Search

Current body fluid identification methods do not reveal any information about the time since deposition (TsD) of biological traces, even though determining the age of traces could be crucial for the investigative process. To determine the utility of microbial RNA markers for TsD estimation, we examined RNA sequencing data from five forensically relevant body fluids (blood, menstrual blood, saliva, semen, and vaginal secretion) over seven time points, ranging from fresh to 1.5 years. One set of samples was stored indoors while another was exposed to outdoor conditions. In outdoor samples, we observed a consistent compositional shift, occurring after 4 weeks: this shift was characterized by an overall increase in non-human eukaryotic RNA and an overall decrease in prokaryotic RNA. In depth analyses showed a high fraction of tree, grass and fungal signatures, which are characteristic for the environment the samples were exposed to. When examining the prokaryotic fraction in more detail, three bacterial phyla were found to exhibit the largest changes in abundance, namely Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. More detailed analyses at the order level were done using a Lasso regression analysis to find a predictive subset of bacterial taxa. We found 26 bacterial orders to be indicative of sample age. Indoor samples did not reveal such a clear compositional change at the domain level: eukaryotic and prokaryotic abundance remained relatively stable across the assessed time period. Nonetheless, a Lasso regression analysis identified 32 bacterial orders exhibiting clear changes over time, enabling the prediction of TsD. For both indoor and outdoor samples, a larger number (around 60%) of the bacterial orders identified as indicative of TsD are part of the Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. In summary, we found that the observed changes across time are not primarily due to changes associated with body fluid specific bacteria but mostly due to accumulation of bacteria from the environment. Orders of these environmental bacteria could be evaluated for TsD prediction, considering the location and environment of the crime scene. However, further studies are needed to verify these findings, determine the applicability across samples, replicates, donors, and other variables, and also to further assess the effect of different seasons and locations on the samples., Forensic Science International: Genetics, 53

Microorganisms in the gut are proven to affect health in multiple ways, and they have been studied extensively for the last decade. HumGut is a database containing microorganisms from the healthy human gut. The company Genetic Analysis (GA) has a GA-map dysbiosis test that aims to characterize microorganisms in the human gut to identify dysbiosis patients. This thesis provides an overview of the taxonomic and functional categorization of the human gut, gained by analyzing HumGut, and how well the GA-map spans the healthy human gut by investigating how it overlaps the database. Prodigal, Tax4FUN, and Diamond were used to acquire functional profiles for the HumGut genomes. GA-map identifies microorganisms by matching GA-map probes to the 16S sequences in their genomes. Most genomes in HumGut do not have an identified 16S sequence. Still, the results show that the GA-map spans the majority of higher taxonomic ranks in HumGut. There are both taxonomic and functional parts missed by the map. The functional space missed by the GA-map seems to be relative similar to matched functional regions. The genome categories in the HumGut collection are also evaluated in this thesis. The genomes in HumGut come from two sources: RefSeq and UHGG. Most of the UHGG genomes are Metagenome Assembled Genomes (MAGs). The findings show that MAGs may have lower quality on the 16S sequence than RefSeq-genomes, of which the latter is expected to have higher quality. The results also suggest that UHGG-genomes might have functional differences from other genomes. Det er bevist at mikroorganismer i tarmen påvirker helsen på flere måter, og det har blitt forsket mye på disse organismene det siste tiåret. HumGut er en database over mikroorganismer fra frisk human tarm. Bedriften Genetic Analysis (GA) har en GA-map dysbiose test med mål om å karakterisere mikroorganismer i human tarm for å identifisere dysbiose pasienter. Denne masteroppgaven presenterer en oversikt over human tarm gjennom taksonomisk og funksjonell kategorisering, oppnådd ved å analysere HumGut, og hvor godt GA-map spenner frisk human tarm ved å undersøke hvordan den identifiserer HumGutgenomene. Prodigal, Tax4FUN og Diamond ble brukt for å få funksjonelle profiler. GA-map identifiserer mikroorganismer ved å matche med 16S-sekvensen til genomet. De fleste HumGut-genome har ikke en identifisert 16S-sekvens. Likevel viser resultatene at GAmap dekker over de fleste høyere taksonomiske nivåene i HumGut. Det er både taksonomiske og funksjonelle regioner som ikke dekkes. De funksjonelle regionene som ikke blir dekket av GA-kartet, ser ut til å være hovedsakelig like funksjonelle regioner som blir dekket. En annen del av oppgaven er å evaluere genomkategoriene i HumGut. Genomene i HumGut kommer fra to kilder: RefSeq, som har validerte genomer, og UHGG. De fleste genomene i UHGG er Metagenom sammensatte genomer (MAGs). Funnene kan tyde på at disse genomene har lavere kvalitet på 16S sekvensene enn RefSeq-genomene, som er forventet å ha høyere kvalitet. Resultatene kan også indikere at UHGG-genomer kan ha funksjonelle forskjeller fra andre genomer. M-KB

