy of the world's population, which results in complicated psychological symptoms in people with this disease and reflects on devastating social effects on their friends and family. These characteristics result in the redirection of part of the attention of the scientific community to the planning of strategies that seek to decrease or to cease these effects. One of these strategies focuses on the cholinergic system of neurotransmission, searching to inhibit acetylcholinesterase and consequently increase the concentration of acetylcholine in the synaptic space. This allows the neural signal to be prolonged in cases of damage to neurons in neurodegenerative diseases. A natural inhibitor of this enzyme, galantamine, is especially promising. Two galantaminics derivatives, sanguinine and lycoramine, chemically differ from this, respectively, only by a methoxy-hydroxy substitution and a sp2-sp3 binding change. These compounds, however, show very different and opposite modifications in the original inhibitory activity. The simple structural analysis of rigid structures does not reveal the mechanisms by which such subtle chemical distinctions result in such drastic affinity differences. Here, we use computational modeling and molecular dynamics methods to better access the molecular factors of such distinctions. To verify the cumulative effects associated with such substitutions, a hybrid ligand of lycoramine and sanguinine was also modeled. The results suggest that the differences in the mobility of the non-aromatic ring present in lycoramine (with the sp2-sp3 modification) imply a greater ease of hydration of this ligand in solution, in addition to drastic conformational, vibratory and entropic penalties in the binding compared to galantamine. In turn, the possibility of establishing a hydrogen-bonds network adds enthalpic advantages for sanguinine binding. Cumulative effects of the studied modifications are observed with hybrid ligand analyzes. These results, while suggesting an affinity ranking in line with the literature, also suggest ideas that we hope will be useful in more rational planning of anti-Alzheimer's drugs

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose Neglected tropical diseases (NTDs) pose a devastating obstacle to health and remain a serious impediment to poverty reduction and socioeconomic development. Of 17 diseases listed among NTDs, the leishmaniasis, including cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis, are characterized by high number of cases and high costs for the treatment, usually of low efficacy and highly toxic. Even more problematic, the investment devoted to combat to control and to develop new therapies remains limited. Nowadays, the Academy has had an important role in the fight against NTDs, contributing in the search of new therapeutic targets and in the development of lead compounds. Within this context, the present project aimed the development of a pipeline for identification of leishmanicidal compounds based on the selective inhibition of the enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH). LbDHODH acts in the de novo biosynthetic pathway of pyrimidine nucleotides, by catalysing the conversion of dihydroorotate to orotate and has been considered an important macromolecular target against proliferative and parasitic diseases. LbDHODH was successfully cloned, expressed and purified. The target enzyme was characterized by kinetic studies and its structure was solved by X-ray crystallography techniques. Inhibition assays were performed in presence of orotate, product of catalysis and natural inhibitor of DHODH. Its inhibitory potential was evaluated by the estimative of IC50 and the protein-ligand interaction was characterized by crystallographic studies. In silico and in vitro strategies were used in the search for LbDHODH inhibitors. Cross-validation studies were performed against the human homologue enzyme. Inhibitors displaying higher selectivity index were evaluated against both promastigote and amastigote forms of Leishmania braziliensis. Our work allowed the identification of a new class of compounds that display selective inhibition of LbDHODH and show leishmanicidal activity. They will be used as prototypes for the development of new generations of LbDHODH inhibitors. Moreover, our pipeline can be used to screen large number of chemical libraries as tool for the identification of different chemical entities that can contribute to the development of new therapeutic strategies for the treatment of leishmaniasis.