With the abundance of sequence data and the development of effective computer algorithms, new practical applications using sequence data are possible, among the authentication of the contents of food and feed. This study aims to explore if metagenomic sequence data can be used to classify and quantify the contents of fishmeal samples. In this study the hash-based classification software Kraken2+Bracken was used to classify and quantify the contents of fishmeal samples. The study utilized simulated sequences as a best-case scenario and real DNA sequence data and assess the ability of Kraken2+Bracken to classify and quantify the contents with the measurements purity, completeness, Bray-Curtis dissimilarity and Principal component analysis. The results indicate that Kraken2+Bracken is able to classify the DNA sequence in the samples, but that the accuracy of the classifications and quantifications are dependent on the threshold and settings used, and for the samples based on real meatgenomic data, sample preparation likely affect the accuracy. Med den store mengden sekvensdata og utviklingen av effektive data algoritmer, nye praktiske anvendelser av sekvensdata er mulige, blant dem autentisering av innholdet i mat og fòr. Denne studien har som mål å utforske om metagenomisk sekvensdata kan brukes til å klassifisere og kvantifisere innholdet i fiskemel blandinger. I denne studien ble den hash-baserte klassifiserings programvaren Kraken2+Bracken som ble brukt til å klassifisere og kvantifisere innholdet i fiskemel blandinger. Studien benyttet simulert data som et ideal-tilfelle og ekte DNA sekvensdata og vurderte Kraken3+Bracken sin kvantifiserings og kvantifiseringsevne ved å bruke målene purity, completeness, Bray-Curtis ulikhet og principal component analysis. Resultatene antyder at Kraken2+Bracken er i stand til å klassifisere DNA sekvensene i blandingene, men at nøyaktigheten til klassifiseringen og kvantifiseringen er avhengig av terskelverdier og innstilingene brukt, og for blandingene basert på ekte metagenomisk data er det sannsynlig at hvordan prøvene tilberedes påvirker nøyaktigheten. M-KB

Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium, referred to as S. Typhimurium in this master`s thesis, is one of the most common pathogenic serovariants of Salmonella spp. S. Typhimurium has been isolated in a wide range of hosts from the wild fauna. These hosts are believed to be responsible for several of the human cases of Salmonella infections in Norway. The main goal of this thesis is to test the hypothesis that wild animals are a potential source of infection from S. Typhimurium among production animals in Norway. In this project a totalt of 127 S. Typhimurium isolates taken between 2001 and 2021 from wild animals, production animals and sport- and family animals were selected from the laboratory inventory at the Norwegian Veterinary Institute. The information present in the genome sequences of the S. Typhimurium isolates were examined using whole genome sequencing (WGS). WGS of pathogens is an important tool to improve the understanding of how contagious diseases spread between hosts. Due to limitations in the sequencing technology, the DNA are fragmented and only up to 300 bp are sequenced, this is then called reads. Bioinformatic tools were used for quality check a large number of the raw data from the sequencing before the original genom was attempted reconstructed using de novo SPAdes assembly. ” Multilocus Sequence Typing” (MLST) were used in further analysis to determine allele- variations based on 7 housekeeping genes, and each bacterial isolate were assigned one sequence type where ST19 and ST34 were the most common. Then the evolutionary similarity between isolates within the same ST was assessed by SNP analysis. Using phylogenetic analysis we were able to observe clusters with evolutionary similarity between wild animals and production animals, which indicates that transmission of S. Typhimurium had taken place. Based on the results from the applied dataset we found several of these cases, which gives a strong indication that wild animals can be the source of infection for S. Typhimurium among production animals in Norway. Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium, omtalt som S. Typhimurium i denne masteroppgaven, er en av de vanligste patogene serovariantene av Salmonella spp. S. Typhimurium har blitt isolert hos et bredt spekter av verter fra villfaunaen som er antatt ansvarlig for flere av de humane smittetilfellene av Salmonella i Norge. Hovedmålet med oppgaven var å teste hypotesen om at ville dyr er en potensiell smittekilde for S. Typhimurium blant produksjonsdyr i Norge. Det ble i dette prosjektet plukket ut totalt 127 S. Typhimurium isolater tatt mellom 2001 og 2021 fra ville dyr, produksjonsdyr og sport- og familiedyr fra laboratoriebeholdningen hos Veterinærinstituttet. Ved hjelp av helgenomsekvensering (WGS) ble informasjon som fantes i genomsekvensen til S. Typhimurium isolatene undersøkt. WGS av patogener er et viktig verktøy for å forbedre forståelsen av smittsomme sykdommer som sprer seg mellom verter. Begrensninger i sekvenseringsteknologien gjør at DNAet kuttes opp i kortere fragmenter, og kun korte fragmenter opp til 300 bp sekvenseres, også kalt reads. Ved hjelp av bioinformatiske verktøy ble store mengder rådata fra sekvenseringen kvalitetsjekket før det opprinnelige genomet ble forsøkt rekonstruert ved hjelp av de novo SPAdes assembly. For videre analyser ble ” Multilocus Sequence Typing” (MLST) brukt for bestemmelse av allele-variasjoner basert på 7 husholdningsgener, og hvert bakterieisolat fikk tildelt en sekvenstype der ST19 og ST34 var mest vanlige. Deretter ble evolusjonær likhet mellom isolatene innenfor samme ST vurdert ved SNP analyse. For fylogenetiske analyser ble det observert klustre med en evolusjonær likhet mellom ville dyr og produksjonsdyr som indikerer smitteoverføring. Basert på resultatene fra det brukte datasettet var det i flere tilfeller sterke indikasjoner på at ville dyr kan være smittekilden for S. Typhimurium blant produksjonsdyr i Norge. M-KB

The microbial species residing in the human gut exercise vital functions for the host. They produce different metabolites that are crucial for human wellbeing. A variety of such molecules mediate signalling along the gut-brain axis, regulate host gene expression, develop and maintain intestinal and blood-brain barriers, are involved in lipogenesis and gluconeogenesis, in addition to taking part in a wide range of other functions. A deviation in the intestinal flora composition is mechanistically linked to various health disorders, including inflammatory bowel disease (IBD), irritable bowel syndrome (IBS), type 2 diabetes, Parkinson’s and Alzheimer’s disease. Such a deviation, known as dysbiosis, represents an unbalanced composition where certain microbial groups are promoted in the expense of others. These species are considered as promising biomarkers, valuable for disease diagnosis, monitoring and treatment. Of particular interest are those markers that can additionally unveil phenotypical characteristics, such as the overall level of short-chain fatty acids (SCFA) in human gut samples. The prospect of discovering additional markers is high, considering that the content of healthy human guts worldwide is not fully characterized. The field of gut microbiota is at a stage of switching focus to clinically relevant species, particularly to their rapid detection, as a means of offering simple diagnostic solutions with increased availability and accessibility. This affords putting biological findings to practical clinical use, which is often not feasible with current species identification platforms. With the intention of filling this need, the main aim of this thesis was to develop a targeted approach for rapid gut microbiota testing based on the novel Liquid Array Diagnostics (LAD) technology. LAD is adopted to target 16S rRNA gene sites unique for specific microbial groups. Requiring only commonplace qPCR instrumentation, it can detect up to 30 distinct microbial markers in a single-tube multiplex reaction within a working day. LAD’s utility in microbiome studies was validated by testing the prevalence and abundance of 15 microbial markers in 541 samples collected from mothers and their children, as reported in Paper I. Paper II, on the other hand, describes a comprehensive human gut prokaryotic genome collection, HumGut. It was built after screening thousands of human gut metagenome samples, collected from healthy people worldwide, for the presence of any high quality publicly available prokaryote genome. The main rationale for creating it was to enable functional studies through LAD-based 16S targeting. It was demonstrated that HumGut, as a reference database, aids whole genome sequencing studies by significantly increasing the number of mapped sequencing reads, thus elevating the potential for an improved taxonomic classification. However, as it is, HumGut exhibits limited practical use for 16S rRNA gene targeted approaches like LAD. This because most of the representative genomes either lack this gene, or the quality of 16S sequences is compromised (addressed in Paper III). Nonetheless, LAD was exploited to infer a segment of human gut microbiota functionality by targeting the 16S rRNA gene. This was performed based on data retrieved from 16S rDNA sequencing and short-chain fatty acid (SCFA) measurements. LAD’s value in classifying samples with disturbed SCFA ratios (namely high propionate-to-butyrate ratio) - an indication of functional dysbiosis - is presented in Paper IV. Taken together, this thesis introduces two tools, LAD and HumGut, both pointing at the direction of simplified human gut functional analysis via gut microbial composition detection. De mikrobielle artene som bor i menneskets tarm utøver vitale funksjoner for verten. De produserer forskjellige metabolitter avgjørende for menneskers helse. En rekke av disse molekylene deltar i prosesser som signaltransduksjon langs tarm-hjerne-aksen, regulering av genekspresjon, utvikling og vedlikehold av tarm- og blod-hjerne-barrieren, lipogenese og glukoneogenese, samt en rekke andre funksjoner. Avvik i tarmflorasammensetningen kan knyttes til mange ulike sykdommer og lidelser, inkludert irritabel tarm (IBS), innflammatorisk tarmsykdom (IBD), type -2 diabetes, Parkinsons og Alzheimers sykdom. Slike avvik, kjent som dysbiose, kjennetegnes av at visse mikrobielle grupper fremmes på bekostning av andre. Disse artene har potensiale som biomarkører, og kan slik være verdifulle for sykdomsdiagnose og behandling. Spesielt lovende er biomarkører