A doença de Chagas, uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um grave problema de saúde pública. Atualmente, cerca de dez milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas, sendo que a situação é mais crítica na América Latina, onde a doença é endêmica. A necessidade de novas alternativas terapêuticas é grande, pois os fármacos disponíveis apresentam sérias limitações, como baixa eficácia e alta toxicidade. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease essencial à sobrevivência do parasita, é considerada um importante alvo para o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de novos inibidores da enzima cruzaína empregando como modelo um composto hit (1) com propriedades anti-T. cruzi. Este inibidor competitivo (um derivado imidazólico), que apresenta elevada potência e afinidade contra a enzima alvo (IC50 = 1 µM e Ki = 120 nM, respectivamente), foi identificado em trabalhos anteriores de nosso grupo por meio da integração de técnicas computacionais (triagem virtual) e experimentais (avaliação bioquímica in vitro). A presente proposta de planejamento molecular, empregando métodos de química medicinal, levou a investigação de padrões estruturais explorando a complementaridade entre as moléculas pequenas e os resíduos de aminoácidos dos subsítios da cruzaína. Um conjunto promissor de 38 compostos foi planejado, sintetizado e avaliado em ensaios in vitro frente à enzima cruzaína e posteriormente, contra o parasita. Entre os derivados do composto hit (1), que apresentaram valores de IC50 contra a enzima alvo na faixa nano- e micromolar, destaca-se o composto 14 (IC50 = 120 nM e Ki = 20 nM), um inibidor competitivo, potente e de alta afinidade contra a enzima alvo, que também apresentou atividade in vitro e in vivo contra o parasita. A integração de métodos experimentais e computacionais foi útil no processo de otimização de inibidores inéditos da cruzaína. As relações entre a estrutura e atividade obtidas são de grande relevância para o desenvolvimento de candidatos a novos fármacos para a terapia da doença de Chagas. Chagas´ disease, an infection caused by Trypanosoma cruzi, is a serious public health problem. Currently, about ten million people are infected worldwide, and the situation is more critical in Latin America, where the disease is endemic. The need for new therapies is urgent, since the drugs available have serious limitations, such as low efficiency and high toxicity. The cruzain enzyme, an essential cysteine protease for the parasite survival is considered an important target for the development of new antichagasic agents. In this work, the goal was the development of new cruzain inhibitors based on modifications of a hit compound (1) with properties anti-T. cruzi. This competitive inhibitor (an imidazole derivative), shows high affinity and potency (IC50 = 1 µM and Ki = 120 nM, respectively), and was identified in a previous work in our group by integrating computational techniques (virtual screening) and experimental (in vitro biochemical evaluation). The proposed molecular design, employing methods of medicinal chemistry, aimed to investigate structural patterns exploiting the complementarity between small molecules and amino acid residues of the subsites of cruzain. A promising set of 38 compounds was designed, synthesized and evaluated in in vitro assays against the cruzain enzyme and subsequently against the parasite. Among the derivatives of the hit compound (1), which had IC50 values against the target enzyme in the nano- and micromolar range, the compound 14 (IC50 = 120 nM and Ki = 20 nM), a potent and high affinity competitive inhibitor against cruzain showed activity in vitro and in vivo against the parasite. This work illustrates the importance of the integration of experimental and computational methods in the optimization process of novel cruzain inhibitors. The structure-activity relationship studies revealed in this work are useful for the development of new drug candidates for the treatment of Chagas´ disease.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cruzaína é a principal cisteíno protease do Trypanosoma cruzi, sendo um alvo validado para o desenvolvimento de fármacos nesse parasito. O T. cruzi é o agente etiológico da doença Chagas, uma doença negligenciada da América Latina. O tratamento dessa doença hoje no Brasil é feito apenas com o Benznidazol, um medicamento com eficácia comprovada apenas na forma aguda da doença e que apresenta uma série de efeitos colaterais que diminuem a adesão ao tratamento. Sendo assim, o desenvolvimento de medicamentos alternativos é imprescindível e o presente trabalho se propõe a fazer uma contribuição nesse sentido. É proposta uma triagem virtual com docking molecular na busca de possíveis inibidores de cruzaína. O diferencial desse trabalho é a inclusão da ideia de seletividade já na etapa de triagem de moléculas. Isso foi incorporado ao se realizar o docking não apenas contra cruzaína, mas também contra duas enzimas homólogas em humanos, catepsinas L e B. Assim, foram selecionados oito compostos que a partir da triagem e de uma análise visual possuem o potencial de serem inibidores de cruzaína seletivos quando comparados a pelo menos uma dessas enzimas. As perspectivas desse trabalho incluem a realização de ensaios enzimáticos para determinar a atividade e a potência das moléculas contra as três enzimas, e havendo um ligante, propor modificações para melhorar sua atividade a seletividade. Cruzain is the major Trypanosoma cruzi cysteine proteinase, a validated target for drug development against this parasite. T. cruzi is the etiological agent of Chagas Disease, a pathological condition from Latin America, considered a neglected disease. Benznidazole is the medicine currently used in the treatment of this disease in Brazil. Its efficacy is proven only in the acute phase of the disease, presenting many side effects which contribute to the treatment abandonment by the patients. Therefore, it is very important to develop alternative drugs, and this work aims to contribute in this sense. To do so, a virtual screening strategy employing molecular docking was proposed to search for possible cruzain inhibitors. A differential aspect of this work was the inclusion of the selectivity idea already in the screening step. This has been incorporated by docking molecules against cruzain, but also against the human homologous enzymes cathepsin L and B. Thereby, after the virtual screening protocol and visual inspection of top scoring compounds, eight hits that might be selective for cruzain were selected. Perspectives include the evaluation of these molecules in enzymatic assays and, if a hit is confirmed, design analogues with improved activity and selectivity.