i tarm som kan knyttes opp mot phenotypiske trekk, slik som kortkjedede fettsyrer (SCFA). Det antas at enda flere slike arter vil identifiseres i fremtiden, da mikrobiota-komposisjonen i sunne tarmer ikke er fullt karakterisert globalt. Mikrobiota-feltet er nå på et stadium hvor fokuset endres fra eksplorative studier til identifisering av klinisk relevante arter. Det vil da bli spesielt viktig med metoder som muliggjør rask deteksjon, da dette vil innebære enkle diagnostiske løsninger tilgjengelig for praktisk klinisk bruk, noe som ofte ikke er gjennomførbart med dagens artsidentifikasjonsplattformer. Hovedmålet med denne oppgaven var å utvikle en målrettet tilnærming for rask tarmmikrobiotatesting basert på det nye Liquid Array Diagnostics (LAD)-prinsippet. LAD er utviklet for å identifisere sekvenser i 16S rRNA-genet som er unike for spesifikke mikrobielle markører. Metoden krever kun et vanlig qPCR-instrument og kan oppdage inntil 30 forskjellige mikrobielle markører i étt enkelt test-rør i løpet av en arbeidsdag. LADs nytteverdi i mikrobiomstudier ble validert ved å teste forekomsten av 15 mikrobielle markører i 541 prøver samlet fra mødre og deres barn, som rapportert i Artikel I. Artikel II beskriver genereringen av en omfattende prokaryot genomsamling av menneskets tarm. Den ble bygget ved å screene tusenvis av metagenom fra tarmprøver samlet inn fra friske mennesker over hele verden. Metagenomene ble screenet for tilstedeværelse av alle offentlig tilgjengelige prokaryote genom. Sekvenser av dårlig kvalitet ble fjernet mens alle andre sekvenser ble samlet i én stor referansedatabase, HumGut. Hovedmålet med å lage denne referansedatabasen var å muliggjøre LAD-baserte funksjonelle studier. Det ble vist at HumGut fungerer som et nyttig verktøy for full-genoms sekvenseringsstudier ved å øke antallet artlagte sekvenseringsavlesninger betydelig, da dette gir forbedret taksonomisk klassifisering. HumGut har imidlertid begrenset nytteverdi for 16S rRNA-baserte metoder som LAD. Dette fordi de fleste genom i samlingen enten mangler dette genet fullstendig, eller har for dårlig kvalitet på 16S-sekvensene (behandlet i Artikel III). Til tross for begrensningene knyttet til 16S rRNA-genet i HumGut, ble LAD benyttet til å utvikle en 16S rDNA-basert test for måling av menneskelig tarmmikrobiotafunksjonalitet. Dette ble utført basert på data hentet fra 16S-sekvensering og målinger av kortkjedede fettsyrer (SCFA). LADs evne til å klassifisere prøver med forstyrret SCFA-forhold (nemlig høyt propionat-tilbutyrat-forhold) - en indikasjon på funksjonell dysbiose - er presentert i Artikel IV. Til sammen presenterer denne oppgaven to verktøy, LAD og HumGut, som begge peker i retning av forenklet funksjonell analyse av menneskelig tarm via deteksjon av mikrobiell sammensetning i tarmen.

Genome annotation is a process of identifying functional elements along a genome. By correctly locating and finding the information stored within a sequence, knowledge about structural features and functional roles can be revealed. With the number of sequences doubling approximately every 18 months, there is a severe need for automatic annotation of genomes. Today there are many different annotation software tools available, however they produce far from perfect results. Here a new project, DeepGene, is presented. Using data from the RefSeq prokaryotic database we have started an effort to improve on the prokaryotic genome annotation process. This thesis presents the initial efforts of said improvement with a focus on discerning between coding and non-coding sequences using upstream sequence data from open reading frames. Using the 15 prokaryotic genomes available in the RefSeq database, upstream data was retrieved and processed into two datasets, and were then trained using several popular classification models. The performance of the models was compared with a standard annotation tool to create a general baseline for our model. The models created from the datasets show many similarities in terms of metrics. With the K-mer data having a mean precision at 0.22 and mean recall of 0.74, and the sequential data having a mean precision at 0.30 and mean recall at 0.77. Both the datasets performed worse than our standard annotation software with a mean recall and precision of, respectively, 0.83 and 0.82. As far as upstream sequences are concerned, the models managed to pull all the information available from both datasets. The initial results gave limited information in terms of classification and motif presence indicating that other attributes surrounding the genome should be looked at for a possible improvement on the annotation problem. An ideal step forward is to expand into a pipeline so that the complex false negative classifications may be explained. Genomannotering er en prosess som skal identifisere funksjonelle elementer langs et genom. Ved å finne informasjonen lagret i en sekvens kan man avsløre kunnskap rundt strukturelle og funksjonelle roller. Ettersom antall sekvenser dobler rundt hver 18. måned er det et sterkt behov for automatisk gjenkjenning av genomer. I dag er det mange tilgjengelige annoteringsverktøy, men de produserer langt fra perfekte resultater. Et nytt prosjekt ved navn DeepGene er her presentert. Ved hjelp av data fra RefSeq prokaryotiske database har vi startet et forsøk på å forbedre den prokaryotiske annoteringsprosessen. I denne oppgaven presenteres begynnelsen på forbedringen. Hovedfokuset var å skille mellom kodende og ikke-kodende sekvenser ved hjelp av sekvensdata oppstrøms for åpne leserammer. Ved å benytte seg av de 15 prokaryotiske genomene tilgjengelig i RefSeq databasen, ble oppstrømsdata hentet og prosessert til to datasett. Disse datasettene ble videre trent ved hjelp av populære klassifiseringsmodeller. Ytelsen til disse modellene ble sammenlignet med et standard annoteringsverktøy for å lage et generelt utgangspunkt til vår modell. Modellene trent av datasettet viser mange likheter når det kommer til ytelse. K-mer datasettet hadde en gjennomsnittlig presisjon på 0.22 og nøyaktighet på 0.74. Videre hadde det sekvensielle datasettet en gjennomsnittlig presisjon på 0.30 og en nøyaktighet på 0.77. Begge datasettene hadde dårligere resultater enn vårt standard annoteringsverktøy som hadde en gjennomsnittlig nøyaktighet og presisjon på henholdsvis 0.83 og 0.82. Når det kommer til oppstrømssekvenser klarer modellene å hente ut all informasjon tilgjengelig fra datasettene. Resultatene ga begrenset med informasjon når det kommer til klassifisering og motif-tilstedeværelse. Denne begrensningen indikerer at andre attributter rundt genomet bør undersøkes for en mulig forbedring rundt annoteringsproblemet. Et ideelt steg videre er å utvide modellene til en «pipeline» slik at komplekse falske negative klassifiseringer kan bli forklart. M-KB

Antibodies are of great importance as therapeutics and a prerequisite for their success is high specificity to a desired target. Some antibodies however, termed polyreactive, are able to recognize and react to a diverse range of antigens. Therapeutic antibodies have been successful in the treatment of cancers, autoimmune conditions as well as infectious diseases. The process of developing a new treatment requires a lot of resources and time. Many candidates are not approved following clinical trials, one of the negative indicators of success is polyreactivity. In silico methods that predict polyreactivity can aid in prioritizing good candidates for further development. In this work we benchmarked machine learning approaches for predicting polyreactivity, using data from the simulation framework Absolut!, with various combinations of sequence encodings and machine learning architectures. We found that polyreactivity could be predicted with close to 90% macro f1 using logistic-regression and amino acid composition. Marginal but significant improvements in macro f1 score were obtained by inclusion of positional information using logistic regression and feed-forward neural network with one hidden layer was able to achieve macro f1 of ~93%. The best logistic regression model and neural network were able to generalize to sequences that were more than 50% different to the sequences used for training the model. Further we looked into interpretability of the models and size of possible sequence motifs, suggesting that short motifs can be predictive of polyreactivity. Our results demonstrate how different approaches compare in predicting polyreactivity given large amounts of data and information on the CDRH3 sequence. As of now, experimental (in vitro) datasets containing information on polyreactivity have been limited in size. Larger datasets are being produced and in the future, we anticipate that our findings will be relevant for guiding the development of machine learning models for predicting polyreactivity. Antistoffer er av stor betydning som legemidler og en forutsetning for at de skal lykkes er høy spesifisitet til et ønsket mål. Noen antistoffer, kalt polyreaktive antistoffer, er imidlertid i stand til å gjenkjenne og reagere på flere ulike antigener. Terapeutiske antistoffer har hatt stor suksess i behandling av kreft, autoimmune sykdommer, så vel som infeksjonssykdommer. Prosessen med å utvikle en ny antistoffbehandling krever imidlertid mye ressurser og tid. Mange kandidater blir ikke godkjent etter kliniske studier og polyreaktivitet kan være en av årsakene til dette. In silico metoder som predikerer polyreaktivitet kan hjelpe til med å prioritere kandidater med større sannsynlighet for å lykkes. I dette arbeidet har vi sammenlignet maskinlærings metoder med varierende måter å fremstille sekvensdata og arkitektur for å forutsi polyreaktivitet ved hjelp av data fra en antistoff-antigen bindings simulator kalt Absolut!. Vi fant at polyreaktivitet kunne forutsies med nær 90% makro f1 score ved bruk av logistisk regresjon og aminosyresammensetning alene. Marginal men signifikant økning i f1 score ble registret når informasjon om aminosyrenes posisjon var inkludert ved bruk av logistisk regresjon. Nevrale nettverk var i stand til å oppnå makro f1 på ~93%. Den logistiske regresjonsmodellen og det beste nevrale nettverket var i stand til å generalisere til sekvenser som var mer enn 50 % forskjellige fra sekvensene som ble brukt for trening av modellen. Videre så vi på tolkbarhet av modellene og størrelsen på eventuelle sekvens motiver, og fant at korte motiver kan være prediktive for polyreaktivitet. Resultatene våre viser hvordan forskjellige tilnærminger sammenlignes for å forutsi polyreaktivitet gitt store mengder data og informasjon om CDRH3-sekvensen. Tidligere har de fleste eksperimentelle (in vitro) datasett brukt til å etterforske polyreaktivitet vært av begrenset størrelse. Det produseres nå større datasett og i fremtiden regner vi med at funnene våre vil være relevante for styre utvikling av maskinlæringsmodeller for å forutsi polyreaktivitet. M-BIAS