Este estudo relata a síntese, estudos in vitro e computacionais de aminoquinolinas potenciais inibidoras das enzimas cruzaína e rodesaína com possivel atividade tripanossomicida. A doença de Chagas, cujo agente etiológico é o Tripanossoma cruzi, afeta cerca de oito milhões de pessoas em todo o mundo. A tripanossomíase africana humana, cujo agente etiológico é o Tripanossoma brucei, é um grave problema de saúde pública na África. A quimioterapia atualmente disponível para estas doenças apresenta eficiência limitada e toxicidade significativa. As cisteíno proteases cruzaína e rodesaína, principais proteases do T. cruzi e T. brucei, respectivamente, são alvos farmacológicos validados. Uma série de possíveis inibidores da cruzaína e da rodesaína foram planejados com base em protótipo inibidor da cruzaína (CI50 = 2,5 M) da classe das indol-pirimidinas. As substâncias sintetizadas possuem um grupo 7-cloro-4-aminoquinolina e variações no comprimento, basicidade e substituintes das cadeias laterais foram exploradas. Dezesseis substâncias foram obtidas utilizando mótodos eficientes com rendimentos variando de 16% a 99%. Os ensaios enzimáticos demonstraram que os compostos desta série inibem a cruzaína com CI50 de até 13,2 M e a rodesaína com CI50 de até 33,3 M. O modo de inibição da substância mais potente contra a cruzaína foi determinado como competitivo. Foi avaliada também a atividade tripanossomicida da série contra formas amastigotas intracelulares de T. cruzi e a citotoxicidade sobre fibroblastos não infectados. Foram identificadas três substâncias com CI50 menor do que 50 µM, porém com baixo índice de seletividade. Estudos de ancoragem molecular utilizando estruturas cristalográficas da cruzaína e rodesaína foram realizados. Os resultados de ancoragem na cruzaína sugerem que o anel quinolínico pode ocupar o subsítio hidrofóbico S2 e a cadeia lateral, mais flexível, pode interagir com resíduos dos subsítios S3 ou S1. Estudos de dinâmica molecular foram conduzidos e sugerem que o modo de ligação da substância mais potente contra a cruzaína pode ser dissimilar ao modo de ligação de ligantes cristalográficos possuindo grupos semelhantes. Os resultados sugerem que aminoquinolinas podem ser promissoras na busca por inibidores da cruzaína e rodesaína. In this work a series of aminoquinolines, potential inhibitors of cruzain and rhodesain, was synthesized, evaluated on in vitro assays and studied by in silico methods. Chagas disease is caused by Tripanossoma cruzi and about 8 million are estimated to be infected worldwide. Human African trypanosomiasis caused by Tripanossoma brucei is a major health problem in Africa. Current drugs used in treatment of both diseases shows high toxicity and low efficacy. Cysteine proteases cruzain and rhodesain, major proteases of T. cruzi and T. brucei respectively, are validated drug targets. A series of potential inhibitors of cruzain and rhodesain was planned based on a lead indolepyrimidine cruzain inhibitor (IC50 = 2.5 M). The synthesized series contains a 7chloro-4-aminoquinoline motif and various side chain lengths and basicity was explored. Sixteen compounds were prepared employing straightforward procedures with yields from 16% to 99%. Enzymatic assays showed that this series inhibited cruzain with CI50 as low as 13,2 M and rhodesain with IC50 as low as 33,3 M. The most potent cruzain inhibitor, aminoquinoline 20b, was found to be a competitive inhibitor. The activity of the compounds was evaluated in vitro against intracellular amastigotes T. cruzi and cytotoxicity on the normal fibroblast was evaluated. Among the compounds evaluated, three of them showed an IC50 lower than 50 µM, however low selectivity indexes were found. Docking studies against crystallographic structures of cruzain and rhodesain were conducted. The results of these studies suggest that the quinoline moiety can occupy the S2 pocket while the more flexible side chain can explore either S3 or S1 pockets. In order to gain further insight on binding mode of the aminoquinoline 20b, molecular dynamics were performed. The analysis of results suggests that the binding mode of this coumpound may differ from crystallographic binding modes of ligands containg similar groups. The results as a whole show that aminoquinolines may be a promising class in further investigations of cruzain and rhodeain inhibitors.