The gut microbiome is a source of great genetic diversity in humans and is prevalent in topics concerning human health and diseases. Today, most compositions of human gut microbiomes are estimated on 16S amplicon sequencing and shotgun sequencing data. Although 16S amplicon sequencing is cheap and fast, it does not gain a taxonomic resolution down to species level like the more costly and computationally expensive shotgun sequencing. Reduced Metagenomic Sequencing (RMS) has been suggested as an alternative method, as it has been shown to gain a taxonomic resolution down to species level and is more cost-effective per sample than shotgun sequencing. However, it requires a good reference database. The HumGut genome collection was used as a reference database in this thesis, and it contains >30 000 genomes prevalent in a healthy human gut. This thesis investigated the taxonomic resolution RMS can achieve using HumGut as a reference database. Further, a dataset from the PreventADALL-study was provided, containing human gut samples from mother-child pairs. The data was used to investigate whether a vertical transmission of Bifidobacterium could be detected in the samples. The HumGut dataset was divided into subgroups based on the genomes’ genus, as genome clustering of all genomes prove to be too computationally demanding. The genomes within most genera were able to cluster to a condition value below 10, meaning the lowest possible taxonomic resolution was obtained but with the advantage of more stable abundancy estimates which is important when investigating vertical transmission. Results indicated that the genera containing more RMS fragments per genome returned a higher taxonomic resolution, some even down to strain level, while genera with fewer RMS fragments per genome returned a lower resolution, some displaying a resolution not much lower than genus level. Bifidobacterium were of the genera that obtained a lower taxonomic resolution, resulting in a >98% reduction of genomes after genome clustering. As a result, no correlation of Bifidobacterium distribution was found between mother and child.

Several studies have shown that a bacteria’s development of resistance to an antimicrobial substance often comes with a cost related to their general fitness and adaptation to environmental changes. Further research is needed to increase the understanding on how bacteria with mutations in specific genes associated with stress tolerance, regulate their gene expression in response to stress. The excessive use of antibiotics for treatment of pathogenic infections in patients have led to an increasing number of bacteria resistant to antibiotics. As it is crucial that we find alternative treatment methods, researchers are looking into the possibility of utilizing bacterial produced bacteriocins in combination with other antimicrobials. In the search for appropriate medicine, we need a broader knowledge of the bacteria’s response mechanisms related to the treatments. Through this master’s thesis a mutant’s loss of fitness due to a resistance mutation will be examined. The study will attempt to give new inside on how a mutant of a bacterium regulates its gene expression when exposed to stress compared to the wild type within the same strain. Specific for this study, mutants within five bacterial strains with mutations connected to the function of the stress-response related gene rseP, are inspected in the laboratory. The bacteria were exposed to the bacteriocin Garvicin KS which do not use RseP as a receptor. RNA from samples of S. haemolyticus LMGT4071 will be isolated and sequenced to analyse the gene expression in wild type and mutant, with and without exposure to GarKS. The experiments with S. haemolyticus in the laboratory show that the mutant tolerates the exposure to GarKS poorer than the WT, illustrating that the development of resistance comes with a fitness cost. The transcriptome analysis show that the mutant responds to the stress by altering its gene expression to a large extent, in contrast to the WT which turns on only a few genes. Flere studier har vist at en bakteries utvikling av resistens mot et antimikrobielt stoff ofte kommer med en kostnad knyttet til deres generelle fitness og tilpasning til miljøendringer. Det er behov for videre forskning for å øke forståelsen av hvordan bakterier med mutasjoner i spesifikke gener knyttet til stresstoleranse regulerer genuttrykket sitt i respons på stress. Overdreven bruk av antibiotika for behandling av patogene infeksjoner hos pasienter har ført til at et økende antall bakterier er resistente mot antibiotika. Siden det er avgjørende at vi finner alternative behandlingsmetoder, ser forskerne på muligheten for å utnytte bakteriell produserte bacteriociner i kombinasjon med andre antimikrobielle midler. I jakten på passende medisin trenger vi bredere kunnskap om bakterienes responsmekanismer knyttet til behandlingene. Gjennom denne masteroppgaven vil en mutants tap av fitness grunnet en resistensmutasjon undersøkes. Studien vil prøve å belyse hvordan en mutant av en bakterie regulerer genuttrykket sitt når det utsettes for stress sammenlignet med villtypen innenfor samme stamme. Spesifikt for denne studien inspiseres mutanter innenfor fem bakteriestammer med mutasjoner knyttet til funksjonen til det stress-responsrelaterte genet rseP i laboratoriet. Bakteriene ble eksponert for bacteriocinet Garvicin KS som ikke bruker RseP som reseptor. RNA fra prøver av S. haemolyticus LMGT4071 vil bli isolert og sekvensert for å analysere genuttrykket i villtype og mutant, med og uten eksponering av GarKS. Forsøkene med S. haemolyticus i laboratoriet viser at mutanten tåler eksponeringen av GarKS dårligere enn villtypen, noe som illustrerer at utvikling av resistens kommer med en fitnesskostnad. Transkriptomanalysen viser at mutanten reagerer på stresset ved å endre genuttrykket sitt i stor grad, i motsetning til villtypen som kun slår på noen få gener. M-BIAS