Câncer é a denominação para um grupo de doenças devastadoras caracterizadas pelo crescimento e multiplicação descontrolados de células anormais que são capazes de invadir estruturas próximas e se espalhar por diversas regiões do organismo.Trata-se de um grande problema de saúde pública mundial, fazendo milhares de novas vítimas a cada ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), são estimados cerca de 580 mil casos novos da doença no Brasil para 2014. A presente tese de doutorado teve como foco principal a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através de triagens biológicas de compostos de origem natural e sintética, e do estudo das relações entre a estrutura e atividade (SAR). Triagens in vitro de derivados sintéticos do ácido gálico, ácido protocatecuico e guanidínicos, além de uma variedade de produtos naturais, possibilitaram a identificação de agentes inibidores da migração e proliferação de células tumorais metastáticas. Uma série de derivados sintéticos indólicos e espirocicloexadienonas, com potente efeito inibitório da migração celular, teve caracterizada a sua ação frente à proteína tubulina, alvo molecular de compostos importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. Ensaios de imunofluorescência revelaram a ação dos compostos associada a alterações do citoesqueleto celular. Também foram realizados o planejamento e a síntese de três cadeias peptídicas por meio da metodologia de síntese peptídica em fase sólida. Os resultados da avaliação biológica dos peptídeos indicaram o efeito de inibição na migração e proliferação de células tumorais de mama. Finalmente, estudos de metabolômica de duas linhagens tumorais de mama foram conduzidos através de análises de RMN do material celular cultivado. Cancer is a group of devastating diseases characterized by the abnormal growth of defective cells which invade adjacent tissues and eventually disseminate to several locations of the body. It is a major public health problem, affecting thousands of people each year. According to the brazilian National Institute of Cancer (INCA), approximately 580,000 new cases of cancer are predicted for the year of 2014 in Brazil. The main goal of this PhD thesis was the identification and development of new molecules possessing anticancer activity, through biological screenings of compounds from natural and synthetic sources, as well as the investigation of structure-activity relationships (SAR). In vitro screening of synthetic derivatives of gallic acid, protocatechuic acid and guanidines, along with a diverse set of natural products, allowed the identification of inhibitors of cellular migration and metastatic cell proliferation. A series of synthetic indolic derivatives and cyclohexanediones, having potent inhibitory activity in cellular migration, was characterized upon tubulin, an important macromolecular target for compounds such as taxol, vinblastine and colchicine. Immunofluorescence assays revealed that the compounds act by altering the cellular cytoskeleton. The design and synthesis of three polypeptides were also performed through solid phase synthesis. The biological evaluation of the peptides demonstrated their inhibition effects on the migration and proliferation of breast cancer cells. Finally, metabolomic studies of two strains of breast cancer cells were conducted by NMR analyses of cellular cultures.

Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) pertence ao grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus), é uma bactéria patogênica intracelular facultativa, gram-positiva, possui fimbrias, porém não se move, não forma capsulas e não esporula, apresenta-se nos biovares ovis e equi. O biovar equi infecta equinos e bovinos. O biovar ovis infecta principalmente rebanhos de ovinos e caprinos, sendo o agente etiológico de linfadenite caseosa (LC). Cp é prevalente em diversos países, causando significantes perdas econômicas devido à baixa qualidade de carcaças, queda na produção de carne, lã e leite. Os métodos para diagnóstico e tratamento de LC ainda não são suficientemente eficazes devido Cp apresentar baixa resposta terapêutica e habilidade em persistir no meio ambiente e no hospedeiro, sendo importante entender a biologia deste patógeno a nível sistêmico. Neste aspecto, conhecer as proteínas e suas interações é fundamental para compreender os