According to the National Human Genome Research Institute the amount of genomic data generated on a yearly basis is constantly increasing. This rapid growth in genomic data has led to a subsequent surge in the demand for efficient analysis and handling of said data. Gene prediction involves identifying the areas of a DNA sequence that code for proteins, also called protein coding genes. This task falls within the scope of bioinformatics, and there has been surprisingly little development in this field of study, over the past years. Despite there being sufficient state-of-the-art gene prediction tools, there is still room for improvement in terms of efficiency and accuracy. Advances made within the field of gene prediction can, among other things, aid the medical and pharmaceutical industry, as well as impact environmental and anthropological research. Machine learning techniques such as the Random Forest classifiers and Artificial Neural Networks (ANN) have proved successful at the task of gene prediction. In this thesis one deep learning model and two other machine learning models were tested. The first model implemented was the established Random Forest classifier. When it comes to the use of ensemble methods, such as the Random Forest classifier, feature engineering is critical for the success of such models. The exploration of different feature selection and extraction techniques underpinned its relevance. It also showed that feature importance varies greatly among genomes, and revealed possibilities that can be further explored in future work. The second model tested was the ensemble method Extreme Gradient Boosting (XGBoost), which served as a good competitor to the Random Forest classifier. Finally, a Recurrent Neural Network (RNN) was implemented. RNNs are known to be good with handling sequential data, therefore it seemed like a good candidate for gene prediction. The 15 prokaryotic genomes used to train the models were extracted from the NCBI genome database. Each model was tasked with classifying sub-sequences of the genomes, called open reading frames (ORFs), as either protein coding ORFs, or non-coding ORFs. One challenge when preparing these datasets was that the number of protein coding ORFs was very small compared to the number of non-coding ORFs. Another problem encountered in the dataset was that protein coding ORFs in general are longer than non-coding ORFs, which can bias the models to simply classify long ORFs as protein coding, and short ORFs as non-coding. For these reasons, two datasets for each genome were created, taking each imbalance into account. The models were trained, tuned and tested on both datasets for all genomes, and a combination of genomes. The models were evaluated with regard to accuracy, precision and recall. The results show that all three methods have potential and attained somewhat similar performance scores. Despite the fact that both time and data were limited during model development, they still yielded promising results. Considering there are several parameters that have not yet been tuned in all models, many possibilities for further research remain. The fact that a relatively simple RNN architecture performed so well, and has no requirement for feature engineering, shows great promise for further applications in gene prediction, and possibly other fields in bioinformatics. M-DV

Utvikling av ny sekvenseringsteknologi de to siste tiårene har tillatt dypere dykk ned i de biomolekylære aspektene ved menneskets oppskrift. Hel-genom data fra flere hundre tusen mennesker er allerede tilgjengelig, men hvordan den økende mengden informasjon kan settes sammen til meningsfull funksjonell tolkning er komplisert og krever nye metoder. MikroRNA - mRNA interaksjoner utgjør et enormt genreguleringsnettverk som er vanskelig å predikere, selv for dagens beste maskinlæringsalgoritmer(1). Disse ikke-kodende elementene er involvert i omtrent alle cellulære prosesser i mennesket, primært via delvis komplementær baseparing mellom mikroRNA og mRNA, men det er mye vi ikke forstår av dette nettverkets betydning i vår biologi (2-4). Nye metoder er nødvendige for å kunne utforske genetisk variasjon i dette nettverket, som kan gi nye innblikk i hvordan genene våre reguleres. Her presenteres «The Group Diversity Ratio» (GDR) som en ny målenhet til å møte denne utfordringen. GDR kan kvantifisere evolusjonær struktur av variasjon i store mengder genomisk sekvensdata, med et resultat som kan statistisk valideres. Metoden baserer seg på å måle gruppe-struktur i et distanse-basert fylogenetisk tre av sekvensdata, for forhåndsdefinerte grupper av «blader» i treet. Gruppene representerer en egenskap som kan relateres til sekvensdataen, og det undersøkes til hvilken grad det finnes en sammenheng mellom de to. Metoden kan primært brukes til å raskt skaffe overblikk over store mengder genomisk sekvensdata, som kan gi verdifulle innblikk til videre etterforskning. For å teste metoden ble GDR brukt til å identifisere variasjon assosiert med etniske populasjoner i 3’UTR data fra «The 1000 Genomes Project» (1KGP). 