mecanismos moleculares da célula, sendo as redes de interação proteína-proteína uma boa ferramenta para este tipo de estudo. Visando gerar a rede de interação para Cp, nos preocupamos em validar uma metodologia para a predição de interações com dados experimentais e curados disponíveis publicamente. Como resultado, além de aumentarmos a cobertura da rede, obtivemos uma área sobre a curva (AUC) entre 0,93 e 0,96, cujo ponto de corte de 0,70 representa uma especificidade de 0,95 e a uma sensibilidade de 0,90. Com a metodologia validada, foram geradas as redes de interação para nove linhagens do biovar ovis de Cp, sendo ~99% das interações mapeadas do gênero Corynebacterium e possuindo 15.495 interações conservadas entre as linhagens. Validação quanto ao menor caminho e distribuição do grau de interação sugerem que as redes preditas possuem características de redes biológicas. Adicionalmente, comparamos os valores do Coeficiente de Clusterização, Correlação e R2 contra redes geradas aleatoriamente e submetemos as redes geradas ao teste de normalidade Shapiro-Wilk. Todos os resultados demonstraram que as redes de interação preditas não possuem uma distribuição aleatória, sugerindo que as redes não foram formadas por interações espúrias, existindo uma influência biológica em sua predição. Com as redes validadas, selecionamos os primeiros 15% das proteínas com maior número de interações e identificamos 181 proteínas essenciais. Apenas a proteína DNA repair protein (RecN) não teve homologia com a base de dados de genes essenciais (DEG) e outras três tiveram homologia em apenas um organismo em DEG: Catalase (KatA), Endonuclease III (Nth) e Trigger factor (Tig), sugerindo que podem ser bons alvos para diagnóstico ou desenvolvimento de drogas. Corynebacterium pseudotuberculosis (cp) belongs to the group CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus), is a gram-positive facultative intracellular pathogenic bacterium, have fimbriae, is non-motile, do not form capsules and not sporulate, is presented in serovar ovis and equi. The serovar equi infects horses and cattle. The serovar ovis mainly infects herds of sheep and goats, and is the etiological agent of caseous lymphadenitis (CLA). Cp is prevalent in many countries, causing significant economic losses due to poor quality carcasses decrease in the production of meat, wool and milk. Methods for diagnosis and treatment of CLA are not yet effective enough due Cp have low therapeutic response and ability to persist in the environment, making it an important organism to be researched and understood the systemic level. In this regard, knowing the proteins and their interactions is crucial to understand the molecular mechanisms of the cell, being protein-protein interaction networks an important tool for this type of study. Aiming to generate the Cp interaction network, we worry about validate a methodology for the prediction of interactions with experimental and cured data publicly available. As a result, in addition to increasing the coverage of the network, we obtained an area under the curve (AUC) between 0.93 and 0.96, representing the cutoff of 0.70 a specificity of 0.95 and a sensitivity 0.90. With the validated methodology, the interaction networks were generated for nine serovar ovis Cp strains, being ~99% of interactions mapped from Corynebacterium gender, possessing 15,495 interactions conserved between strains. The shortest path and the degree interaction distribution analysis suggests the predicted networks have biological characteristics. Additionally, we compared the values of the clustering coefficient, Correlation and R2 against randomly generated networks and submit the networks generated to the Shapiro-Wilk normality test. All results show that the predicted interaction networks do not have a random distribution, suggesting the networks were not formed by spurious interactions, existing biological bias its prediction. With validated network, we selected the first 15% of the proteins with more interactions and we identified 181 essential proteins. Only the protein DNA repair protein (RecN) had no homology against database of essential genes (DEG) and other three had homology in just one DEG organism: Catalase (KatA), Endonuclease III (Nth) and trigger factor (Tig ), suggesting they may be good targets for diagnosis and drug development.

Elucidar os mecanismos envolvidos no reconhecimento molecular e quais forças contribuem para o reconhecimento é um problema central na biologia, uma vez as interações entre duas moléculas são de extrema importância para os sistemas biológicos como um todo e são difíceis de serem preditos até mesmo para pequenas moléculas.Portanto, propomos uma ferramenta que visa ser fácil e intuitiva a partir do uso de estratégias visuais para descrever os padrões e tipos de interações estabelecidas entre proteínas e seus ligantes. Para tanto, propomos nAPOLI (Analysis of PrOtein Ligand Interactions), uma ferramenta web interativa para o estudo em larga escala das interações proteína-ligante utilizando estratégias visuais e análises estatísticas. Realizamos um estudo de caso que consistiu de 73 inibidores para a proteína humana CDK2 (Ciclin-dependent kinase 2). nAPOLI mostrou ser muito útil, pois ajudou na descoberta do que era conservado em um conjunto de ligantes e quais interações foram estabelecidas com o receptor. Através da ferramenta, fomos capazes de confirmar resultados experimentais da literatura. Além disso, apesar da existência de outras ferramentas para analisar interações proteína-ligante, nenhuma delas apresenta análises estatísticas, visuais e interativas em larga escala. A ferramenta pode ser acessada em: http://www.napoli.dcc.ufmg.br/ Elucidating the mechanisms involved in the molecular recognition and which forces contribute to the recognition is a central problem in biology, since the interactions between two molecules are extremely important to biological systems as a whole and are very toilsome to be predicted even for small molecules. Therefore, we propose an easy and intuitive tool through visual strategies to depict the patterns and the types of interactions established between proteins and their ligands. In order to achieve it, we propose nAPOLI (Analysis of PrOtein Ligand Interactions), an interactive web tool to study the protein-ligand interactions in large scale by using visual strategies and statistical analysis. We performed a case study consisting of 73 inhibitors to the human protein CDK2 (Ciclin-dependent kinase 2). nAPOLI showed to be very useful as itshed some light on the problem of discovering what is conserved in a set of ligands and which interactions they establish with a receptor. Through this tool, we were able to confirm literature experimental results. Despite of the existance of other tools to analyse protein-ligand interactions, none of them present statistical, visual and interactive analysis in large scale. The tool can be accessed in: http://www.napoli.dcc.ufmg.br/

Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) é o agente etiológico de diversas doenças infecciosas e contagiosas crônicas, incluindo linfadenite caseosa (LC), linfangite ulcerativa, mastite e doença edematosa da pele e afeta um amplo número de hospedeiros. Neste trabalho, primeiramente, foi realizada a anotação gênica manual em duas linhagens de C. pseudotuberculosis utilizando a ferramenta Artêmis. A linhagem Cp162, isolado de camelo no Reino Unido e a P54B96, isolada de antílope na África do Sul, as quais tem genomas de 2.293.464 pb e 2.337.657 pb, 52,17% e 52,2% de conteúdo GC, 2002 e 2084 sequências codificadoras, 87 e 62 pseudogenes respectivamente. Ambas possuem 49 genes de tRNA e 4 operons de rRNA. Os genomas foram depositadas no banco de dados do NCBI GenBank sob os números de acesso CP003652 e CP003385, respectivamente. No segundo momento foram usados 15 genomas de C. pseudotuberculosis para um estudo em larga escala das proteínas preditas a partir destas sequências genômicas, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline. Somente as sequências de qualidade, categorizadas em muito alta, alta, boa e média a boa foram usadas a partir dos grupos classificados por MHOLline. Usando alguns scripts desenvolvido pela equipe do LGCM, foram selecionadas um conjunto de 331 proteínas conservadas, que apresentavam estruturas 3D e considerando 95-100% de similaridade entre sequências intra-espécies. Visando identificar proteínas essenciais homólogas e não homólogas aos hospedeiros humano, equino, bovino e ovino, o core-modeloma foi filtrado resultando em um conjunto final de 10 proteínas. Apenas quatro proteínas foram identificadas como essenciais e não homólogas e foram consideradas como alvos putativos para drogas e vacinas, submetidos a triagem virtual e análises de docking. Adicionalmente, entre outros, um parâmetro para avaliar a drogabilidade de todas as proteínas, também foi calculado, permitindo a predição de cavidades das proteínas. Pesquisamos as outras 6 proteínas essenciais e homólogas realizando uma análise profunda das suas estruturas (Cp e dos hospedeiros) em nível de resíduos confirmando alguns resíduos conservados nos sítios ativos com conformações diferentes ou resíduos completamente diferentes. A conservação desses resíduos foi validada através de um alinhamento múltiplo de sequências. Além disso, o papel destes alvos em diferentes vias metabólicas bacterianas, patogenicidade e virulência também foram determinados. Baseado nesses estudos, as 4 proteínas essenciais e não homólogas foram propostas como potenciais alvos para tratamento e as 6 proteínas essenciais e homólogas também podem ser utilizadas como possíveis alvos terapêuticos devido às diferenças observadas em resíduos conservados. Espera-se que os nossos dados possam ajudar na seleção de proteínas de C. pseudotuberculosis para o desenvolvimento bem sucedido de novas drogas e vacinas para uma ampla classe de hospedeiros. Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp) is the etiological agent of several infectious and contagious chronic diseases, including caseous lymphadenitis (CLA), ulcerative lymphangitis, mastitis, and edematous skin disease thus affecting a broad spectrum of animal hosts, including ruminants that cause a huge decrease in wool production and carcass quality, thus threatening economic and dairy industries worldwide. In this work, first, manual annotation was performed using Artemis: the annotation tool, for two C. pseudotuberculosis strains. For Cp162, isolated from a camel in UK and completely sequenced using the SOLiD v3 Plus NGS platform, a genome of 2,293,464 bp in size, having 52.17% GC content, 2,002 coding sequences, 4 rRNA operons, 49 tRNA genes, and 87 pseudogenes, was obtained. For strain P54B96, isolated from an antelope in South Africa and sequenced using the Ion Torrent PGM NGS platform, a genome of 2,337,657 bp in size, having 52.2% GC content, 2,084 coding sequences, 4 rRNA operons, 49 tRNA genes, and 62 pseudogenes, was obtained. They were deposited in the NCBI GenBank database under accession numbers CP003652 and CP003385, respectively. Motivated by an increasing demand for new drug and/or vaccine targets, secondly, a novel strategy using a highthroughput workflow, called MHOLline, was followed to construct the modelome (3D models) of 15 C. pseudotuberculosis strains from various hosts and countries. Only Very High, High, Good and Medium to Good quality sequences were used from MHOLline classified groups(G2). Using a locally installed BALST NCBI tool, a set of 331 conserved proteins with 3D structures was selected showing 95-100% intra-species sequence similarity. The host proteomes considered in this study were human, horse, cow and sheep. Further filtering this core-modelome for essential and non-host homologous proteins, resulted in a final set of 10 proteins. Among these, only 4 proteins were identified as essential and non-host homologous and were considered as putative drug and vaccine targets, subjected to virtual screening and docking analyses. The druggability score, a drug target prioritization parameter, among others, was also calculated for all these proteins, allowing the prediction of druggable protein cavities. We further extrapolated our research to the other 6 essential host homologous proteins. A deep structure analysis at their residue level confirmed some conserved active site residues either exhibiting different conformations or even completely different residues. A multiple sequence alignment proved the residues conservation in these targets. Further, the role of these targets in different bacterial metabolic pathways, pathogenicity and virulence were also determined. It was proposed that the 6 essential host homologous proteins might also provide an extended choice for therapeutic targets. It is expected that our data will facilitate selection of C. pseudotuberculosis proteins for successful designing of new drugs and vaccines for a broad range of hosts.

A Acetilcolinesterase (AChE) é a enzima que catalisa a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina, acarretando o término da transmissão sináptica. O uso de inibidores de AChE tem sido associado à melhora dos sintomas relacionados à Doença de Alzheimer, sendo os fármacos de primeira escolha para o tratamento dessa doença. Avanços recentes no conhecimento estrutural e funcional da AChE têm impulsionado a busca por novos inibidores mais potentes e que possam atuar em regiões vitais da enzima relacionadas ao processo patológico da doença. Entre os compostos relatados como inibidores dessa enzima, diversos são glicosídeos de arila. Dessa forma, tendo em vista a necessidade de fármacos mais eficazes para o tratamento sintomático e modificador da Doença de Alzheimer, objetivou-se nesse trabalho o planejamento racional por modelagem molecular, síntese e avaliação biológica de glicosídeos com potencial atividade inibitória da AChE. Inicialmente, foi realizada a triagem virtual por ancoragem molecular de uma série de O- e S-glicosídeos apresentando em C-6 grupos hidroxila, amino e piperidino. Doze moléculas foram selecionadas para serem sintetizadas. Para essas moléculas, foram planejadas duas rotas sintéticas. Os derivados selecionados, exceto um, foram obtidos com rendimentos que variavam entre 24 e 95%. No total, 10 substâncias inéditas foram sintetizadas e caracterizadas. De acordo com os resultados de docking, os S-glicosídeos apresentaram os menores valores de Glig entre os derivados 6-hidroxilados e a substituição do grupo hidroxila de C-6 de 3a e 3b por grupos amino e piperidino aumenta a interação do ligante com a enzima. Acetylcholinesterase (AChE) is the enzyme that catalyses the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine, terminating synaptic cholinergic transmission. The use of AChE inhibitors have been associated with the improvement of the symptoms related to Alzheimers Disease and are the first choice drugs to treat the disease. The recent advances in the knowledge of the structure and function of AChE has inspired the search for new and more potent inhibitors, capable of binding to sites of the enzyme that are crucial to the pathology of the disease. Among the compounds already described as AChE inhibitors several are aryl glycosides. Thus, in view of the great need for more effective drugs for the symptomatic treatment and as disease-modifier, the aim of the present work was the rational design using molecular modeling, the synthesis and the biological evaluation of glycosides as potential AchE inhibitors. First, the virtual screening of a series of O- and S-glycosides bearing hydroxyl, amino or piperidino group at carbon-6 was performed by molecular docking. Twelve molecules were selected for synthesis. Two synthetic routes to these molecules were devised. All the selected compounds but one were obtained in yields ranging from 24 to 95%. Ten new compounds were prepared and characterized. According to the docking studies the S-glycosides showed the lower values of DGlig among the 6-hydroxy derivatives and that the replacement of the 6-hydroxyl group by amino or piperidino group enhances the interaction of the ligand with the enzyme.