1KGP var det første store prosjektet som adresserte den etniske skjevheten som nå finnes i genom-databaser, og som utgjør en god grunn til å utforske etnisk genetisk variasjon (5). I tillegg til identifikasjon av mer enn 1000 3’UTR sekvenser som inneholder signifikant etnisitet-spesifikk variasjon, viser dette studiet GDR-metodens høye potensial til å undersøke genetisk variasjon i stor skala. The emergence of new sequencing technologies over the past two decades has enabled us to dive deeper into the biomolecular aspect of the human recipe. Entire genomes from several hundred thousand people are already accessible, but how to interpretate the connections between the blueprints and the phenotypes are complicated, even for the best developed machine learning algorithms. Prediction of the microRNA-mRNA targeting network is a classic example, which is involved with gene regulation of all living cell processes. These non-coding features make up complex networks of interactions, where microRNAs primarily target 3’UTRs through partial complementary base-pairing. Thus, the challenge to investigate patterns in such large-scaled genomic sequence data requires new approaches. The Group Diversity Ratio (GDR) metric is presented here as a novel approach to aid in this challenge. The GDR quantifies genome-wide structure in large-scale sequence data with a statistically testable result. Patterns are measured for a group feature that may be related to variation in sequence samples, based on phylogenetic distance estimations. It opens opportunities to quickly gain insights into genomic regions of interests and used to guide further research. To demonstrate the use of the GDR metric, ethnicity-associated variation patterns in more than 1000 human 3’UTRs was identified with the GDR. The study set was from 1000 Genomes project, which was the first major effort to address the problem of ethnic bias in genetic studies and contained more than 2500 whole-genome sequences from 26 ethnic lineages. In addition to detecting significantly distinct 3’UTR elements for ethnic populations, the key finding of this study was the high potentials of the GDR to facilitate more high-throughput characterization of genomic sequence data. M-BIAS

The fish gut microbiota has gotten considerable attention in recent years, and the microbes harboring the intestine of fish are thought to grant the host various effects related to size, metabolism, feeding behavior, and immune response. A Mycoplasma species has been discovered as highly abundant in the salmon gut. However, the resident strain has not yet been isolated. Knowledge regarding its colonization and the impact it may have on the host is, therefore, limited. This study aimed to map the prevalence and geographical distribution of Mycoplasma in the salmon gut and discover its potential role as part of the gut microbiota. Salmon gut content was sampled for both cultivation purposes and direct DNA analyses in this project. Samples were collected from two salmon farms in Norway, Skjervøy (n = 23) and Bømlo (n = 19), and one in Chile (n = 20). A selection of Bømlo samples (n = 10) was cultivated in enriched growth medium. The prevalence of Mycoplasma at different geographical sites was investigated by analyzing the bacterial composition in the Bømlo and Chile samples using 16S rRNA gene sequencing. Moreover, selected samples from Bømlo (n = 4), Skjervøy (n = 7), and Chile (n = 1) were further processed for whole-genome shotgun sequencing to obtain genomic information of the salmon-associated Mycoplasma. Mycoplasma was found abundantly in Norwegian salmon but was not detected in Chilean salmon. Thus, in this study, we observed a geographical difference (p = 0.00023) in the mycoplasmas’ prevalence in the gut of farmed Atlantic salmon. The underlying reasons for the absence of Mycoplasma in Chilean salmon must be further investigated to explain our findings. Further, we found that the salmon-associated Mycoplasma’s DNA was most frequently classified as M. penetrans, which may suggest relatedness between these species. Whether the salmon Mycoplasma exhibits pathogenic or protective characteristics is not known. However, given the seemingly large prevalence of mycoplasmas in salmon, it is likely they exist in the gut microbiota as commensals. Further research is necessary to discover potential negative or positive impacts the salmon-associated Mycoplasma might have on the physiology and immunology of the fish. Tarmmikrobiotaen til fisk har fått auka merksemd dei siste åra, og mikroorganismane som utgjer denne har truleg innverknad på verten relatert til storleik, metabolisme, fôringsåtferd og immunrespons. Ein Mykoplasma-art har blitt oppdaga i rikelege mengder i laksetarmen. Arten er enno ikkje isolert, og det er lite kunnskap om denne bakterien si kolonisering, og om verknaden den kan ha på verten. Målet med denne studien var difor å kartlegge utbreiinga, samt den geografiske fordelinga av Mykoplasma i laksetarm, og å undersøke kva rolle denne bakterien potensielt har som del av tarmmikrobiotaen. M-BIOTEK