A tripanotiona redutase (TR) é uma enzima presente em tripanossomatídeos e está envolvida na redução da tripanotiona dissulfeto T[S]2 em tripanotiona ditiol T[SH], etapa essencial para manutenção de um ambiente redutor nesses parasitos e de extrema importância para sua sobrevivência. Apesar da semelhança do sistema TR-T[S]2 com o sistema glutationa redutase (GR)-glutationa presente nos seres humanos, a TR possui diferenças marcantes no seu sítio ativo que podem ser exploradas no desenvolvimento de inibidores seletivos. No presente trabalho foram planejados potenciais inibidores da TR utilizando o 2,5-bis-(4-aminometil-fenil)furano, como protótipo. A obtenção dos compostos foi realizada pela condensação aldólica entre uma cicloalcanona e diversos aldeídos, permitindo assim a realização de estudos de relação estrutura-atividade. A seletividade dos compostos foi avaliada frente às enzimas TR e GR. Avaliou-se, também, a ação dos compostos contra formas amastigotas de Trypanossoma cruzi, promastigotas de Leishmania amazonensis, além da citotoxicidade considerando fibroblastos não infectados. No ensaio com T. cruzi, cinco compostos mostraram-se ativos e seis apresentaram atividade leishmanicida considerável. O diamino 13 se destacou por apresentar atividade leishmanicida significativa (CI50 13,7 µM), baixa citotoxicidade (CI50 > 83,7 µM) e, ainda, ser capaz de inibir a atividade da TR (CI50 40,4 µM). Além de 13, dois outros compostos (1b e 5b) apresentaram uma boa correlação entre a inibição da TR e atividade leishmanicida. Entretanto, 1b e 5b foram citotóxicos para as células de fibroblastos de camundongos. Somente o derivado diazido 12 inibiu 50% da atividade da GR, demonstrando a considerável seletividade dessa classe de compostos. Paralelamente, estudos de ancoragem molecular foram realizados para avaliar o modo de interação dos ligantes com a TR. Dentre os compostos sintetizados, 13 e 7a podem ser considerados como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos leishmanicidas e tripanocidas, respectivamente. Trypanothione reductase (TR) is an enzyme found in trypanosomatids, which is involved in the reduction of trypanothione disulfide T[S]2 to the dithiol T[SH] and represents a key enzyme for the parasite antioxidant defense. Despite the similarity of the TR-T[S]2 system with its analogue glutathione-glutathione reductase (GR), there are significant differences in the active sites of these two enzymes that can be exploited in the development of selective inhibitors. In the present work, a series of the bis-(arylmethylidene) cycloalkanones was designed as potential inhibitors of TR, taking the 2,5-bis(4-aminomethylphenyl)furan as lead compound. The compounds were synthesized by aldol condensation of cycloalkanones with a variety of aldehydes, in order to establish the relationship between structure and activity. The selectivity of the compounds was tested by determining their inhibitory activity against TR and GR. The activity of the compounds was evaluated against amastigotes forms of Trypanosoma cruzi and promastigotes forms of Leishmania amazonensis. The cytotoxicity of the compounds to non-infected fibroblasts was also determined. Five compounds displayed activity against T. cruzi and six showed leishmanicidal activity. The diamine 13 exhibited significant anti-leishmanial activity (IC50 13.7 µM), low cytotoxicity (IC50 > 83.7 µM) and was also able to inhibit the TR activity (IC50 40.4 µM). Besides compound 13, two compounds (1b and 5b) showed a good correlation between enzyme inhibition and anti-leishmanial activity. However, these compounds were cytotoxic to mouse fibroblast L929 cell line. Only the diazide derivative 12 was able to inhibit GR activity by about 50%, suggesting considerable selectivity for this class of compounds. Furthermore, docking studies were performed to investigate the mode of interaction of the ligands to the TR. Among the synthesized compounds, 13 and 7a can be considered as lead candidates for the further development of new antiprotozoal agents against leishmaniasis and Chagas' disease, respectively.